Влияние препаратов аллергенов из пыльцы растений на экспрессию генов транскрипционных факторов, контролирующих дифференцировку Т-хелперов, в культуре лимфоцитов здоровых людей и больных аллергическим риноконъюнктивитом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ИММУНООНКОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.322.03:616-056.43-07].015.4

М. Ф. Никонова, А. Д. Донецкова, И. В. Андреев, М. Н. Санков, О. Г. Сидорович, А. И. Мартынов, А. А. ярилин

ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ АЛЛЕРГЕНОВ ИЗ ПЫЛЬЦЫ РАСТЕНИЙ

на экспрессию генов транскрипционных факторов, контролирующих дифференцировку т-хелперов, в культуре лимфоцитов здоровых людей и больных аллергическим риноконъюнктивитом

ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, Москва (115478, г. Москва,

Каширское ш., д. 24, корп. 2)

Введение аллергенов пыльцы растений (тимофеевка, береза, полынь) в культуру мононуклеарных клеток здоровых людей оказывает регулирующее действие на экспрессию гена GATA3, кодирующего транскрипционный фактор GATA-3, ответственный за дифференцировку Th2-клеток: при исходно низком уровне экспрессия усиливалась, при исходно высоком - ослаблялась. Экспрессия генов ТВХ21 и особенно FOXP3, ответственных за дифференцировку соответственно Th1- и Т.ед-клеток под влиянием аллергенов, как правило, ослаблялась. В мононуклеарных клетках больных с обострением аллергического риноконъюнктивита, для которых характерно значительное усиление экспрессии всех трех названных факторов, под влиянием аллергенов она ослабляется. При ремиссии заболевания реакция мононуклеаров на действие аллергенов in vitro сходна с таковой мононуклеаров здоровых людей, но регулирующее действие выражено менее четко. Характер действия аллергенов на лимфоциты "аллергических" пациентов in vitro не зависит от природы аллергена, вызывающего заболевание. Аллергоиды полыни и тимофеевки не оказывают указанного действия на мононуклеарные клетки.

Ключевые слова: аллергены, пыльца растений, аллергический риноконъюнктивит, транскрипционные факторы, GATA-3

Nikonova M.F., Donetskova A.D., Andreev I.V., Sankov M.N., Sidorovich O.G., Martynov A.I., Yarilin A.A.

THE INFLUENCE OF ALLERGEN PREPARATIONS FROM PLANT POLLEN ON THE EXPRESSION OF THE GENES OF THE TRANSCRIPTION FACTORS CONTROLLING DIFFERENTIATION OF T-HELPERS IN A CULTURE OF LYMPHOCYTES FROM THE HEALTHY SUBJECTS AND THE PATIENTS PRESENTING WITH ALLERGIC RHINOCONJUNCTIVITIS

The introduction of allergenic preparations from plant pollen (timothy grass, birch tree, wormwood) into a culture of mononuclear cells from the healthy subjects revealed its regulatory action of the expression of the GATA3 gene encoding for the GATA-3 transcription factor responsible for the differentiation of Th2-cells. Specifically, the initially low level of pollen allergens was associated with the enhanced intensity of GATA3 expression whereas it was reduced at their high levels. The pollen allergens as a rule suppressed the expression of TBX21 and especially FOXP3 genes controlling the differentiation of Th1- and Treg-cells respectively. The mononuclear cells from the patients presenting with exacerbation of allergic rhinoconjunctivitis were characterized by the significantly enhanced expression of all the three above genes; it decreased under the action of pollen allergens. The reaction of mononuclear cells to these allergens in vitro in the period of remission of the disease was similar to that observed in healthy subjects but their regulatory action was less pronounced. It is concluded that the in vitro action of pollen allergens on lymphocytes from the patients presenting with allergic diseases is unrelated to the nature of the allergen that caused a given pathology. Allergoids of timothy grass and wormwood do not affect mononuclear cells.

Key words: allergens, plant pollen, allergic rhinoconjunctivitis, transcription factors, GATA-3

В развитии иммунных процессов по аллергическому типу главную роль отводят в том числе несбалансированному усилению дифференцировки Т-хелперов в направлении ^2-клеток. В свою очередь эта диффе-ренцировка определяется преобладанием экспрессии транскрипционного фактора GATA-3 и ослаблением экспрессии факторов с оппозитными эффектами -T-bet и FOXP3, контролирующих дифференцировку соответственно Th1- и T -клеток [41. Уровень синтеза названных факторов детерминируется экспрессией генов - соответственно GATA3, ТВХ21 и FOXP3. Соотношение экспрессии этих генов (а также гена RORC,

Ярилин Александр Александрович - д-р мед. наук, проф., тел. 8(499)617-79-19

который детерминирует фактор RORc и определяет дифференцировку ТЫ7-клеток) зависит от сигналов, поступающих в клетку из микроокружения, прежде всего через цитокиновые рецепторы, а также от природы антигенного сигнала, воспринимаемого анти-генраспознающим рецептором TCR.

Исходя из особенностей иммуногенности аллергенов (их способности индуцировать аллергический иммунный ответ), а также из наших данных о способности аллергенов пыльцы растений усиливать секрецию активированными Т-хелперами интерлейкин (IL)-4, мы предположили, что аллергенам уже на уровне взаимодействия с клеткой свойственно индуцировать экспрессию генов, способствующих диф-ференцировке Т-лимфоцитов в ^2-клетки. Если это

- 45 -

ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012

так, то простое инкубирование с аллергенами должно усилить экспрессию GATA3 и, возможно, ослабить экспрессию генов ТВХ21 и FOXP3.

В данной работе представлены результаты проверки этого предположения.

Материалы и методы. Действие аллергенов оценивали в культуре клеток здоровых людей и больных аллергическим риноконъюнктивитом (пыльцевая сенсибилизация в стадиях рецидива и ремиссии). Аллергены выделяли из пыльцы березы, тимофеевки и полыни методом водно-солевой экстракции. Полученные препараты были гетерогенными: по данным электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (по Лэмли) в экстракте березы идентифицировали 8 белков мол. массой от 14 до 70 кДа. Для получения аллергоида экстракты обрабатывали 1% раствором формальдегида. Активность аллергенов испытывали в трех концентрациях (в отдельных случаях в двух или пяти концентрациях).

Выделение мононуклеаров и культивирование клеток осуществляли в соответствии с общепринятыми методами. Аллергены вводили в культуры в момент начала культивирования; в контроле в культуры вводили соответствующий объем среды. Длительность культивирования составила 18 ч, после чего клетки осаждали и из них экстрагировали РНК, которую исследовали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Методы экстракции РНК и постановки ПЦР в реальном времени описаны ранее [3]. Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК» («ДНК-Технология»), РНК выделяли из 5 • 105 клеток. Объем полученного экстракта РНК составил 25 мкл. С помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией определяли экспрессию мРНК GATA3, ТВХ21, RORC и FOXP3. Для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР использовали набор TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit («Applied Biosystems»), относительное количество исследуемых РНК рассчитывали с помощью сравнительного метода (метод ACt). Уровень экспрессии мРНК исследуемых генов определяли относительно экспрессии мРНК микроглобулина по формуле:

9-да — -v(Ct - Ct o )

L — Z ген Х В2М ,

где Ct - номер порогового цикла; B2M - ген Р2-микрогло-булина; Х - исследуемый ген.

Для сопоставления экспрессии генов при действии аллергенов относительно их экспрессии в контроле использовали формулу:

2-AACt = 2-[(Ct Кв2М - Ct Ob2m) - (Ct Kre„ x - Ct O™, х)]

где, помимо представленных выше обозначений, К - контроль, О - опыт.

Результаты исследования статистически обрабатывали, применяя методы непараметрического анализа. Результаты выражали в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей. Значимость различий между группами оценивали с помощью Н-критерия Манна-Уитни. Различие групп признавали статистически значимым при р < 0,05. Обработку данных проводили в программном пакете StatSoft Statistica.

Результаты и обсуждение. Исследование проводили по следующей схеме. Мононуклеары, выделенные из крови здоровых людей или больных аллергическим риноконъюнктивитом, помещали в кратковременную (18-часовую) культуру в присутствии различных концентраций аллергенов пыльцы тимофеевки, березы или полыни, а также аллергоидов тимофеевки и полыни. После этого клетки извлекали, из них экстрагировали РНК и после обратной транскрипции оценивали экспрессию изучаемых мРНК (т. е. соответствующих генов) методом ПЦР в реальном времени. Рабочие концентрации аллергенов выбирали

в предварительных опытах, в которых тестировали широкий спектр их концентраций (от 0,1 до 1000 нг/мл). В случае аллергенов березы и полыни, а также аллер-гоида полыни в дальнейшем использовали концентрации 10 и 100 нг/мл, в случае аллергена и аллергоида тимофеевки - 100 и 1000 нг/мл.

Известно, что во фракции мононуклеаров крови изучаемые факторы экспрессируются только в соответствующих субпопуляциях Т-хелперов (за исключением GATA-3, который на низком уровне экспрессируется во всех Т-клетках [4, 5]). В связи с этим было важно, чтобы содержание Т-лимфоцитов, и в частности CD4+Т-клеток, существенно не варьировало в изучаемых образцах крови. Количество CD4+CD3+ Т-клеток в образцах крови здоровых людей и больных составило от 33 до 56% и не коррелировало с уровнем экспрессии исследованных генов, включая ген GATA3.

При исследовании влияния аллергенов на экспрессию генов транскрипционных факторов получили достаточно противоречивую информацию, что частично обусловлено значительной вариабельностью результатов (табл. 1). Тем не менее при действии на экспрессию GATA3 и ТВХ21 преобладал стимулирующий эффект, а при действии на экспрессию FOXP3 - ингибирующий. Действие разных аллергенов на экспрессию RORC оказалось разнонаправленным. Статистически достоверным было только подавление экспрессии FOXP3 под влиянием аллергена тимофеевки. Достаточно четкая информация относительно влияния аллергенов на экспрессию гена GATA3 получена лишь с учетом исходного уровня экспрессии гена. При этом выяснили, что при исходно высокой (выше среднего уровня) экспрессии GATA3 все три аллергена неизменно оказывают ингибирующее действие, тогда как при исходно низкой они усиливали экспрессию GATA3 или не влияли на нее. Все эффекты, кроме ингибирующего действия аллергена тимофеевки, статистически значимы. Эффект аллергенов в отношении экспрессии других генов не зависел от ее исходного уровня. Действие аллергоидов обычно было нейтральным (т. е. эффект отсутствовал) и также не зависело от исходной экспрессии генов. Результаты отражены в

Низкий К (тимофеевка) Низкий К (береза) Низкий К (полынь) Высокий К (тимофеевка) Высокий К (береза) Высокий К(полынь)

Зависимость изменений экспрессии генов транскрипционных факторов под влиянием аллергенов в клетках здоровых людей от их уровня в контроле.

1 - без аллергенов; 2 - с аллергенами. По оси ординат - показатель 2-ACt.

Низкий К, Высокий К - соответственно экспрессия генов в контроле выше и ниже средней по группе.

- 46 -

ИММУНООНКОЛОГИЯ

Таблица 1

Характер изменений экспрессии гена GATA3 под влиянием инкубации клеток здоровых людей с аллергенами в зависимости от исходного уровня экспрессии

Контроль (значения 2 ACt) Аллерген тимофеевки Аллерген березы Аллерген полыни Аллергоид полыни

т = 4 т = 4 т = 4 т = 4

Низкий (ниже 1,5 • 10-3) 6/6 0 0 5/5 0 0 5/6 1/6 0 0 1/1 0

Высокий (1,5 • 10-3 и выше) 0 2/4 2/4 0 1/4 3/4 0 1/3 2/3 0 1/1 0

Примечание. Здесь и в табл. 3: т и 4 - соответственно усиление и ослабление экспрессии генов более чем в 2 раза.

Таблица 2

Изменения экспрессии генов транскрипционных факторов (показатель 2-AACt) относительно контроля под влиянием инкубации клеток здоровых людей с аллергенами в зависимости от исходного уровня экспрессии

Ген Уровень экспрессии в контроле, 2'ACt Тимофеевка Береза Полынь

GATA3 низкий (ниже 1,5 • 10-3); n = 6 4,01 (3,35-19,66)* 7,76 (2,85-19,71)* 4,53 (2,56-6,50)*

высокий (1,5 • 10-3 и выше); n = 4 0,71 (0,35-1,12) 0,41 (0,32-0,73)* 0,40 (0,29-0,92)*

ТВХ21; n = 5 1,57 (0,15-1,92) 1,31 (0,71-1,43) 1,36 (0,57-2,94)

RORC; n = 2 0,91 1,24 0,61

FOXP3; n = 5 0,28 (0,12-0,73)* 0,87 (0,46-3,01) 0,87 (0,28-3,01)

Примечание. Здесь и в табл. 4: * - p < 0,05.

табл. 1 и 2 и на рисунке. Таким образом, аллергены оказывали регулирующее действие на экспрессию GATA3 и достаточно закономерно ингибировали экспрессию FOXP3; аллергоиды, как правило, не оказывали влияния на экспрессию генов транскрипционных факторов.

При изучении влияния аллергенов на экспрессию этих генов в клетках, полученных от аллергических больных (аллергический риноконъюнктивит), мы хотели установить, проявляются ли в этом случае те же закономерности. Полученный ответ в целом оказался положительным.

При этом фактом первостепенной важности стало то, что при аллергических заболеваниях существенно меняется спектр экспрессии изучаемых генов [1, 2]. Так, при остром аллергическом риноконъюнктивите значительно усилена экспрессия трех (GATA3, TBX21 и FOXP3) из четырех генов, а в период ремиссии их экспрессия снижается, приближаясь к норме (несколько повышенной остается экспрессия ТВХ21).

Соответственно в опытах in vitro аллерген тимофеевки ослабил экспрессию GATA3 во всех образцах, а два других аллергена в большинстве случаев также ослабили экспрессию, а реже вовсе не оказывали на нее влияния (табл. 3). Подавляющий эффект преобладал и в отношении экспрессии других генов транскрипционных факторов и в большинстве случаев был статистически значим (табл. 4). Спектр пыльцевых аллергенов, к которым были сенсибилизированы больные, не влиял на характер и интенсивность от-

вета in vitro.

В культурах клеток от аллергических пациентов в период ремиссии эффекты экстрактов аллергенов были сходны с таковыми в культуре клеток здоровых лиц, но выражены менее четко. Чаще, чем в культурах клеток здоровых людей, эффект аллергенов отсутствовал; в отдельных случаях при высоком исходном уровне GATA3 наблюдали дополнительное усиление, а при исходно низком - снижение (см. табл. 3). При действии препарата аллергена полыни на экспрессию GATA3 какая-либо закономерность указанного рода практически отсутствовала, а в действии аллергена и аллергоида полыни уже не проявлялось то четкое различие, какое наблюдали в культуре клеток здоровых людей. Отсутствовали статистически значимые эффекты аллергенов также в отношении экспрессии генов других транскрипционных факторов (см. табл. 4). Реакция монононуклеаров крови больных в период ремиссии, как и при обострении, не зависела от того, были ли они сенсибилизированы тестируемыми аллергенами.

Таким образом, в культуре клеток аллергиков, как и в культуре мононуклеаров крови здоровых людей, эффект экстрактов пыльцевых аллергенов по крайней мере в отношении экспрессии гена GATA3 определяется ее исходным уровнем; в связи с этим в культуре клеток пациентов с острым аллергическим риноконъ-юнктивитом закономерно преобладает подавление экспрессии указанного гена (а также генов ТВХ21 и FOXP3), причем тип аллергена, к которому были сен-

Таблица 3

Характер изменений экспрессии гена GATA3 под влиянием инкубации клеток больных аллергическим риноконъюнктивитом с аллергенами в зависимости от исходного уровня экспрессии

Контроль (значения 2 ACt) Аллеген тимофеевки Аллерген березы Аллерген полыни Аллергоид полыни

т = 4 т = 4 т = 4 т = 4

Рецидив (1,5 • 10-3 и выше) 0 0 3/3 0 2/3 1/3 0 1/3 2/3 0 2/3 1/3

Ремиссия (ниже 1,5 • 10-3) 4/6 1/6 1/6 3/5 1/5 1/5 1/5 1/5 3/5 1/4 2/4 1/4

Ремиссия (1,5 • 10-3 и выше) 1/9 4/9 4/9 0 4/7 3/7 2/8 3/8 3/8 0 5/8 3/8

- 47 -

ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012

Таблица 4 Изменения экспрессии генов транскрипционных факторов (показатель 2-AACt) относительно контроля под влиянием инкубации клеток больных аллергическим риноконъюнктивитом с аллергенами в зависимости от исходного уровня экспрессии

Ген Форма аллергического риноконъюнктивита Уровень экспрессии в контроле, 2'ACt Тимофеевка Береза Полынь

GATA3 Обострение Высокий (выше 1,5 • 10-3); n = 3 0,48 (0,04-0,49)* 0,96 (0,07-1,14) 0,45 (0,04-0,71)*

Ремиссия Низкий (ниже 1,5 • 10-3); n = 6 4,06 (3,50-5,43)* 4,42 (0,37-4,63)* 0,27 (0,16-0,56)*

Высокий (1,5 • 10-3 и выше); n = 4 0,45 (0,30-0,56)* 0,58 (0,22-1,01) 0,71 (0,24-5,27)

ТВХ21 Обострение 0,64 (0,02-1,17) 0,63 (0,03-0,89) 0,45 (0,05-1,28)*

Ремиссия 1,1 (0,52-1,52) 0,51 (0,21-2,15) 0,76 (0,22-1,43)

RORC Обострение 0,45 (0,01-0,66)* 0,38 (0,01-0,42)* 0,35 (0,01-1,98)*

Ремиссия 0,68 (0,44-1,18) 1,05 (0,29-2,23) 0,66 (0,42-1,06)

FOXP3 Обострение 0,45 (0,01-0,66)* 0,38 (0,01-0,42)* 0,35 (0,01-1,98)*

Ремиссия 0,68 (0,44-1,18) 1,05 (0,29-2,23) 0,66 (0,42-1,06)

сибилизированы больные, не влиял на эффект экстрактов разных аллергенов.

Подчеркнем, что у нас нет никаких строгих оснований связывать описанные эффекты с действием самого аллергена, а не примесей, содержащихся в экстракте. Тем не менее данные заслуживают внимания хотя бы потому, что активные примеси, содержащиеся в экстракте, могут влиять на эффект аллергена in vivo, выступая, например, в качестве кофакторов.

Регистрация действия аллергенов на лимфоциты в кратковременной культуре in vitro естественно порождает вопрос о природе восприятия эффекта аллергенов, точнее, о природе их рецепции. Вариант с передачей сигнала от аллергенов через Т-клеточный рецептор (TCR) должен быть отклонен в связи с крайней редкостью клонов, специфически распознающих конкретные аллергены (у несенсибилизированных лиц - 1 на 10-5 - 10-7) и отсутствием связи эффекта экстрактов со специфичностью сенсибилизации больных. К тому же такая сигнализация едва ли успела бы реализоваться в биологический эффект в 18-часовой культуре мононуклеаров. Кроме того, при моделировании ответа Т-клеток на антиген путем воздействия на них комбинации моноклональных антител к CD3 и CD28 регистрируется совсем иное влияние на экспрессию изученных генов [1]. Должно быть отвергнуто также объяснение, связанное с обычным механизмом проявления действия аллергена на тучные клетки - через взаимодействие с IgE-антителами, фиксированными на FcsRI-рецепторах, в связи с отсутствием тучных клеток во фракции мононуклеаров, а также в связи с тем, что в работе использованы клетки несенсибилизированных людей. Представляется более вероятным, что аллергены передают сигнал через некие рецепторы, более широко представленные на клетках крови, например паттерн-распознающие рецепторы. Но это порождает ряд вопросов, на которые пока нет ответа. Можно ли представить наличие неких рецепторов, общих для любых или по крайней мере для растительных аллергенов (a priori их существование маловероятно, хотя и теоретически возможно)? На каких клетках могут локализоваться рецепторы,

передающие неспецифический сигнал от аллергенов - на лимфоцитах или вспомогательных клетках, например дендритных? Какую роль играют подобные рецепторы и реакции типа описанных в данной статье при ответе на аллергены in vivo и играют ли эти процессы патогенетическую роль при аллергии?

При дальнейшем анализе феномена, помимо изучения активности чистых аллергенов, будет исследовано влияние препаратов аллергенов на клетки больных, сенсибилизированных к данному аллергену или посторонним аллергенам. Кроме того, помимо оценки экспрессии генов, эффект будет регистрироваться (методом проточной цитометрии) по синтезу белковых продуктов - транскрипционных факторов, что позволит охарактеризовать тип клеток, реагирующих на аллерген. В настоящее время это представляется возможным в отношении двух транскрипционных факторов - GATA-3 и FOXP3 (именно тех, экспрессия которых изменялась под влиянием аллергенов наиболее характерным образом), поскольку для их определения доступны коммерческие моноклональные антитела.

ЛИТЕРАТУРА

1. Никонова М. Ф., Донецкова А. Д., Шарова Н. И., Ярилин А. А. Экспрессия генов транскрипционных факторов, контролирующих дифференцировку CD4+ Т-клеток при аллергопатологии // Физиол. и патол. иммун. сист. - 2010. - № 9. - С. 7-13.

2. Никонова М. Ф., Донецкова А. Д., Сидорович О. И. и др. Особенности экспрессии генов транскрипционных факторов, контролирующих дифференцировку адаптивных субпопуляций CD4+ Т-лимфоцитов, при аллергии // Иммунология. - 2011. - Т. 32, № 4. - С. 189-192.

3. Трофимов Д. Ю., Бурменская О. В., Донецкова А. Д. и др. Разработка тест-системы для определения уровня экспрессии мРНК FOXP3 на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени // Иммунология. - 2008. - Т. 29, № 3. - С. 182-187.

4. Ярилин А. А. Транскрипционные регуляторы дифференци-ровки Т-хелперов // Иммунология. - 2010. - Т. 31, № 3. - С. 152-166.

5. Но I. C., Pai S. Y. GATA-3 - not just for Th2 cells anymore // Cell. Mol. Immunol. - 2007. - Vol. 4. - P. 15-29.

Поступила 30.09.11

- 48 -