CC BY
87
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012
грузки снижают концентрацию антител к S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. enteritidis, S. typhimurium, S. flexneri.
ЛИТЕРАТУРА
1. Домарадский И. В. Проблемы перекрестного иммунитета. -М., 1973.
2. Зильбер Л. А. Основы иммунологии. - М., 1958.
3. Романов В. А. Механизм образования нормальных антител и плазмоклеточная реакция у животных. Сообщение 2. Иммунологический ответ крольчат на пероральное введение антигена // Журн. микробиол. - 1967. - № 3. - С. 134-135.
4. Романов В. А. Механизм образования нормальных антител и плазмоклеточная реакция у животных. Сообщение 1 // Журн. микробиол. - 1967. - № 7. - С. 122-125.
5. Романов В. А. Антитела в гамма-глобулинах человека: Авто-реф. дис. ... канд. мед. наук. - Воронеж, 1967.
6. Романов В. А., Кулибин А. Ю., Зайцева И. П. Антибактериальные антитела в иммуноглобулинах и сыворотках крови человека: взгляд из настоящего в прошлое // Журн. микробиол. - 2010. - № 5. - С. 40-43.
7. Batory G., Redei A. Natural antibody level in old age // Aktuelle Gerontol. - 1978. - Vol. 8, N 2. - P. 85-91.
8. Casali P., Schettino E. W. Structure and function of natural antibodies // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1996. - Vol. 210. - P. 167-179.
9. Demeter J., Bohm U., Paloczi K. et al. Immunoglobulin profiles and antibacterial antibody levels in 50 patients a long time after posttraumatic splenectomy // J. Clin. Lab. Immunol. - 1990. -Vol. 33, N 1. - P. 7-9.
10. MalkamakiM. Anibodies to the enterobacterial common antigen: standardization of the passive hemagglutination test and levels in normal human sera // J. Clin. Microbiol. - 1981. - Vol. 13, N 6. - P. 1074-1079.
11. Zhou Z. H., Tzioufas A. G., Notkins A. L. Properties and function of polyreactive antibodies and polyreactive antigen-binding B cells // J. Autoimmun. - 2007. - Vol. 29, N 4. - P. 219-228.
12. Zhou Z. H., Zhang Y., Hu Y. F. et al. The broad antibacterial activity of the natural antibody repertoire is due to polyreactive antibodies // Cell Host Microbe. - 2007. - Vol. 15, N 1. - P. 51-61.
Поступила 16.06.11
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.322.03:616-056.43].015.4
М. Ф. Никонова, А. М. Донецкова, И. В. Андреев, М. Н. Санков, А. И. Мартынов,
С. л. Яатышев, А. А. ярилин
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРЕПАРАТОВ АЛЛЕРГЕНОВ ИЗ ПЫЛЬЦЫ
растений в культуре лимфоцитов человека
ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России (117478, г Москва, Каширское ш., 24, корп. 1)
Изучали влияние препаратов аллергенов пыльцы тимофеевки, березы и полыни на фундаментальные клеточные процессы - активацию, пролиферацию, апоптоз и секрецию цитокинов. Объектом действия аллергенов служили мононуклеары периферической крови человека; в отдельных случаях учитывали действие аллергенов на Т-лимфоциты. Не выявили влияния исследованных препаратов аллергенов в широком диапазоне концентраций (от 0,1 до 1000 нг/мл) на выживаемость клеток, их спонтанную и индуцированную активацию и пролиферацию. Экстракты аллергенов не оказывают влияния на секрецию цитокинов нестимулированными клетками. Все три испытанных препарата аллергенов, но не аллергоида пыльцы тимофеевки, усиливают секрецию интерлейкина (IL)-2 и IL-4 лимфоцитами, стимулированными форболмиристатацетатом и иономицином. Аналогичное действие экстракта аллергена тимофеевки на секрецию интерферона-Y зарегистрировали лишь при высокой дозе препарата. Подчеркивается биологическая значимость способности аллергенов усиливать выработку Т1т2-цитокина IL-4.
Ключевые слова: аллергены, цитокины, активация, пролиферация, апоптоз
Nikonova M.F., Donetskova A.M., Andreev I.V., Sankov M.N., Martynov A.I., Latischev S. L., Yarilin A.A.
The biological action of allergen preparations from the plant pollen in the culture of human lymphocytes The objective of the present work was to study the action of allergen preparations based on the timothy grass, birch, and wormwood pollen on the fundamental cellular processes, such as activation, proliferation, apoptosis, and secretion of cytokines. The allergens were incubated with mononuclear cells from human peripheral blood; certain experiments were designed to estimate the action of allergens on T-lymphocytes. None of the preparations used in a broad dose range (from 0.1 to 1000 ng/ml) had an appreciable effect on the cell viability, their spontaneous or induced activation and proliferation. The extracts of allergens did not change cytokine secretion by the unstimulated cells. All the three allergen preparations, unlike allergoid from the timothy grass pollen, increased secretion of IL-2 and IL-4 by the lymphocytes stimulated by phorbol myristate acetate and ionomycin. A similar stimulatory effect of timothy grass allergen on the secretion of interferon-gamma was apparent only at its high dose. The authors emphasize biological significance of the ability of allergens to enhance the production of Th2-cytokine and IL-4.
Key words: allergens, cytokines, activation, proliferation, apoptosis
Ярилин Александр Александрович - д-р мед. наук, проф., тел. 8(499) 617-79-19
- 86 -
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
Аллергены занимают особое положение среди антигенов. Как известно, однозначного определения аллергенов как химически обособленной группы антигенов не существует. Ни одна попытка установить, что определяет принадлежность аллергенов к особой группе антигенов и где четкая граница между аллергенами и неаллергенными антигенами, не увенчалась успехом. Между тем это имеет не только теоретическое, но и практическое значение хотя бы при разработке успешных подходов к созданию аллерговакцин.
В случае аллергенов биологического происхождения, в частности аллергенов пыльцы растений, непраздным является выяснение тех биологических функций, которые соответствующие молекулы выполняют в местах их естественного синтеза. Возникает вопрос, не имеет ли отношение реализация этих функций в эктопических условиях к проявлению аллергенности данной группы субстанций в организме человека. В связи с этим возникает следующий вопрос - о возможном влиянии аллергенов на такие фундаментальные биологические процессы, как активация, пролиферация, апоптоз клеток и секреция ими цитокинов. С учетом вышесказанного мы провели исследование способности препаратов аллергенов, экстрагированных из пыльцы ряда растений (тимофеевка, береза, полынь), а также аллергоидов, полученных на основе некоторых из них, индуцировать указанные биологические эффекты в условиях культуры мононуклеаров человека.
Материалы и методы. Исследование проведено in vitro в культуре мононуклеаров здоровых людей. Условия культивирования соответствовали общепринятым [1]. Продолжительность культивирования составляла в зависимости от задач исследования от 1 до 3 сут. Клетки активировали фитогемагглютинином (ФГА; 10 мкг/мл; “Sigma”, США), моноклональными антителами к CD3 или смесью форбол-миристатацетата (ФМА; 10 нг/мл, “Sigma”, США) и ионо-мицина (2 мкМ; “Sigma”, США).
В работе использовали аллергены из пыльцы березы, тимофеевки и полыни, полученные методом водно-солевой экстракции. По данным электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (по Лэмли) в экстракте березы идентифицировали 8 белков мол. массой от 14 до 70 кДа). Для получения аллергоида экстракты обрабатывали 1% раствором формальдегида. Активность аллергенов испытывали в трех концентрациях (в отдельных случаях в двух или пяти).
Апоптоз оценивали в тесте на окрашивание аннекси-ном V, меченным флюоресцеинизотиоцианатом (FITC), в сочетании с окрашиванием пропидия йодидом (для дифференцирования апоптоза и некроза) [5]. Активацию Т -клеток изучали цитофлюорометрически по экспрессии раннего (CD69) и позднего (HLA-DR) маркеров активации на CD3+-лимфоцитах. Пролиферацию клеток определяли по включению 3И-тимидина [1] и разведению метки сукцинильным эфиром карбоксифлюоресцеинацетата (CFSE) [4].
Секрецию цитокинов (интерлейкин (IL)-2, IL-4, IL-5, интерферон - IFN-y) оценивали по их содержанию в супернатантах методами проточной цитофлюорометрии на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (“Becton Dickinson”, США) с помощью двухлучевого лазерного автоматического анализатора с использованием коммерческой тест-системы Bio-Plex-Protein Assay System (“Bio-Rad”, США). Выработку IL-4 и IFN-y Т-лимфоцитами устанавливали путем цитофлюорометрического определения названных цитокинов внутри CD3+-клеток, предварительно обработанных брефелдином А (ингибитор внутриклеточного транспорта - Golgy Plug; “Becton Dickinson”, США) и пермеабилизированных сапонином (“Sigma”, США) с помощью моноклональных антител, меченных FITC [3].
Результаты измерений обрабатывали методами вариационной статистики с вычислением критерия t Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Препараты аллергена и аллергоида пыльцы тимофеевки не влияли на жизнеспособность мононуклеаров крови здоровых лю-
Таблица 1
Влияние препаратов аллергенов из пыльцы растений на апоптоз лимфоцитов человека (процент клеток, окрашивающихся аннексином V, но не пропидия йодидом)
Концентрация, нг/мл Аллерген пыльцы тимофеевки Аллергоид пыльцы тимофеевки Аллерген пыльцы березы Аллерген пыльцы полыни
0(контроль) 7,3 ± 2,5
0,1 8,4 ± 7,6 8,8 13,7 ± 9,1 4,4 ± 3,5
10 6,2 ± 4,8 8,6 8,4 ± 5,0 16,1 ± 7,7
1000 8,2 ± 4,8 6,8 15,5 ± 10,9 8,4 ± 7,7
Примечание. . Во всех случаях количество испытаний аллергенов (n) составляло 10, аллергоида тимофеевки - 3. Здесь и в табл. 3 данные выражены в M ± SD (SD - Standard deviation, или квадратическое отклонение).
дей (табл. 1). В присутствии некоторых концентраций аллергенов березы и полыни наблюдали довольно существенное повышение процента апоптотических лимфоцитов, однако отличия от контроля ни в одном случае не были значимыми.
Экспрессия CD69 и HLA-DR на поверхности Т-клеток, как покоящихся, так и активированных ФГА или антителами к CD3, не изменялась в присутствии исследованных аллергенов и аллергоидов во всех испытанных концентрациях (данные не представлены).
В тесте на включение 3Н-тимидина не обнаружили влияния аллергенов в трех испытанных концентрациях на уровень пролиферации нестимулированных, стимулированных ФГА или моноклональными антителами к CD3 (табл. 2). Наблюдающееся в отдельных ситуациях усиление включения радиоизотопной метки (например, двукратное повышение среднего показателя пролиферации клеток, активированных антителами к CD3) не было статистически значимым. В опытах с оценкой пролиферации клеток по разведению метки CFSE аллерген тимофеевки в диапазоне доз от 0,1 до 1000 нг/мл не оказывал влияния на все учтенные показатели, но при самой высокой
Таблица 2
влияние препаратов аллергенов из пыльцы растений на пролиферацию лимфоцитов человека по данным оценки включения 3Н-тимидина (в имп/мин)
Концентрация препарата, нг/мл Аллерген пыльцы тимофеевки Аллерген пыльцы березы Аллерген пыльцы полыни
Без активации:
без аллергенов 2 681 ± 1 724 3 782 ± 473 3 574 ± 271
0,1 2 283 2 548 1 346
10,0 22 131 ± 1 420 3 011 3 388 ± 1 481
1000 2 009 ± 703 3 424 2 383 ± 1 776
Активация ФГА:
без аллергенов 67 335 ± 14 932 65 669 ± 14 765 70 205 ± 16 805
0,1 927 161 ± 19 526 77 854 ± 21 570 78 996 ± 21 533
10,0 71 334 ± 23 891 75 343 ± 26 258 71 812 ± 22 196
1000 64 138 ± 19 313 72 524 ± 27 258 69 618 ± 23 896
Активация моноклональными антителами к CD3:
без аллергенов 26 295 19 091 10 091
0,1 18 832 19 087 17 502
10,0 27 262 20 390 15 395
1000 29 768 21 839 20 237
П р и м е ч а н и е. В тех случаях, когда количество определений на точку составляло 5, данные представлены в виде M ± SD, при n = 3 приведены только средние величины.
- 87 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012
Влияние препаратов аллергенов из пыльцы растений на секрецию цитокинов (концентрация в надосадке, нг/мл) Таблица 3
Цитокин Активация Контроль(без аллергена) Аллерген тимофеевки Аллерген березы Аллерген полыни
10 нг/мл 1000 нг/мл 10 нг/мл 1000 нг/мл 10 нг/мл 1000 нг/мл
IL-2 - 31,7 ± 13,1 28,0 ± 9,1 42,0 ± 18,3 27,5 ± 5,7 27,7 ± 5,7 21,1 ± 8,9 19,9 ± 7,1
ФМА+ иономицин 18,9 ± 2,1 39,7 ± 15,4 40,8 ± 15,4 43,7 ± 13,4 36,0 ± 8,3 30,8 ± 8,0 40,1 ± 5,1
IL-4 - 16,3 ± 6,4 16,6 ± 6,3 12,1 ± 7,7 24,4 ± 13,6 15,0 ± 5,5 26,7 ± 2,6 21,7 ± 6,7
ФМА + иономицин 81,9 ± 13,4 106,1 ± 8,8 117,0 ± 10,1 160,5 ± 18,4 109,4 ± 18,4 115,4 ± 13,5 112,5 ± 11,0
IL-5 - 7,6 ± 2,4 7,4 ± 1,7 5,0 ± 2,7 9,7 ± 1,4 2,7 ± 5,4 3,1 ± 6,3 6,8 ± 4,7
ФМА + иономицин 67,8 ± 60,8 81,0 ± 52,3 74,8 ± 56,7 69,9 ± 50,5 59,2 ± 49,2 106,0 ± 88,2 66,4 ± 46,6
IFN-y - 8,3 ± 1,1 10,5 ± 3,4 8,2 ± 1,2 17,5 ± 5,7 7,8 ± 0,3 8,0 ± 1,1 8,5 ± 1,5
ФМА + иономицин 965,6 ± 35,8 970,4 ± 15,4 1076,5 ± 30,2 992,9 ± 52,8 990,9 ± 32,1 1006,2 ± 35,6 983,3 ± 5,5
Примечание. . В каждой группе n = 5. Жирным выделены величины, значимо отличающиеся от контроля (р < 0,05).
концентрации (не использовавшейся в других опытах) 5000 нг/мл отметили признаки подавления пролиферации - увеличилось количество неделящихся клеток, снизились процент делящихся клеток, а также процент бласттрансформации (рис. 1). Этот результат рассматривается нами как показатель токсического действия высокой концентрации аллергена.
При испытании влияния аллергенов на секрецию цитокинов мононуклеарами крови зафиксировали более значительные эффекты (табл. 3). При оценке концентраций цитокинов в культуральном надосадке нестимулированных мононуклеаров аллергены не влияли на выработку цитокинов (исключение: усиление секреции IFN-y при действии аллергена березы в концентрации 10 нг/мл). При действии аллергенов на фоне активации смесью ФМА и иономицина наблюдали выраженные эффекты. Значимое усиление секреции IL-2 и IL-4 вызывали все три аллергена; различия касались лишь тех концентраций, при которых проявлялся эффект (рис. 2). Аллергены не оказывали значимого влияния на секрецию IL-5 (наблюдавшееся увеличение средних величин статистически незначимо). Достоверное усиление секреции IFN-y выявили при действии аллергена тимофеевки в концентрации 1000 нг/мл.
Рис. 1. Влияние экстрактов аллергенов пыльцы растений на пролиферацию лимфоцитов по данным разведения метки CFSE (результаты типичного опыта).
По оси абсцисс: Т — аллерген из пыльцы тимофеевки; цифра — концентрация (в нг/мл); по оси ординат - процент клеток.
Процент Т-клеток-продуцентов IL-4 и IFN-y оценивали в одном опыте с тремя повторностями, что не позволяет сделать вывод о значимости наблюдаемых различий. Содержание IFN-y+T-клеток при действии аллергенов варьировал от 6,5 до 12% при 9,4% в контроле, уровень ГЬ-4+-Т-клеток варьировало от 0,58 до 3,76% против 0,85% в контроле. Данные и в этом случае свидетельствуют о тенденции к усилению экспрессии IL-4, но отнюдь не IFN-y.
Полученные данные говорят об отсутствии значимых эффектов аллергенов в отношении жизнеспособности, акти-
Тимофеевка
Береза
Полынь
Рис. 2. Влияние экстрактов аллергенов на секрецию IL-4 (а) и IL-2 (б) мононуклеарами крови, стимулированными ФМА в сочетании с иономицином С.
По оси абсцисс - концентрация аллергенов (в нг/мл); по оси ординат -содержание (в нг/мл) IL-4 (а) или IL-2 (б) в культуральном надосадке (M ± SD). * - значимое (р < 0,05) отличие от показателя в контроле (отсутствие аллергенов).
- 88 -
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
вации и пролиферации лимфоцитов крови (подавление пролиферации наблюдали при сверхвысоких дозах, что свидетельствует, скорее всего, о проявлении токсичности). В то же время препараты аллергенов усиливали секрецию IL-4 и IL-2 в условиях активации клеток.
Таким образом, единственным существенным проявлением влияния препаратов аллергенов на лимфоидные клетки человека in vitro в рамках набора использованных тестов оказалось усиливающее действие на выработку активированными лимфоцитами двух цитокинов - IL-2, являющегося ростовым фактором Т-клеток (в особенности Тге ), и IL-4 - ключевого цитокина №2-клеток. Поскольку ^2-клеткам, по всеобщему убеждению, принадлежит ключевая роль в развитии аллергических процессов, наблюдавшийся факт заслуживает особенно пристального внимания и дальнейшего анализа. Известно, что при действии аллергенов на лимфоциты больных с сенсибилизацией к этим аллергенам in vitro усиливается выработка IL-4 и других №2-цитокинов [2]. Наши данные свидетельствуют о том, что в отношении IL-4 (а также IL-2) такая способность проявляется при действии аллергенов на несенсибилизированные, хотя и активированные лимфоциты.
В связи с тем что препараты аллергенов не были очищены до гомогенности, возникает вопрос, связан ли отмеченный эффект с аллергеном как таковым или с содержащимися в препарате примесями. Отмена эффекта параллельно с устранением аллергенности препаратов при их обработке формальдегидом лишь отчасти устраняет это сомнение (обработка формальдегидом могла устранить эффект неаллергенного компонента-примеси независимо от отмены
специфической активности аллергена). В то же время не исключено, что эффект аллергенов может усиливаться кофакторами, сопутствующими ему в тканях и экстрактах, и в этом случае их влияние на биологические процессы также представляет интерес. Тем не менее вопрос о действующем начале, ответственном за усиление секреции цитокинов в описанных экспериментах, остается открытым.
ЛИТЕРАТУРА
1. НиконоваМ. Ф., Чегаева Е. В., ЛитвинаМ. М. и др. Апоптоз активированных лимфоцитов и подавление их пролиферативного ответа на митогены при контакте с эпителиальными клетками, происходящими из тимуса человека // Иммунология. - 1997. - № 3. - С. 9-12.
2. Abbal C., Persi L., Bousquet J. Effect of bronchial allergen challenge on in vitro cytokine release by peripheral blood mononuclear cells of atopic patients // J. Allergy. - 1998. - Vol. 53. - P. 945-950.
3. Jung T., Schauer U., Heusser C. et al. Detection of intercellular cytokines by flow cytometry // J. Immunol. Meth. - 1993. - Vol. 159. - P. 197-207.
4. Lyons A. B., Parish C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry // J. Immunol. Meth. - 1994. - Vol. 171. - P. 131-137.
5. Van Egeland M, Nieland L. J. W., Ramaekers F. C. S. et al.
Annexin V-affinity assay: review on an apoptosis detection
system based on phosphatidylserine exposure // Cytometry. -1998. - Vol. 31. - P. 1-9.
Поступила 30.09.11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.348.66
А. О. Арзуманян*, С. К. Машилов*, Н. А. Михайлова*, И. А. Баснакьян, Н. Е. Ястребова*, Н. П. Ванеева*, А. В. Караулов**
IgG - АНТИТЕЛА К АНТИГЕНАМ БАКТЕРИИ, ТКАНЕЙ ЧЕЛОВЕКА, К CHLAMIDIA PNEUMONIAE И БТШ60 CHLAMIDIA PNEUMONIAE ПРИ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ
*Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН (105064, г. Москва, М. Казенный пер., 5а); **кафедра клинической иммунологии-аллергологии ФППО ГОУ ВПО Первый Московский медицинский университет им. И. М. Сеченова РАМН (119992, г Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2)
С целью изучения инфекционной природы атеросклероза на основе иммуноферментного анализа изучены сыворотки больных (n = 151) атеросклерозом на наличие IgG-антител к спектру бактериальных и тканевых антигенов. Установлено, что большинство (41,7%) сывороток не содержали антител ни к бактериальным, ни к тканевым антигенам или содержали антитела только к тканевым антигенам (32,5%), тогда как в группе доноров (n = 327) 72,8% сывороток не содержали ни тех, ни других антител.
Однако показано, что оставшиеся две категории сывороток в группе больных, содержащие антитела только к бактериальным антигенам, а также к бактериальным и тканевым антигенам, характеризовались более выраженной степенью атеросклероза (4,567 и 4,438 соответственно против 4,065 и 4,092). Степень атеросклероза оценивали на основании таблицы стратификации факторов риска гипертонической болезни.
Степень атеросклероза также коррелировала с уровнем антител к антигену Ch. pneumoniae (r = 0,894) и к белкам теплового шока 60 хламидий (r = 0,986), которые были выше в тех категориях, где в сыворотках присутствовали антитела к спектру бактериальных антигенов. Ту же закономерность прослеживали при исследовании процентного содержания антител к антигенам хламидии в каждой категории больных. Их большее количество наблюдалось в категориях сывороток, содержащих антитела к спектру бактериальных антигенов.
Таким образом, подтверждается роль бактериальных агентов, в том числе хламидийных, в развитии и течении атеросклероза.
Ключевые слова: хламидии, атеросклероз, бактериальные антитела, IgG-антитела
- 89 -
