CC BY
122
УДК 612.017.1-612.018.-573.6.
Неолактоферрин как стимулятор врожденного и адаптивного иммунитета
А. Д. Черноусов12, М. Ф. Никонова1, Н. И. Шарова1, А. Н. Митин1, М. М. Литвина1,
П. Е. Садчиков1, И. Л. Гольдман2, | А. А. Ярилин1, Е. Р. Садчикова2*
Тосударственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медикобиологического агентства России, 115478, Москва, Каширское ш., 24, корп. 2 2Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5 *E-mail: e.r.sadchikova@gmail.com Поступила в редакцию 07.05.2013
РЕФЕРАТ Инновационный продукт Неолактоферрин представляет собой естественную комбинацию рекомбинантного лактоферрина человека (90%) и лактоферрина козы (10%), выделенных из молока коз-продуцентов, несущих в геноме полноразмерный ген лактоферрина человека. Изучено действие Неолак-тоферрина на клетки иммунной системы человека. Неолактоферрин усиливал выработку интерлейкина 1Р (IL-1P), определял направление дифференцировки предшественников дендритных клеток, усиливал экспрессию факторов транскрипции, ответственных за дифференцировку Th- и Treg-клеток, стимулировал выработку как интерферона-у, так и IL-4. Обогащенный ионами железа Неолактоферрин усиливал синтез провоспалительного цитокина - фактора некроза опухолей а. Полученные данные свидетельствуют о том, что Неолактоферрин обладает иммунотропной активностью, сдерживает развитие иммунных процессов по воспалительному пути. Обогащение Неолактоферрина ионами железа усиливает его провоспалитель-ную активность.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА воспаление, иммунитет, Неолактоферрин, рекомбинантный лактоферрин человека, факторы транскрипции, цитокины.
ВВЕДЕНИЕ
Лактоферрин (Лф) - ключевой бактерицидный белок грудного молока, обеспечивающий защиту новорожденного ребенка от инфекций. Лф обладает противо-микробным [1-3], противовирусным [4-6] и противогрибковым [7, 8] действием. Показано также, что Лф поражает антибиотикустойчивую микрофлору без формирования генетической адаптации к нему микроорганизмов [9, 10]. При совместном применении Лф и антибиотиков наблюдается усиление действия последних [11, 12]. Несмотря на выраженную антимикробную активность, Лф не подавляет жизнедеятельность нормальной микрофлоры желудочнокишечного тракта [13, 14]. Более того, он стимулирует рост бифидобактерий, поставляя необходимые для их жизнедеятельности ионы железа [15]. Среди других биологических активностей Лф основными являются: иммуномодулирующая [9, 16], антиоксидантная [17, 18] и противовоспалительная [19]. Обнаружено, что Лф и его производные (лактоферрицины) подавляют развитие опухолей и метастазов у экспериментальных животных [20-22].
Механизм биологических активностей Лф хорошо изучен [23-25]. Установлено, что бактерицидность
Лф обусловлена не только непосредственным воздействием на патогенные микроорганизмы, но и способностью активировать иммунную систему организма за счет стимуляции врожденного иммунитета, активации и дифференцировки иммунокомпетент-ных клеток [26]. Было решено выделить лактоферрин человека (чЛф) в чистом виде и попытаться использовать его в качестве компонента продуктов функционального питания и в составе различных биологически безопасных лекарственных средств нового поколения. Возможность подобного использования чЛф подтверждена в работах сотрудников Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена, создавших на основе чЛф, выделенного из грудного молока, высокоэффективные лекарственные средства широкого терапевтического действия [27-30], в том числе и инъекционные [31]. К сожалению, вследствие дефицита грудного молока потребность в чЛф не может быть полностью удовлетворена.
В последнее десятилетие широкое распространение получил лактоферрин, выделенный из коровьего молока (Bovine lactoferrin, бЛф), биологические активности которого во многом оказались сходными
с чЛф [32, 33]. Несмотря на успехи в использовании бЛф [34], «чужеродный» бЛф решили заменить рекомбинантным лактоферрином человека (рчЛф), как это сделано в случае некоторых других биологически активных белков животных.
Известно, что по аминокислотной последовательности чЛф и бЛф совпадают лишь на 67% [35]. Различия в первичной структуре приводят к различиям во вторичной и третичной структуре этих белков, что может определять их функциональные особенности. Уже выявлены определенные различия в строении рецепторов чЛф и бЛф в различных органах и тканях человека [36]. Установлено, например, что рецептор клеток тонкого кишечника более специфичен к чЛф, чем к бЛф, и это отличие в значительной степени определяется структурой чЛф [37]. Предполагается, что рецептор чЛф участвует во всасывании железа в тонком кишечнике человека [38]. Обычно железо транспортируется через апикальную мембрану тонкого кишечника при помощи транспортера двухвалентных катионов (Divalent metal transporter-1, DMT-1). Железо, связанное с чЛф, не может проникнуть в клетку посредством DMT-1, для этого служит рецептор чЛф. Попав в клетку, чЛф связывается с ядром, где, по-видимому, действует в качестве фактора транскрипции и активирует биосинтез таких сигнальных белков, как каспаза-1 и интерлейкин-18, которые затем поступают в циркуляцию как системный сигнал. Этот путь считается минорным, по нему транспортируется ~10% чЛф. Основной путь, по которому чЛф проникает в эпителиальные клетки, приводит к деградации ~90% белка и высвобождению железа.
Рецепторы чЛф, аналогичные рецептору тонкого кишечника, удалось найти в слюнных железах, сердце, скелетных мышцах, надпочечниках и поджелудочной железе [39]. Два других типа рецепторов обнаружены в печени: рецепторный белок липопро-теинов низкой плотности (LRP) и асиалогликопро-теиновый рецептор (ASGPR).
При расщеплении бЛф и чЛф образуются так называемые лактоферрицины, обозначаемые соответственно символами В [40] и Н [41], которые различаются как по аминокислотной последовательности, так и по биологической активности.
Иммунологи полагают, что полную биологическую безопасность бЛф для человека может гарантировать только применение этого белка в составе пищевых продуктов, тогда как чЛф можно использовать и в составе инъекционных лекарственных средств.
К настоящему времени рчЛф получен в разных странах при помощи современных биотехнологических методов, а также растений [42, 43], микроскопических грибов [44] и животных [45, 46] в качестве продуцентов.
В Российской Федерации в рамках Программы союзного государства (Россия-Белоруссия) рчЛф получен в составе козьего молока [47]. По физикохимическим параметрам и биологической активности рчЛф соответствует природному чЛф [48, 49]. На основе этого белка создан инновационный продукт Неолактоферрин (Неолакт), представляющий собой комбинацию рчЛф и лактоферрина козы (кЛф), присутствующих в молоке трансгенных коз в соотношении рчЛф : кЛф = 90 : 10.
Ранее мы экспериментально установили, что лак-тоферрин козы усиливает экспрессию гена NF-kB и синтез важнейшего для активации врожденного иммунитета фактора некроза опухолей a (TNFa, tumor necrosis factor), но не влияет на активацию синтеза интерлейкина-1 (IL-1, interleukin-1).
В представленной работе изучено совместное действие рчЛф и кЛф на показатели врожденного иммунитета человека. Исследована способность Неолакта с различным насыщением железа - 4% (Fe-) и 16% (Fe+) активировать врожденный иммунитет, усиливать презентирующую способность дендритных клеток, определять направление дифференциров-ки предшественников Т-клеток и усиливать синтез основных цитокинов адаптивного иммунного ответа -интерферона-у (IFNy, interferon-у) и IL-4.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Активность образцов Неолакта оценивали в диапазоне концентраций от 0.1 до 100 мкг/мл при инкубации с исследуемыми клетками в течение 18 ч при 37°С.
Мононуклеары (преимущественно лимфоциты) выделяли из цельной крови человека центрифугированием с использованием одноступенчатого градиента плотности фиколл-верографин (плотность 1.077 г/мл). Прилипающую фракцию получали инкубацией мононуклеаров крови в 24-луночных плашках (Costar, США) в течение 1 ч при 37оС.
Линия дендритных клеток человека HTSC.IL-10 получена и поддерживается в лаборатории диф-ференцировки лимфоцитов Института иммунологии [50].
Экспрессию мембранных молекул на поверхности клеток оценивали при помощи проточной цито-флуориметрии BD FACSCanto II с использованием моноклональных антител, меченных флуоресцеи-низотиоцианатом (анти-CD80, анти-CD123) или фи-коэритрином (анти-HLA-DR, анти-CD86) (Caltag, США).
Концентрацию цитокинов в культуральных средах определяли иммуноферментным методом с использованием соответствующих тест-наборов (ОАО «Цитокин», Санкт-Петербург).
800
700
600
500
400
300
200
100
0
1
-о- CD80 CD86 — HLA-DR
IL-1 в
TNFa
Рис. 1. Влияние Неолакта (2) и Неолакта, обогащенного железом (3), на секрецию моноцитами цито-кинов ^-1 в и Т^а. 1 - уровень секреции цитокинов в контроле. По оси ординат: концентрация цитокинов (пг/мл) в культуральной среде моноцитов. Представлены медианы *р < 0.05 относительно контроля;
# - то же относительно Неолакта. Содержание Нео-лакта и Неолакта, обогащенного железом, в среде составило 10 мкг/мл
Рис. 2. Влияние Неолакта на экспрессию костимули-рующих молекул HLA-DR, CD80 и CD86 дендритными клетками линии НТБС.!Ь-10. Представлены средние значения трех определений. По оси абсцисс - концентрация Неолакта, мкг/мл, по оси ординат - процент клеток, несущих маркер. К - исходная экспрессия костимулирующих молекул, без добавления Неолакта
*,#
2
3
2
3
Внутриклеточные цитокины определяли в моно-нуклеарах, активированных смесью 4-форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА) и иономицина (ионо), в присутствии BD GolgiStop (Becton Dickinson, США) и пермеабилизированных BD-набором (BD Cytofix/ Cetoperm Fixation/Permeabilization Kit) на проточном цитометре с использованием меченых моноклональных антител к цитокинам [51].
Уровень экспрессии генов факторов транскрипции (NF-xB, GATA-3, Tbet, FOXP3 и RORc) определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с предварительной обратной транскрипцией. Использовали наборы реагентов TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit и TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems, США) [52]. Уровень экспрессии мРНК определяли относительно экспрессии мРНК гена «домашнего хозяйства» Р2-микроглобулина (B2M) по формуле:
ДДС1 = 2-((Ct вк - Ct ) - (Ct вк - Ct ))
¿ B2M B2M генХ генХ ’
где Ct - пороговый цикл, определяемый на экспоненциальном участке кривой накопления ДНК, ВК -внутренний контроль.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов непараметрического анализа. Показатели представляли в виде Ме (L-H),
где Ме - медиана, L - нижний квартиль, Н - верхний квартиль. Для сравнения показателей использован и-критерий Манна-Уитни.
результаты и обсуждение
Нами обнаружено, что Неолакт активирует врожденный иммунитет. В концентрации 10 и 100 мкг/мл он значимо усиливал секрецию ^-1Р моноцитами крови человека, не влияя на выработку TNFа.
Обогащение Неолакта ионами железа индуцировало появление у него способности усиливать выработку TNFa (рис. 1). Таким образом, провоспалительная активность Неолакта ограничивалась повышением выработки 1Ъ-1 в моноцитами крови, тогда как его обогащение ионами железа существенно активировало врожденный иммунитет и усиливало проявления провоспалительных эффектов.
Влияние Неолакта на экспрессию мембранных молекул, играющих ключевую роль в презентации антигена, определенное на дендритных клетках линии HTSC.IL-10, представлено на рис. 2. Неолакт в трех испытанных дозах значительно снижал число клеток, экспрессирующих молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II (HLA-DR) и костимулирующую молекулу CD86, которые исходно были представлены почти на всех клетках линии, и повышал численность клеток, несущих дру-
К1
К2
Неолакт
кЛф
28/02 fetotype-conlro;
РЗ
‘ "TTIГ1ИЦ i niпп|—i i iШ1|—г
10* 10° 10* 10s РЕ-А
О i
Ч>-; ■
Q i i
\ РЗ
34 jrJ А*,,.
1 !" i i: тг 1 lllffll 1 II Щ 1
юг к 3 ю‘ 10
РЕ-А
■ I 1'М 1Ш| Г
ю* ю" к1 ios РЕ-А
0.8%
2.5%
17.1%
9.4%
Рис. 3. Влияние Неолакта и козьего лактоферрина на экспрессию молекул CD123 на дендритных клетках линии НTSC.IL-10 в суточных культурах. Гистограммы двуцветного окрашивания моноклональными антителами. К1 -без окрашивания анти-CD123-PE; К2 - без инкубации с Неолактом. Жирным выделены значения, отличающиеся от контроля в 2 и более раз. Концентрации Неолакта и козьего лактоферрина составили 10 мкг/мл
гую костимулирующую молекулу - CD80, исходно представленную на малом числе клеток этой линии. Под влиянием Неолакта фактически происходила смена костимулирующих молекул на поверхности дендритных клеток. При этом под влиянием Неолакта возрастала плотность молекул HLA-DR на каждой индивидуальной клетке. Введение в препарат ионов железа приводило к утрате этих эффектов. Снижение доли дендритных клеток, несущих молекулы HLA-DR, можно рассматривать как свидетельство ограничения под влиянием Неолакта антигенпрезентирующей способности популяции дендритных клеток. Активация Т-клеток, зависящая от экспрессии костимулирующих молекул, в присутствии Неолакта количественно не меняется, поскольку ослабление экспрессии одной кости-мулирующей молекулы сопровождается усилением экспрессии другой, выполняющей аналогичную функцию. При этом Неолакт обладает активностью фактора дифференцировки дендритных клеток, что регистрируется по экспрессии маркера плаз-мацитоидных дендритных клеток - CD123, являющегося рецептором ^-3 (рис. 3). Индукция экспрессии CD123, которую можно трактовать как признак конверсии фенотипа дендритных клеток из миело-идных в плазмацитоидные [53], определяет иммунный ответа №2-типа и ослабляет более агрессивный ответ Т-клеток (ТЫ и ТЫ7), приводящий к развитию иммунного воспаления. Необходимо отметить, что у кЛф дифференцирующая активность выражена в меньшей степени (рис. 3).
Выбор направления дифференцировки Т-хелпер-ных клеток в конечном счете определяет направление иммунного ответа, а также его про- или противовоспалительный характер, способность благоприятствовать развитию различных форм иммунопатологии
и т.д. Условно к провоспалительным можно отнести ТЫ- и ТЫ7-клетки, а к противовоспалительным -№2 и Тreg, причем №2-клетки принято рассматривать как проаллергические. Направление диффе-ренцировки и стабилизация клеточного фенотипа определяются экспрессией факторов транскрипции GAТA-3 (для ^2-клеток), ТЬе! (для ТЫ), ГОГс (для ТЫ7) и FOXP3 (для Тreg), кодируемых соответственно генами GATA3, ТВХ21, RORC и FOXP3. В связи с этим спектр экспрессии указанных генов Т-клетками крови в значительной степени определяет наследственную или индуцированную склонность организма к развитию иммунного ответа в том или ином направлении, а также различных форм иммунопатологии.
Влияние Неолакта на развитие Т-хелперных клеток различного типа оценивали по их воздействию на экспрессию генов факторов транскрипции, контролирующих дифференцировку CD4+ Т-клеток (таблица). Неолакт и его производное, обогащенное железом, уже в концентрации 1 мкг/мл усиливали экспрессию гена GATA3, ответственного за развитие №2-клеток, антипаразитарную защиту и проаллер-гическую ориентацию иммунных процессов. Эффект проявлялся при действии Неолакта как на покоящиеся, так и на активированные Т-клетки. Сколько-нибудь существенного влияния на экспрессию «про-воспалительных» генов ТВХ21 (кодирует фактор ТЬе! ТЫ-клеток) и RORC (кодирует фактор ТЫ7-клеток ГОГс) не обнаружено. Неолакт усиливает экспрессию гена FOXP3, ответственного за развитие регуляторных Т-клеток, которые ограничивают интенсивность и длительность иммунного ответа. Неолакт не индуцирует экспрессию в дендритных клетках гена Р-цепи ^-12, ответственного за дифференцировку ТЫ-клеток.
Влияние Неолакта на экспрессию генов факторов транскрипции, контролирующих дифференцировку CD4+ Т-лимфоцитов
Неолакт, мкг/мл Гены факторов транскрипции
GATA3 TBX21 RORC FOXP3
Неактивированные лимфоциты
0 (контроль) 0.718 (0.527-0.974) 0.010 (0.005-0.018) 0.260 (0.199-0.292) 0.569 (0.306-0.818)
1.0 1.173* (0.815-1.690) 0.014 (0.002-0.016) 0.266 (0.159-0.272) 0.834* (0.811-1.120)
10.0 0.727 (0.481-2.587) 0.018 (0.001-0.028) 0.172 (0.043-0.409) 0.767 (0.246-0.774)
Активированные фитогемагглютинином лимфоциты
0 (контроль) 0.613 (0.483-0.894) 0.010 (0.005-0.017) 0.649 (0.433-1.013) 0.805 (0.047-1.101)
1.0 1.228* (0.705-1.815) 0.014 (0.007-0.018) 0.487 (0.399-0.802) 1.018 (0.759-2.446)
10.0 0.675 (0.399-0.807) 0.011 (0.008-0.013) 0.743 (0.483-1.576) 0.678 (0.361-1.069)
*р < 0.05.
Примечание. Представлены медианы (в скобках - нижний и верхний квартили).
Л
%
Б
%
14
12
10
8
6
4
2
0
і
^ К
■ ФМА + иономицин
IFNY 1Ь-4
Рис. 4.Влияние Неолакта на индукцию Т-клеток, образующих IFNY и ^-4 (п = 3) (А), и положительный контроль синтеза указанных цитокинов Т-клетками при оптимальной стимуляции смесью ФМА/иономицин (100 нМ/2 мкМ соответственно) (Б). По оси абсцисс - концентрация рчЛф (Л), по оси ординат - процент клеток, продуцирующих ^N7 и ^-4 (Л, Б)
Таким образом, в этой группе тестов Неолакт не только не проявил сколько-нибудь выраженной способности усиливать экспрессию факторов, вовлеченных в развитие иммунного воспаления, но оказывал скорее противоположное действие, стимулируя экспрессию генов, ответственных за развитие №2-и Treg-клеток.
Оценка влияния Неолакта на дифференцировку ТЫ- и ^2-клеток (ТЫ- и ^2-клетки определяли по числу клеток, продуцирующих их ключевые
цитокины - №N7 и ^-4 соответственно) показала, что Неолакт усиливает выработку обоих цитокинов. При концентрации 1 мкг/мл продукция №N7 усиливается в большей степени, чем выработка ^-4, при концентрации 10 мкг/мл эффекты обоих цитокинов выравниваются (рис. 4). Но даже при концентрации 1 мкг/мл число клеток-продуцентов №N7 остается существенно меньше, чем при активации клеток смесью ФМА и иономицина, тогда как число ^-4-продуцентов превышает этот уровень. Иными
словами, стимуляция Th2-клеток под действием Нео-лакта соответствует физиологическому уровню их вовлечения в иммунный ответ, тогда как стимуляция Thl-клеток не достигает этого уровня, что не противоречит результатам оценки влияния рчЛф на экспрессию генов факторов транскрипции, контролирующих дифференцировку подклассов Т-хелперных клеток.
ВЫВОдЫ
Суммируя результаты оценки влияния Неолак-та на некоторые проявления активности иммунной системы, можно заключить, что препарат обладает иммунотропной активностью, его действие в определенной степени направлено на сдерживание иммун-
ных процессов или их развитие по №2-зависимому пути. В то же время, судя по влиянию на формирование №N7- и ^-4-продуцирующих клеток, препарат не вызывает резко выраженной поляризации иммунного ответа, что могло бы послужить основой для развития аллергических или аутоиммунных процессов. Обогащение препарата ионами железа вызывает усиление его провоспалительной активности и утрату ряда эффектов, свойственных исходному Неолакту.
Работа поддержана Министерством образования и науки РФ (государственный контракт № 01.916.12.0001).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Farnaud S., Evans R.W. // Mol. Immunol. 2003. V. 40.
P. 395-405.
2. Brock J.H. // Biochem. Cell Biol. 2012. V. 90. P. 245-251.
3. Sallmann F.R., Baveye-Descamps S., Pattus F., Stivense K.J. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 16107-16114.
4. van Hooijdonk A.C., Kusstndrager K.D., Steijns J.M. // Br. J. Nutr. 2000. V. 84. P. 127-134.
5. Ikeda M., Nozaki A., Sugiyama K., Shiita J., Sato T. // Virus Res. 2000. V. 66. P. 51-63.
6. Pietrantoni A., Ammendolia M.G., Superti F. // Biochem. Cell Biol. 2012. V. 90. P. 442-448.
7. Andersson Y., Lindquist S., Lagerqvist C., Hernell O. // Early. Hum. Dev. 2000. V. 59. P. 95-105.
8. Giels S., Czuprynski C. // Microb. Pathog. 2002. V. 32. P. 87-97.
9. Kruzel M.L., Zimecki M. // Arch. Immunol. Ther. 2002. V. 50. P. 339-410.
10. Leitch E.C., Willcox M.D. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2001. V. 18. P. 399-402.
11. Naidu A.S., Arnold R.R. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1994. V. 20. P. 69-75.
12. Fowler C.E., Soothill J.S., Oakes L. // J. Antimicrob. Chemother. 1997. V. 40. P. 877-879.
13. Reiter B. // Ann. Rech. Vet. 1978. V. 9. P. 205-224.
14. Petschow B.M., Talbott R.D., Batema R.P. // J. Med. Microbiol. 1999. V. 48. P. 541-546.
15. Kim W.S., Ohashi M., Tanaka T., Nozaki A., Sugiyama K. // Biometals. 2004. V. 17. P. 279-283.
16. Yamauchi K., Wakabayashi H., Shin K., Takase M. // Biochem. Cell Biol. 2006. V. 84. P. 291-296.
17. Tomita M., Wakabayashi H., Shin K., Kuwata H., Yip T.T., Yamauchi K., Teraguchi S., Hayasawa H. // Biochimie. 2009. V. 91. P. 52-57.
18. Mulder A.M., Connellan P.A., Oliver C.J., Morris C.A., Stevenson L.M. // Nutr. Res. 2008. V. 28. P. 583-589.
19. Kulics J., Kijstra A. // Immunol. Lett. 1986/1987. V. 14. P. 349.
20. Furlong S.J., Mader J.S., Hoskin D.W. // Exp. Mol. Pathol. 2010. V. 88. P. 371-375.
21. Mader J.S., Salsman J., Conrad D.M., Hoskin D.W. //
Mol. Cancer Ther. 2005. V. 4. P. 612-624.
22. Bezault J., Bhimani R., Wiprovnick J. // Cancer Res. 1994.
V. 54. P. 2310-2312.
23. Murphy M.E., Kariwa H., Mizutani Т., Yoshimatsu K., Arikawa J., Takashima I. // Arch. Virol. 2000. V. 145.
P. 1571-1582.
24. Бухарин О.В., Валышев А.В., Валышева И.В. // Успехи совр. биол. 2011. Т. 131. С. 135-144.
25. Lonnerdal B., Iyer S. // Annu. Rev. Nutr. 1995. V. 15.
P. 93-110.
26. Spadaro M., Caorsi C., Ceruti P., Varadhachary A., Forni
G., Pericle F., Giovarelli M. // FASEB J. 2008. V. 22.
P. 2747-2757.
27. Немцова Е.Р., Иванова Л.М., Якубовская Р.И. // Вопр. мед. химии. 1995. Т. 3. C. 58-61.
28. Эделева Н.В., Сергеева Т.В., Немцова Е.Р., Щербицкая И.Я., Якубовская Р.И., Осипова Н.А. // Анестезиология и реаниматология. 2001. Т. 5. С. 61-64.
29. Немцова Е.Р., Эделева Н.В., Осипова Н.А., Якубовская Р.И., Бойко А.В., Демидова Л.В., Чиссов В.И. // Рос. онкол. журн.
2006. № 4. С. 29-32.
30. Эделева Н.В., Немцова Е.Р., Якубовская Р.И., Иванова Л.М., Осипова Н.А. // Рос. онкол. журн. 2005. № 6. С. 34-39.
31. Чиссов В.И., Якубовская Р.И., Бойко А.В., Немцова Е.Р., Сергеева Т.В., Осипова Н.А. Пат. RU № 2165769. 2001.
32. Spik G., Burnet B., Mazurier-Dehaine C., Fontaine G., Montreuil J. // Acta Paediatr. Scand. 1982. V. 71. P. 979-985.
33. Cirioni O., Giacometti A., Barchiesi F., Scalise G. // J. Antimicrob. Chemother. 2000. V. 46. P. 577-582.
34. Valenti P., Berlutti F., Conte M.P., Longhi C., Seganti L. // J. Clin. Gastroenterol. 2004. V. 38. P. 127-129.
35. Magnuson J.S., Henry J.F., Yip T.T., Hutchens T.W. // Pediatr. Res. 1990. V. 28. P. 176-181.
36. Kawakami H., Londderdal B. // Am. J. Physiol. 1991. V. 261.
P. 841-846.
37. Suzuki Y.A., Shin K., Lonnerdal B. // Biochemistry. 2001.
V. 40. P. 15771-15779.
38. Baker E.N., Baker H.M. // Cell Mol. Life Sci. 2005. V. 62.
P. 2531-2539.
39. Suzuki Y.A., Lopez V., Lonnerdal B. // Cell. Mol. Life Sci. 2005. V. 62. P. 2560-2575.
40. Bellamy W., Takase M., Wakabayashi H., Kawase K., Tomita M. // J. Appl. Bacteriol. 1992. V. 73. P. 472-479.
41. Odell E.W., Sarra R., Foxworthy M., Chapple D.S., Evans R.W. // FEBS Lett. 1996. V. 382. P. 175-178.
42. Conesa C., Calvo M., Sánchez L. // Biotechnol. Adv. 2010. V.
28. P. 831-838.
43. Lönnerdal B. // J. Am. Coll. Nutr. 2002. V. 21. P. 218S-221S.
44. Andersen J.H. // Curr. Opin. Mol. Ther. 2004. V. 6. P. 344-349.
45. van Berkel P.H., Welling M.M., Geerts M., van Veen
H.A., Ravensbergen B., Salaheddine M., Pauwels E.K., Pieper E, Nuijens J.H., Nibbering P.H. // Nat. Biotechnol. 2002.
V. 20. P. 484-487.
46. Zhang J., Li L., Cai Y., Xu X., Chen J., Wu Y., Yu H., Yu G., Liu S., Zhang A., et al. // Protein. Expr. Purif. 2008. V. 57.
P. 127-135.
47. Goldman I.L., Georgieva S.G., Gurskiy Y.G., Krasnov A.N., Deykin A.V., Popov A.N., Ermolkevich T.G., Budzevich A.I., Chernousov A.D., Sadchikova E.R. // Biochem. Cell Biol. 2012. V. 90. P. 512-519.
48. Соколов A.B., Пулина М.О., Кристиян А.В., Захарова Е.Т., Рунова О.Л., Васильев В.Б., Гурский Я.Г., Минашкин М.М., Краснов А.Н., Кадулин С.Г. и др. // ДАН. 2006. Т. 411. № 2. С. 267-270.
49. Goldman I., Chernousov A., Sadchikova E. // Recent Adv. Clin. Med. 2010. P. 315-321.
50. Шарова Н.И., Литвина М.М., Ярилин A.A. // Иммунология. 2010. Т. 31. C. 181-185.
51. Jung Т., Schauer U., Heusser C., Neumann C., Rieger C. // J. Immunol. Meth. 1993. V. 159. P. 197-207.
52. Донецкова А.Д., Никонова М.Ф., Ярилин A.A. // Иммунология. 2011. Т. 32. C. 184-188.
53. Schmitt N., Cumont M.C., Nugeyre M.T., Hurtrel B., Bar-ré-Sinoussi F., Scott-Algara D., Israël N. // Immunobiology.
2007. V. 212. P. 167-177.
