CC BY
32
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
Смирнов Д.С.1, Донецкова А.Д.12, Литвина М.М.1, Никонова М.Ф.1, Митин А.Н.1, Курбачева О.М.1
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ИЗОФОРМ МОЛЕКУЛЫ РОХР3 РЕГУЛЯТОРНЫМИ Т-КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ АЛЛЕРГИЧЕСКОМ РИНИТЕ ДО И ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУНОТЕРАПИИ
1 ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва, Россия;
2 ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, 117997, Москва, Россия
Методом проточной цитометрии мы оценили численность регуляторных Т-клеток и уровень экспрессии изоформ молекулы FOXP3, а методом полимеразной цепной реакции в реальном времени - уровень экспрессии мРНК транскрипционных факторов GATA3, TBX21 и RORC в периферической крови пациентов с сезонным аллергическим ринитом или риноконъюнктивитом. До проведения терапии в исследуемой группе было выявлено наличие Т1п2-дисбаланса (повышение соотношения GATA3/TBX21) и снижение общего числа регуляторных Т-клеток, в основном, за счет уменьшения численности регуляторных Т-клеток, экспрессирующих молекулу FOXP3, лишенную экзона 2. Последнее обстоятельство мы расценили как возможное снижение функциональной активности регуляторных Т-клеток. После проведения АСИТ было отмечено относительное усиление функциональной активности регуляторных Т-клеток за счет накопления клеток, экспрессирующих молекулу FOXP3, лишенную экзона 2, снижение соотношения GATA3/TBX21 и более низкий уровень экспрессии мРНК RORC. Выше означенные изменения имели долгосрочный характер, сохраняясь как минимум до окончания сезона палинации, и были расценены нами как положительный эффект от проведенной аллерген-специфической иммунотерапии.
Ключевые слова: изоформы FOXP3; изоформы; регуляторные Т-клетки человека; аллергический ринит; проточная цитометрия.
Для цитирования: СмирновД.С., Донецкова А.Д., ЛитвинаМ.М., НиконоваМ.Ф., Митин А.Н., Курбачева О.М. Анализ экспрессии изоформ молекулы FOXP3 регуляторными Т-клетками периферической крови при аллергическом рините до и после проведения аллерген-специфической иммунотерапии. Иммунология. 2018; 39(5-6):282-286. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-282-286
Smirnov D.S.1, Donetskova A.D.1,2, Litvina M.M.1, Nikonova M.F.1, Mitin A.N.1, Kurbacheva O.M.1
ANALYSIS OF FOXP3 ISOFORMS EXPRESSION BY REGULATORY T CELLS FROM PERIPHERAL BLOOD
IN ALLERGIC RHINITIS BEFORE AND AFTER SPECIFIC IMMUNOTHERAPY
'National Research Center - Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115522, Moscow, Russian Federation;
2Pirogov Russian National Research Medical University, 117997, Moscow, Russian Federation
We have analyzed the number of regulatory T cells and the level of FOXP3 isoforms expression by flow cytometry and mRNA expression of the transcription factors GATA3, TBX21 and RORC by real-time PCR in peripheral blood of patients with seasonal allergic rhinitis (or rhinoconjunctivitis). Before the therapy, there was e a Th2/Th1 imbalance (increase in the ratio of GATA3/TBX21) and a decrease in the total number of regulatory T cells mainly due to amount reduction of regulatory T cells expressing FOXP3 molecule lacking exon 2. The last fact we have estimated as a possible decrease in the functional activity of regulatory T cells. After specific immunotherapy we observed a relative increase in the functional activity of regulatory T cells through the accumulation of cells expressing FOXP3 molecule lacking exon 2, a decrease in the GATA3/TBX21 ratio and a lower level of RORC mRNA expression. Those changes had long-term character, remaining at least until the end of the pollination season, and we assessed them as a positive effect of the specific immunotherapy.
Keywords: FOXP3 isoforms; human regulatory T cells; allergic rhinitis; flow cytometry; specific immunotherapy.
For citation: Smirnov D.S., Donetskova A.D., LitvinaM.M., Nikonova M.F., Mitin A.N., Kurbacheva O.M. Analysis of FOXP3 isoforms expression by regulatory T cells from peripheral blood in allergic rhinitis before and afterspecific immunotherapy. Immunologiya. 2018; 39(5-6): 282-286. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-282-286
For correspondence: DonetskovaAlmira Dmitrievna, E-mail: almira_donetskova@yahoo.com
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The study was carried out within the framework of the state tasks on thematic plans of implementation offundamental and applied research and development in the field of health, performed by fgbu "SSC Institute of immunology"FMBA of Russia..
Received 10.08.18 Accepted 16.11.18
Аллергический ринит (АР) - заболевание, характеризующееся №2-дисбалансом иммунного ответа со специфи-
Для корреспонденции: Донецкова Альмира Дмитриевна, E-mail: almira_donetskova@yahoo.com.
ческим изменением профиля секретируемых цитокинов, ремоделированием слизистой оболочки носа, ринореей и повышенным слизеобразованием. Аллергический ринит часто сочетается с другими аллергическими заболеваниями, в частности, с аллергическим конъюнктивитом, бронхиальной астмой и др. АР и сопутствующие аллергические заболева-
ния, обусловленные гиперчувствительностью к пыльце растений, формируют группу «поллинозов».
При поляризации иммунного ответа ключевыми факторами являются продукты= экспрессии генов GATA3, TBX21 (TBET) и FOXP3. При №2-дисбалансе преобладает экспрессия транскрипционного фактора GATA-3 на фоне ослабления экспрессии транскрипционных факторов с противоположным эффектом - TBX21 и FOXP3, которые отвечают за диф-ференцировку Thl-хелперов и регуляторных Т-клеток (Трег), соответственно [1]. Учитывая важную роль в ограничении иммунного ответа и воспаления Трег, можно предположить, что в значительной степени патогенез АР обусловлен недостаточностью данной субпопуляции Т-клеток [2].
В ранее проведенных исследованиях было показано, что содержание Трег в периферической крови пациентов с АР может быть или нормальным, или сниженным [3-5]. Более противоречивые результаты были получены при исследовании транскрипционных факторов в биоптатах и смывах из носовой полости пациентов с АР. На фоне повышенного уровня экспрессии GATA3 одни исследователи определяли сниженные [6, 7], а другие повышенные [8] уровни экспрессии FOXP3. Причиной возникающих противоречий, помимо различий в методологии проводимых исследований, может являться функциональная неоднородность Трег И это диктует необходимость оценивать не только количественные показатели Трег, но и их функциональные характеристики [2].
Как уже упоминалось ранее, основным регулятором диффе-ренцировки и функционирования Трег является транскрипционный фактор FOXP3 [9]. В отличие от мышей, наиболее часто используемых при моделировании человеческих заболеваний, у человека данный транскрипционный фактор представлен в виде 4 изоформ: полная молекула (FOXP3-FL); с делецией домена, кодируемого экзоном 2 (FOXP3A2); с делецией домена, кодируемого экзоном 7 (FOXP3A7); и с одновременной делецией доменов, кодируемых экзонами 2 и 7 (FOXP3A2A7) [10-12]. Так как мыши не страдают аллергическими заболеваниями, резонно предположить, что функциональные особенности Трег при аллергических заболеваниях у человека определяются именно неполными изоформами молекулы FOXP3.
К настоящему времени установлена функциональная значимость доменов молекулы FOXP3, кодируемых экзонами, которые удаляются при альтернативном сплайсинге. Так, экзон 2 кодирует домен молекулы FOXP3, ответственный за связывание транскрипционных факторов семейства RORa и RORyt [13,14], которые в свою очередь индуцируют дифференци-ровку ТЫ7-клеток, обладающих провоспалительными свойствами. Экзон 7 кодирует последовательность, ответственную за димеризацию молекулы FOXP3, и ее отсутствие нарушает супрессорную функцию Трег [12,15]. Важной особенностью молекул FOXP3 с делецией продуктов экзонов 2 и 7 является их преимущественная локализация внутри ядра, что обусловлено утерей последовательностей, отвечающих за экспорт из ядра, расположенных в областях, кодируемых экзонами 1/2 и 6/7 [16]. При этом было показано, что активация наивных CD4+CD25- Т-клеток приводит к накоплению FOXP3 в основном в цитоплазме этих клеток в отличие от преимущественной локализации внутри ядра у CD4+CD25+ Трег [16]. С точки зрения функционирования FOXP3 в качестве транскрипционного активатора и супрессора [17], представляется весьма важным его нахождение внутри ядра. Следовательно, можно предположить, что у человека именно молекула FOXP3A2, обладающая супрессорной функцией и располагающаяся преимущественно в ядре, является основной изоформой, определяющей функциональную активность Трег.
Исходя из предположения о связи функциональной активности Трег с изоформами экспрессируемых молекулы FOXP3, а также учитывая неоднозначность ранее полученных данных о количественном содержании Трег, уровне экспрессии FOXP3 и возможное влияние аллерген-специфической
ORIGINAL ARTICLE
иммунотерапии (АСИТ) на функциональное состояние Трег, мы решили оценить не только численность и долю Трег в периферической крови, но и уровень экспрессии изоформ молекулы FOXP3, отличающихся по наличию экзона 2, у пациентов с сезонным АР, до и после проведения АСИТ методом проточной цитометрии.
Материал и методы
В исследовании приняли участие 38 пациентов с аллергическим ринитом и риноконъюнктивитом - 23 мужчины, 15 женщин, медиана возраста 32,5 (26-46) года, и 24 здоровых донора - 16 мужчин, 8 женщин, медиана возраста 33 (24-50) года.
Материалом для исследования служила периферическая кровь. Забор крови производили в пробирки с антикоагулянтом. Клетки подсчитывали на гемоанализаторе по общепринятой методике. Выделение мононуклеаров периферической крови (МНПК) и последующий анализ выполняли в течение последующих 6 ч.
МНПК выделяли центрифугированием в градиенте плотности фикола (1,077 г/см3). Клетки суспензировали в PBS с
1 % BSA и 0,01 % NaN3, затем инкубировали с моноклональ-ными антителами (МАТ) к поверхностным маркерам в том же буфере в течение 30 мин при 4 °С, после чего отмывали и пермеабилизировали в течение 40 мин буфером «Foxp3 Fixation/Permeabilization Buffer» (eBioscience) согласно методическим указаниям фирмы. Клетки отмывали и инкубировали в течение 90 мин при 4 °С в темноте с МАТ против FOXP3, снова отмывали и сразу (без фиксации) анализировали на проточном цитометре. Учитывая минорность фракции Трег, для уменьшения ошибки анализировали не менее
2 -105 клеток, попадающих в гейт лимфоцитов. Лазерную ци-тометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo.
Использовали МАТ, меченные различными флуорох-ромами - FITC (флуоресцеина изотиоцианат), PE (фи-коэритрин), APC (аллофикоцианин), PerCP-eFluor710 (перидинин-хлорофилл-протеин-eFluor710) и PE-Cy7 (фикоэритрин-цианин 7). Использовали следующее сочетание МАТ фирмы «eBioscience» (препараты для изотипи-ческих контролей той же фирмы): CD3-PE-Cy7, CD4-FITC, CD25-PerCP-eFluor710, F0XP3(PCH101)-APC, F0XP3(150D/ E4)-PE. Особенностью данной методики является специфичность МАТ против молекулы FOXP3. МАТ клона PCH101 распознают эпитоп молекулы FOXP3, кодируемый экзо-ном 1, иначе говоря все изоформы молекулы, а МАТ клона 150D/E4 - эпитоп, кодируемый экзоном 2, т.е. только молекулы FOXP3-FL и FOXP3A7. При сочетании данных МАТ их одновременное связывание с клеткой указывает на наличие в клетке целой молекулы FOXP3, а при связывании только МАТ клона PCH101 - на экспрессию в клетке исключительно изоформ, лишённых экзона 2. Разработанный нами ранее [18] алгоритм гейтирования для определения Трег, экспрессирую-щих различные изоформы молекулы FOXP3, представлен на рис. 1 а, д-ж. В качестве отрицательного контроля при выставлении гейтов для FOXP3+-клеток использовали субпопуляцию CD3-клеток, заведомо не экспрессирующую молекулу FOXP3 (см. рис. 1 а-г).
Для определения мРНК генов GATA3, TBX21, RORC и FOXP3 проводили ПЦР в режиме «реального времени» с обратной транскрипцией.
Выделение РНК из МНПК осуществляли по методу Хом-чинского [19] с использованием реактива TRI Reagent («Sigma») в соответствии с протоколом производителя. Реакцию обратной транскрипции ставили с помощью набора Rever-tAid First Stand cDNA Syntesis Kit («Thermo Fisher Scientific»). После получения кДНК проводили ПЦР в режиме «реально-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
го времени» с использованием набора реактивов TaqMan Universal RT-PCR Master Mix, праймерами GATA3 (Hs00231122_m1), TBX21(Hs00894392_m1), RORC (Hs01076112_m1) и FOXP3, определяющим полную молекулу FOXP3 (FOXP3_1 = Hs01092117_ ml, FOXP3_2 = Hs00203958_m1) («Thermo Fisher Scientific»).
Для расчета относительных количеств исследуемых РНК использовали сравнительный метод [20]. Уровень экспрессии мРНК исследуемых генов определяли относительно экспрессии мРНК ß2-микроглобулина.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием методов непараметрического анализа. Показатели представляли в виде Ме (L-H), где Ме - медиана, L - нижний квартиль, Н - верхний квартиль. Для сопоставления двух независимых выборок по количественным признакам использовали ü-критерий Манна-Уитни. Для анализа связи различий между связанными выборками применяли критерий Вилкоксона. Различие групп считали статистически значимым при p < 0,05. Обработку выполняли в программном пакете StatSoft Statistica 12.0.
Результаты и обсуждение
Изначально было исследовано 38 пациентов, страдающих сезонным аллергическим ринитом или риноконъюнктивитом (АР/АРК) с сенсибилизацией к аллергенам из пыльцы деревьев, диагностируемым на протяжении как минимум двух последних лет вне зависимости от наличия у них бронхиальной астмы. Диагноз подтверждался анамнезом и положительными скарификационными тестами с пыльцевыми аллергенами. Скрининг пациентов осуществлялся вне сезона палинации. Для проведения АСИТ случайным образом было отобрано 19 пациентов - 10 мужчин, 9 женщин, медиана возраста 33 (28-46) года, что по возрасту и полу соответствовало группе здоровых доноров. Им был проведен 1 курс АСИТ классическим методом водно-солевыми экстрактами из смеси пыльцы деревьев («Микроген») подкожно по ускоренной схеме до суммарной дозы аллергена не менее 6000 PNU. Забор крови проводили трехкратно: 1) в период скрининга (до АСИТ); 2) после окончания курса АСИТ, но до сезона палинации (после АСИТ); 3) после курса АСИТ по окончании сезона палинации (после сезона палинации).
У всех пациентов с АР как до проведения АСИТ, так и после, при сравнении с показателями группы здоровых доноров не было выявлено никаких отличий по количеству лейкоцитов, лимфоцитов и CD4+ Т-клеток в периферической крови (табл. 1).
При исследовании уровня экспрессии мРНК транскрипционных факторов, определяющих Th1/Th2 поляризацию иммунного ответа (табл. 2), в группе пациентов с АР было выявлено снижение уровня экспрессии мРНК как GATA3 (в 1,1 раза), так и TBX21 (в 1,4 раза) и увеличение соотношения GATA3/TBX21 в 1,5 раза относительно показателей здоровых людей. В группе пациентов, отобранных для проведения АСИТ, данная тенденция сохранилась, а соотношение GATA3/ TBX21 уже в 2,1 раза превышало показатель здоровых людей, и отличие стало статистически значимым, что подтвердило наличие №2-дисбаланса у пациентов с АР до проведения АСИТ. После проведения АСИТ соотношение GATA3/TBX21 снизилось и перестало статистически значимо отличаться от показателя нормы, не достигая последней, но отражая положительный эффект от проведенной терапии, который сохранялся до окончания сезона палинации. Также у пациентов с АР и проведенной АСИТ по окончании сезона палинации
Рис. 1. Алгоритм гейтирования при цитометрическом анализе регуляторных Т-клеток на примере МНПК из группы здоровых доноров [18]. а - лимфоциты среди МНПК периферической крови, б—г - выставление FOXP3+ гейтов по CD3-клеткам, заведомо не экспрессирующим молекулу FOXP3: CD3-клетки среди лимфоцитов (б); выставление FOXP3(PCH101)+ гейта по CD3-клеткам (в); выставление FOXP3(150D/E4)+ гейта по CD3- клеткам (г).
д—ж - определение Трег, экспрессирующих различные изоформы молекулы FOXP3: CD4+Т-клетки среди лимфоцитов (д); CD25+FOXP3(PCH101)+- все Трег среди CD4+ Т-клеток (е); FOXP3(150D/E4)+- FOXP3-FL Трег среди всех Трег (ж). Сплошные стрелки показывают алгоритм гейтирования. Прерывистые двунаправленные стрелки показывают соответствие выставленных гейтов для CD3" и CD3+4+ -клеток.
было отмечено снижение экспрессии мРНК транскрипционного фактора RORC, определяющего дифференцировку провоспалительных ТЫ7-клеток, что так же можно расценивать в качестве положительного (противовоспалительного) эффекта от проведенной терапии. Анализ уровня экспрессии мРНК, кодирующей полную молекулу РОХР3, не показал статистически значимых изменений по сравнению со здоровыми донорами.
При цитометрическом исследовании у всех пациентов с АР было выявлено достоверное снижение в периферической крови в 1,5 раза доли Трег (CD25+FOXP3+) среди CD4+ Т-клеток (табл. 3) и в 1,3 раза их количества (табл. 4) относительно показателей здоровых доноров. Однако в группе,
Таблица 1
Абсолютное количество клеточных популяций (10' клеток/л) в периферической крови пациентов с аллергическим ринитом и здоровых доноров
Группа | Лейкоциты | Лимфоциты | CD4+ Т-клетки
Доноры 6,3 (5,5-7,6) 1,9 (1,7-2,7) 0,8 (0,6-1,0)
АР (все) 5,9 (5,4-7,3) 2,0 (1,6-2,5) 0,8 (0,6-1,1)
До АСИТ 6,3 (5,4-7,3) 2,1 (1,7-2,5) 0,9 (0,6-1,1)
После АСИТ 5,9 (5,6-6,8) 2,0 (1,8-2,5) 0,9 (0,7-1,1)
После сезона 5,6 (5,4-7,9) 2,0 (1,6-2,3) 0,8 (0,6-1,0)
палинации
ORIGINAL ARTICLE
Таблица 2
Уровень экспрессии мрнК GATA3, ТВХ21, RORC и FOXP3 в МнПК пациентов с аллергическим ринитом и здоровых доноров
Группа GATA3 TBX21 RORC FOXP3 GATA3/TBX21
Доноры 5,68 1,39 0,54 1,03 3,6
(3,95-8,37) (0,60-2,21) (0,32-1,09) (0,68-1,57) (3,0-6,6)
АР (все) 5,16 0,99 0,36 0,75 5,3
(3,74-8,11) (0,71-1,52) (0,28-0,65) (0,51-1,27) (3,7-9,2)
До АСИТ 5,13 0,79 0,43 1,21 7,7*
(4,17-8,21) (0,46-1,24) (0,20-0,55) (0,54-1,33) (6,5-10,3)
После АСИТ 4,75 0,78 0,37 0,78 6,9
(3,60-8,86) (0,50-1,13) (0,22-0,56) (0,51-1,46) (4,8-12,1)
После 5,06 0,91 0,25* 0,9 6,7
палинации (4,10-7,11) (0,67-1,19) (0,21-0,33) (0,74-0,97) (4,5-8,1)
Примечание. * - p < 0,05 отн. доноров.
Таблица 3
Относительные показатели Трег периферической крови пациентов с аллергическим ринитом и здоровых людей из группы возрастного контроля (%)
Группа
Доля Трег среди CD4+ Т-клеток
Доноры
АР (все)
До АСИТ
После АСИТ
После сезона палинации
3,5 (2,7-4,3) 2,3* (1,9-3,2) 2,4* (1,8-3,1)
2.5 (2,0-2,9)
2.6 (2,0-3,3)
Примечание. * - р < 0,05 отн. доноров; * - р < 0,05 отн. показателей до лечения.
Таблица 4
Абсолютное количество регуляторных Т-клеток (106 клеток/л) в периферической крови пациентов с аллергическим ринитом и здоровых доноров
Группа
Трег
FOXP3-FL Трег FOXP3A2 Трег
Доноры АР (все) До АСИТ После АСИТ
26,4 (21,0-36,5) 19,8* (13,9-27,3) 20,8 (15,4-31,2) 23,1 (13,6-33,7)
9,3 (5,7-14,6) 7,7 (4,9-10,2) 8,6 (6,5-11,8) 10,6 (5,7-14,1)
17,4 (11,9-23,0) 11,7* (8,4-16,8) 11,7* (9,5-17,6) 10,2 (8,1-19,1)
После сезона 22,2 (11,0-32,1) 6,2 (3,1-9,0) 10,8 (8,3-23,5) палинации
Примечание. * - р < 0,05 отн. доноров.
отобранной для проведения АСИТ, уменьшение абсолютных показателей перестало быть статистически значимым, возможно, вследствие двукратного сокращения объема выборки. Снижение количества Трег в основном было обусловлено уменьшением численности Трег, экспрессирующих только изоформу FOXP3, лишенную продукта экзона 2 (ГОХР3Л2 Трег). Данный показатель был в 1,5 раза ниже, чем в группе здоровых доноров, и не изменился после сокращения объема выборки при формировании группы для проведения АСИТ (табл. 4). Таким образом, было показано, что для АР характерно снижение количества и доли Трег в периферической крови в основном за счет FOXP3Л2 Трег.
После проведения АСИТ и по окончании сезона палинации уменьшение доли Трег среди CD4+ Т-клеток, их абсолютного количества и количества FOXP3Л2 Трег по сравнению с группой возрастного контроля перестало быть статистически значимым (табл. 3 и 4), что было обусловлено увеличением разбросов данных показателей. Однако наиболее яр-
ким и статистически достоверным фактом стало уменьшение почти в 2 раза доли Трег, экспресси-рующих полную молекулу FOXP3 (FOXP3-FL), у пациентов, прошедших АСИТ, по окончании сезона палинации (рис. 2).
Подводя итог проведенному исследованию, можно констатировать, что для пациентов с АР характерно снижение в периферической крови доли и абсолютного количества Трег в основном за счет FOXP3Л2 Трег, что, возможно, обуславливает снижение их функциональной активности. При этом уменьшение доли FOXP3-FL Трег (или относительное накопление FOXP3Л2 Трег) у пациентов с АР после проведения АСИТ, особенно выраженное по окончании сезона палинации, должно свидетельствовать об относительном усилении функциональной активности Трег. Выдвинутые предположения основываются на литературных данных о молекуле FOXP3-FL как функционально менее активной в качестве транскрипционного фактора и локализующейся преимущественно в цитоплазме клетки.
Данную гипотезу также подтверждают ранее проведенные нами и другими исследователями работы по изучению экспрессии изоформ молекул FOXP3 при дифференциров-ке тимоцитов [21] и при различных заболеваниях человека [18,22,23]. В данных работах уровень экспрессии изоформ молекулы FOXP3 определяли аналогичным способом с помощью МАТ, распознающих дифференцировано участки молекулы FOXP3, кодируемые экзоном 1 или 2. Так, мы показали, что в тимусе доля тимоцитов, экспрессирующих FOXP3 -FL, снижалась с 65% на стадии дубль-положительных CD25+FOXP3+ тимоцитов до 33% у сингл-положительных CD4+ Трег [21], т.е. функциональное созревание Трег в тимусе сопровождалось накоплением FOXP3Л2. При множественной миеломе, представляющей онкологические заболевания, мы обнаружили дальнейшее накопление FOXP3Л2 Трег, доля которых значимо превышала уровень группы возрастного контроля даже в случае достижения ремиссии и нормализации общего количества Трег, что указывало на патогенетическую роль этой изоформы при множественной миеломе и, возможно, её более выраженную по сравнению с FOXP3-FL функциональную активность [22].
Обратную ситуацию наблюдали при изучении хронических воспалительных заболеваниях кишечника [23] и миело-
% 60
Н Доноры □ До АСИТ
| После АСИТ
После сезона палинации
30
10
Рис. 2. Доля Трег, экспрессирующих FOXP3-FL, в периферической крови пациентов с аллергическим ринитом и здоровых доноров.
* -р < 0,05 отн. доноров; ** -р < 0,05 отн. показателя до АСИТ.
50
40
20
0
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
диспластического синдрома [18]. Интерес к изучению Трег при миелодиспластическом синдроме обусловлен равной возможностью как опухолевой трансформации заболевания, так и развитием аутоиммунных нарушений, что требует разнонаправленного функционального состояния Трег. Тем не менее, нами было показано, что для всех пациентов с миелодиспла-стическим синдромом характерно снижение количества и доли Трег в периферической крови, также, как и в случае АР, в основном за счет FOXP3 А2 Трег [18]. При исследовании же пациентов с неспецифическим язвенным колитом и болезнью Крона было обнаружено, что в мезентериальных лимфатических узлах при общем увеличении количества Трег все они экспрессировали обе изоформы молекулы FOXP3 [23] или, исходя из принятой в данной статье терминологии, можно говорить об отсутствии FOXP3A2 Трег. Хотя изначально авторы предполагали, что ТЫ7-поляризация иммунного ответа при хронических воспалительных заболеваниях кишечника может быть обусловлена накоплением FOXP3A2 Трег ввиду их неспособности связывать RORgt, но, по всей видимости, способность молекулы FOXP3A2 накапливаться в ядре играет более важную роль при супрессии иммунного ответа, чем неспособность ограничивать экспрессию IL-17.
Таким образом, результаты настоящего исследования указывают на уменьшение количества и снижение функциональной активности Трег периферической крови при аллергическим рините/риноконъюнктивите. Функциональная активность Трег частично корректируется после проведения АСИТ - эффект имеет долгосрочный характер, сохраняясь по окончании сезона палинации.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕрАТУрА (пп. 2--17, 19--20, 23 см. в references)
1. Ярилин А.А. Транскрипционные регуляторы дифференцировки Т-хелперов. Иммунология. 2010; 31(3): 152-66. 18. Дудина Г. А., Донецкова А.Д., Литвина М.М., Митин А.Н. анализ экспрессии изоформ молекулы FOXP3 регуляторными Т-клетками периферической крови при миелодиспластическом синдроме. Иммунология. 2018; 39(2-3): 123-8.
21. Митин А.Н., Литвина М.М., Шарова Н.И., Селиваненко В.Т., Мартаков М.А., Латышев С.В., Ярилин А.А. Экспрессия фактора FOXP3 и соотношение его изоформ в T-клетках на разных стадиях дифференцировки. Иммунология. 2012; 33(4): 172-6.
22. Митин А.Н., Литвина М.М., Митина Т.А, Голенков А.К., Ярилин А.А. анализ экспрессии молекулы FOXP3 и ее изоформ CD4+ Т-клетками периферической крови при различных формах течения множественной миеломы методом проточной цитоме-трии. Иммунология. 2014; 35(44): 215-9.
references
1. Yarilin A.A. Transcriptional regulators of T helper differentiation. Immunologiya. 2010; 31(3): 152-66. (in Russian)
2. Palmer C., Mulligan J.K., Smith S.E., Atkinson C. The role of regulatory T cells in the regulation of upper airway inflammation. Am. J. Rhinol. Allergy. 2017; 31(6): 345-51.
3. Huang X., Chen Y., Zhang F., et al. Peripheral Th17/Treg cell-mediated immunity imbalance in allergic rhinitis patients. Braz J. Otorhi-nolaryngol. 2014; 80: 152-5.
4. Han D., Wang C., Lou W., et al. Allergen-specific IL-10-secreting type I T regulatory cells, but not CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells,
are decreased in peripheral blood of patients with persistent allergic rhinitis. Clin. Immunol. 2010; 136: 292-301.
5. Genc S., Eroglu H., Kucuksezer U.C., et al. The decreased CD4+CD25+FoxP3+ T cells in nonstimulated allergic rhinitis patients sensitized to house dust mites. J. Asthma. 2012; 49: 569-74.
6. Sogut A., Yilmaz O., Kirmaz C., et al. Regulatory-T, T-helper 1, and T-helper 2 cell differentiation in nasal mucosa of allergic rhinitis with olive pollen sensitivity. Int. Arch. Allergy Immunol. 2012; 157: 349-53.
7. Sun R., Tang X.Y., Yang Y. Immune imbalance of regulatory T/type 2 helper cells in the pathogenesis of allergic rhinitis in children. J. Laryngol. Otol. 2016; 130: 89-94.
8. Malmhall C., Bossios A., Pullerits T., Lo" tvall J. Effects of pollen and nasal glucocorticoid on FOXP3+, GATA-3+ and T-bet+ cells in allergic rhinitis. Allergy. 2007; 62: 1007-13.
9. Sakaguchi S., Yamaguchi T., Nomura T., Ono M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 2008; 133(5): 775-87.
10. Smith E.L., Finney H.M., Nesbitt A.M., Ramsdell F., Robinson M.K. Splice variants of human FOXP3 are functional inhibitors of human CD4+ T-cell activation. Immunology. 2006; 119(2): 203-11.
11. Kaur G., Goodall J.C., Jarvis L.B., Hill Gaston J.S. Characterisation of Foxp3 splice variants in human CD4+ and CD8+ T cells - Identification of Foxp3delta7 in human regulatory T cells. Mol. Immunol. 2010; 48(1-3): 321-32.
12. Chae W.J., Henegariu O., Lee S.K., Bothwell A.L. The mutant leu-cine-zipper domain impairs both dimerization and suppressive function of Foxp3 in T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103(25): 9631-6.
13. Du J., Huang C., Zhou B., Ziegler S.F. Isoform-specific inhibition of ROR alpha-mediated transcriptional activation by human FOXP3. J. Immunol. 2008; 180(7): 4785-92.
14. Ichiyama K., Yoshida H., Wakabayashi Y., Chinen T., Saeki K., et al. Foxp3 inhibits RORgammat-mediated IL-17A mRNA transcription through direct interaction with RORgammat. J. Biol. Chem. 2008; 283(25): 17003-8.
15. Mailer R.K., Falk K., Rotzschke O. Absence of leucine zipper in the natural FOXP3Delta2Delta7 isoform does not affect dimerization but abrogates suppressive capacity. PLoS One. 2009; 4(7): e6104.
16. Magg T., Mannert J., Ellwart J.W., Schmid I., Albert M.H. Subcellular localization of FOXP3 in human regulatory and nonregulatory T cells. Eur. J. Immunol. 2012; 42(6): 1627-38.
17. Zheng Y., Josefowicz S.Z., Kas A., Chu T.T., Gavin M.A., Rudensky A.Y. Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 2007; 445(7130): 936-40.
18. Dudina G.A., Donetskova A.D., Litvina M.M., Mitin A.N. Analysis of FOXP3 isoforms expression by regulatory T cells from peripheral blood in myelodysplastic syndromes. Immunologiya. 2018; 39(2-3): 123-8. (in Russian)
19. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987; 162(1): 156-9.
20. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001; 25(4): 402-8.
21. Mitin A.N., Litvina M.M., Sharova N.I., Selivanenko V.T., Marta-kov M.A., Latyshev S.V. Yarilin A.A. FOXP3 expression and its isoform ratio during T cells differentiation. Immunologiya. 2012; 33(4): 172-6. (in Russian)
22. Mitin A.N., Litvina M.M., Mitina T.A., Golenkov A.K., Yarilin A.A. Flow cytometry analysis of FOXP3 and its isoforms expression by CD4+ T cells from peripheral blood in various forms of multiple myeloma. Immunologiya. 2014; 35(44): 215-9. (in Russian)
23. Lord J.D., Valliant-Saunders K., Hahn H., Thirlby R.C., Ziegler S.F. Paradoxically increased FOXP3+ T cells in IBD do not preferentially express the isoform of FOXP3 lacking exon 2. Dig. Dis. Sci. 2012; 57(11): 2846-55.
Поступила 10.08.18 Принята в печать 16.11.18
