CC BY
110
ИЗВЕСТИЯ
ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 17 (21) 2010
IZVESTIA
PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 17 (21) 2010
УДК 577.156
ВЛИЯНИЕ ПОТРЕБЛЕНИЯ ЭТАНОЛА НА АКТИВНОСТЬ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Н И АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА В НЕКОТОРЫХ ОТДЕЛАХ МОЗГА КРЫС С РАЗЛИЧНОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К СТРЕССУ
© А. Н. ВЕРНИГОРА
Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского, кафедра химии и теории и методики обучения химии e-mail: [email protected]
Вернигора А. Н. - Влияние потребления этанола на активность карбоксипептидазы H и ангиотензинпревра-щающего фермента в некоторых отделах мозга крыс с различной устойчивостью к стрессу // Известия ПГПУ им. В. Г. Белинского. 2010. № 17 (21). С. 101-103. - Изучено влияние потребления этанола на активность карбоксипептидазы H и ангиотензинпревращающего фермента в отделах мозга устойчивых и предрасположенных к стрессу крыс. Обнаружено, что потребление этанола вызывает повышение активности карбоксипептидазы Hв гипофизе и стриатуме обеих групп и в гипоталамусе у устойчивых к стрессу, но снижение активности ангиотензинпревращающего фермента в гипофизе обеих групп и в стриатуме у устойчивых к стрессу животных. Обсуждается роль исследованных ферментов в формировании алкогольной зависимости.
Ключевые слова: карбоксипептидаза Н, ангиотензинпревращающий фермент, этанол.
Vernigora A. N. - Effect of ethanol administration on carboxypeptidase H and angiotensin converting enzyme activities in some brain regions of the rats with different stability to stress // Izv. Penz. gos. pedagog. univ.
im. i. V. G. Belinskogo. 2010. № 17 (21). P. 101-103. - The effect of ethanol administration on carboxypeptidase H and angiotensin converting enzyme activities in pituitary gland, hypotalamus and striatum of rats with different stability to stress was study. Ethanol administration was caused the increasing of the carboxypeptidase H activity in pituitary gland and striatum of both group and hypothalamus of stable animals, but decreasing of the angiotensin converting enzyme activity in pituitary gland of both group and striatum of stable animals. The role of the enzymes in alcohol dependence formation are discussed.
Keywords: carboxypeptidase Н, angiotensin converting enzyme, ethanol.
Характер влияния этанола на организм зависит от устойчивости животных к стрессу [8]. Важная роль в ответе на этанол принадлежит опиоидным и стресс-пептидам [2, 8, 10, 13]. Уровень этих пептидов контролируется протеолитическими ферментами, которые участвуют как в образовании, так и в деградации нейропептидов [6, 14]. В процессинге предшественников опиоидных и стресс-пептидов участвует карбокси-пептидаза Н (КФ 3.4.17.10) - экзопептидаза, которая удаляет препятствующие проявлению специфической биологической активности остатки аргинина и лизина с С-конца пропептидов [6]. В инактивации указанных пептидов участвует ангиотензинпревращающий фермент (КФ 3.4.15.1) - дипептидилкарбоксипептидаза, отщепляющая дипептиды с С-конца биологически активных пептидов [14]. Показано, что активность этих ферментов отличается у устойчивых и предрасположенных к стрессу животных [4], а также изменяется при потреблении этанола [3, 5].
Целью данной работы являлось изучение влияние этанола на активность карбоксипептидазы н и ангиотензинпревращающего фермента в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме у крыс с различной устойчивостью к стрессу.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Опыты проводили на самцах белых беспородных крыс весом 150-200 г. В работе использовали две группы животных: устойчивые и предрасположенные к эмоциональному стрессу, которые отбирали по результатам тестирования в «открытом поле» [1]. Каждая из групп делилась на две подгруппы: опытная -животные в течение 10 суток получали с водой для питья этанол в дозе 5 г/кг веса, и контрольная. Животных декапитировали через 18 ч после окончания воздействия.
Активность карбоксипептидазы Н определяли по освобождению дансил-Phe-Leu из дансил-Phe-Leu-
ИЗВЕСТИЯ ПГПУ им. В. Г. Белинского » Естественные науки »
№ 17 (21) 2010 г.
Arg при рH 5,6 как активность, стимулируемую ионами кобальта (II) [7]. Препараты фермента (2QQ мкл) инкубировали с 2QQ мкл 2,5 мМ CоSО4 в 5Q мМ натрий-ацетатном буфере, рH 5,6, или 2QQ мкл буфера 8 мин при 37 °С. Затем в пробы вносили по 1QQ мкл раствора дансил-Phe-Leu-Arg (концентрация в пробе 42 мкМ) в том же буфере. Реакцию (3Q мин, 37 °С) останавливали прибавлением 5Q мкл 1 М HCl. Продукт реакции (дансил-Phe-Leu) экстрагировали хлороформом и измеряли флюоресценцию хлороформной фазы (1 = 36Q нм, 1 = 53Q нм). Активность фермента определяли как разность в скорости накопления дансил-Phe-Leu в пробах, содержащих и не содержащих ионы кобальта и выражали в нМ дансил-Phe-Leu, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка.
Активность ангиотензинпревращающего фермента определяли по образованию Gly-Arg из карбобензокси-Gly-Gly-Arg при рH 7,6 как активность, ингибируемую каптоприлом [9]. Препарат фермента (4Q мкл) смешивали с 2Q мкл 35 мкМ каптоприла в 1QQ мМ Трис-HCl буфере, рH 7,6, или 2Q мкл буфера и инкубировали 8 мин при 37 °С. Реакцию начинали прибавлением 1Q мкл раствора кбз-Gly-Gly-Arg в вышеуказанном буфере (конечная концентрация в пробе 5 мМ). Через 6Q мин реакцию останавливали прибавлением 3Q мкл 5 % трихлорук-сусной кислоты. Пробы центрифугировали 3Q мин при 4QQQ об/мин. Отбирали 6Q мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося Gly-Arg нин-гидриновым методом [11]. Пробы колориметрировали при 59Q нм. Активность ангиотензинпревращающего фермента определяли как разность в оптической плотности проб не содержащих и содержащих каптоприл и
выражали в нмоль Gly-Arg, образовавшегося за 1 мин на 1 мг белка.
Белок определяли методом Лоури [12].
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента.
результаты и обсуждение
Активность карбоксипептидазы H при потреблении этанола в гипофизе и стриатуме повышалась и у устойчивых, и у предрасположенных к стрессу животных, в гипоталамусе достоверное повышение активности фермента обнаруживалось только у устойчивых к стрессу крыс (табл. 1). Если в гипоталамусе и стриатуме под воздействием этанола различие в активности фермента у животных с различной устойчивостью к стрессу нивелировалось, то в гипофизе это различие появлялось. При этом в гипоталамусе и стриатуме активность фермента повышалась более существенно у устойчивых, а в гипофизе - у предрасположенных животных.
Потребление этанола вызывало снижение активности ангиотензинпревращающего фермента в гипофизе у обеих групп животных, в стриатуме - только у устойчивых животных (табл. 2). У обеих групп в гипоталамусе и в стриатуме у предрасположенных животных достоверных изменений активности фермента не обнаруживалось. При этом, как и в случае карбок-сипептидазы H, в гипоталамусе нивелировалось различие в активности между животными с различной устойчивостью к стрессу, а в стриатуме это различие, напротив, появлялось. В гипофизе при этом соотношение между активностью у устойчивых и предрасположенных животных менялось на противоположное.
Таблица 1
Влияние потребления этанола на активность карбоксипептидазы Н у устойчивых и предрасположенных к стрессу крыс (нмоль дансил-Phe-Leu, образовавшегося за 1 мин на 1 мг белка, М ± т, п = 5-6)
Отдел Устойчивые Предрасположенные
Контроль Этанол Контроль Этанол
Гипофиз 8,44±Q,Q5 14,11±Q,67* 8,62±Q,37 18,1Q±1,39*,**
Гипоталамус Q,93±Q,Q6 1,37±Q,13* 1,2Q±Q,1Q** 1,21±Q,Q9
Стриатум Q,62±Q,Q3 1,18±Q,13* Q,88±Q,Q8** 1,45±Q,16*
Здесь и в таблице 2:
*, - р < 0,05 по отношению к контрольным и устойчивым к стрессу животным соответственно.
Таблица 2
Влияние потребления этанола на активность ангиотензинпревращающего фермента у устойчивых и предрасположенных к стрессу крыс (нмоль гли-арг, образовавшегося за 1 мин на 1 мг белка, М ± т, п = 5-6)
Отдел Устойчивые Предрасположенные
Контроль Этанол Контроль Этанол
Гипофиз 22,14±1,62 2,89±Q,48* 13,22±Q,9Q** 5,66±2,27*,**
Гипоталамус 3,16±Q,16 2,95±,Q,7Q 4,Q8±Q,34 3,62±Q,12
Стриатум 15,46±1,11 6,39±1,67* 13,13±Q,74 15,13±Q,85**
Таким образом, потребление этанола по разному влияет на активность исследованных ферментов. Если при воздействии этанола активность карбок-сипептидазы H повышалась, то активность ангио-тензинпревращающего фермента снижалась. Повышение активности карбоксипептидазы H, вероятно, способствует ускорению образования активных нейропептидов из неактивных предшественников, тогда как снижение активности ангиотензинпревращающе-го фермента, по-видимому, способствует снижению скорости инактивации пептидов. То есть, активность обоих ферментов при потреблении этанола изменяется в направлении, способствующем повышению уровня нейропептидов, обладающих биологической активностью. Это соответствует имеющимся данным о повышении уровня энкефалинов и стресс-пептидов под влиянием этанола [2, 8, 13].
Следует отметить существование отличий в изменениях активности обоих ферментов у животных с различной устойчивостью к стрессу при потреблении этанола. Известно, что изменения уровня ряда нейропептидов в случае воздействия этанола зависят от устойчивости животных к стрессу [8]. Возможно, существует взаимосвязь между изменением активности исследованных ферментов и некоторых нейропептидов у крыс с различной устойчивостью к стрессу.
Шиболее существенные изменения активности обоих ферментов наблюдались в гипофизе - отделе, секретирующем стресс-пептиды, и стриатуме - отделе, отличающемся очень высоким уровнем энкефалинов, что соответствует представлениям о вовлечении этих ферментов в обмен адренокортикотропина и энкефа-линов [6, 14]. Вместе с тем, в гипоталамусе - отделе, в котором активность изученных ферментов практически не менялась, содержание вышеназванных пептидов значительно ниже, чем в гипофизе и стриатуме.
Интересно отметить, что в стриатуме при повышении активности карбоксипептидазы H у обеих групп животных наблюдалось снижение активности ангиотензинпревращающего фермента только у устойчивых животных. Известно, что у предрасположенных к стрессу животных алкогольная зависимость формируется легче, чем у устойчивых [8]. Кроме того, формирование алкогольной зависимости сопровождается развитием дефицита энкефалинов в стриатуме [2, 13]. Выявленные изменения активности исследуемых ферментов в стриатуме могут способствовать повышению уровня энкефалинов в нём у устойчивых животных и, следовательно, более медленному формированию зависимости от этанола. Таким образом, представляется возможным, что изменения активности карбоксипеп-тидазы H и ангиотензинпревращающего фермента могут лежать в основе молекулярных механизмов формирования алкогольной зависимости.
список литературы
1. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. - М.: Высшая школа, 1991. - 399 с.
2. Буров Ю. В., Ведерникова H. H. Шйрохимия и фармакология алкоголизма. - М.: Медицина, 1985. -24Q с.
3. Вернигора А. H., Генгин М. Т. Влияние этанола на активность карбоксипептидазы H в гипофизе и некоторых отделах головного мозга крыс при различных стрессирующих воздействиях // Физиол. журн. 1993. 79. № 3. С. 34-38.
4. Вернигора А. H., Генгин М. Т., Акишин H. H. Об участии некоторых ферментов обмена нейропептидов в механизмах эмоционального стресса // Физиол. журн. 1995. 81. № 5. С. Ю3-112.
5. Вернигора А. H., Акишин H. H., Генгин М. Т. Влияние этанола, диазепама и резерпина на активность ан-гиотензинпревращающего фермента и карбоксипеп-тидазы H в норме и при стрессе // Вопр. мед. химии // 1996. 42. № 2. С. 127-Ш.
6. Fricker L. D. Peptide processing exopeptidases: amino- and carboxypeptidases involved with peptide biosynthesis // Peptide biosynthesis and processing (Fricker L. D. ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1991. - P. 199-23Q.
7. Fricker L. D., Snyder S. H. Enkephalin convertase: purification and charasterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenall chromaffin granules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. 79. P. 3886-389Q.
8. George F. K. A role for brain stress systems in addiction // Neuron. 2QQ8. Ю. N 59 (1). P. 11-34.
9. Hurst P. L., Lovell-Smith C. J. Optimized assay for serum angiotensin-converting enzyme activity // Clin. Chem. 1981. 27. P. 2Q48-2Q52.
Ю. Koob G. F., Le Moal M. Neurobiological mechanisms for opponent motivational processes in addiction // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2QQ8. 363 (15Q7). P. 3113-3123.
11. Lee P. V., Takahashi T. N. An improved colorimetric determination of amino acid with the use of ninhydrin // Analyt. Biochem. 1966. 14. N 1. P. 71-77.
12. Lowry O. H., Rosebrought N. J., Farr A. G., Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. 193. N 1. P. 265-275.
13. Racz I., Schürmann B., Karpushova A. et al. The opioid peptides enkephalin and ß-endorphin in alcohol dependence // Biol. Psychiatry. 2QQ8. 1. N 64 (11). P. 989-997.
14. Scholzen T. E., König S., Fastrich M., Böhm M., Luger T. A. Terminating the stress: peripheral peptidoly-sis of proopiomelanocortin-derived regulatory hormones by the dermal microvascular endothelial cell extracellular peptidases neprilysin and angiotensin-converting enzyme // Endocrinology. 2QQ7. 148. N. 6. P. 2793-28Q5.
