CC BY
87
УДК 577.156
влияние атропина на Активность основных карбоксипептидаз в отделах мозга, надпочечниках и сыворотке крови крыс
В. Б. СОЛОВЬЕВ, г. Р. МАМЫШЕВ Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского
кафедра биохимии
Изучено влияние однократного воздействия атропина на активность основных карбоксипептидаз - ферментов, участвующих в конечной стадии образования биологически активных нейропептидов из предшественников в нервной системе и сыворотке крови крыс. Наблюдалось длительное, сохраняющееся по крайней мере в течение 72 ч снижение активности исследуемых ферментов. Предполагается, что снижение активности исследуемых ферментов может быть одним из механизмов снижения уровня нейропептидов при действии высоких доз атропина.
Холинотропные препараты оказывают свое действие практически на все регуляторные системы. Особый интерес представляет изучение их взаимодействия с пептидергической системой, поскольку нейропептиды участвуют в регуляции разнообразных нейрофизиологических процессов и соматических функций, в том числе тех, которые нарушаются при отравлении холиноблокаторами [1, 2, 3]. Имеется большое количество литературных данных об изменении концентрации опиоидных пептидов в мозге и сыворотке крови животных при действии холинолитиков [4, 5]. Однако молекулярные механизмы действия холинотроп-ных препаратов на уровень биологически-активных пептидов не изучены. Активная форма регуляторных пептидов образуется в результате протеолитического процессинга пропептидов. В конечных стадиях этого процесса, в результате которого образуются биологически активные пептиды, участвуют основные кар-боксипептидазы, в частности карбоксипептидаза Н (КПН, КФ 3.4.17.10), фенилметилсульфонилфто-рид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-КП) [6, 7] и карбоксипептидаза N (КП^ К.Ф. 3.4.17.3). КПН локализована в секреторных везикулах и вовлекается в процессинг предшественников многих регуляторных пептидов [6, 7]. ФМСФ-КП - недавно описанный фермент [7], субстратная специфичность и тканевая локализация которого позволяет предположить возможность его вовлечения в обмен ряда биологически активных пептидов, в особенности опиоид-ных [7]. Однако биологическая роль этого фермента во многом остается не ясной. Карбоксипептидаза N -фермент сыворотки крови, участвующий в обмене многих пептидов - энкефалинов, кининов, ангиотензина и др. [6, 7].
Целью данной работы было изучение активности КПН и ФМСФ-КП в отделах головного мозга и надпочечниках крыс, и активности КПМ в сыворотке крови при однократном введении атропина.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Опыты выполнены на самцах белых беспородных крыс массой 200-300 г. Атропин вводили внутрибрю-шинно в физрастворе в дозе 2,5 мг/кг. Контрольной группе животных вводили равное количество физраствора. Крыс декапитировали через 0.5, 4, 24 и 72 ч после инъекции, извлекали надпочечники, головной мозг и разделяли его на соответствующие отделы, собирали
кровь, отделяли сыворотку. Навески ткани гомогенизировали в 50 мМ натрий ацетатном буфере, содержащем 50 мМ NaCl, рН 5,6, в соотношении 1:50 (вес:объ-ем). В полученном гомогенате определяли активность КПН и ФМСФ-КП флюорометрическим методом L. D. Fricker and S. H. Snyder [8]. Низкомолекулярные нингидринположительные компоненты сыворотки удаляли пропусканием через колонку с сефадексом G-25, затем сыворотку разводили физраствором 1:1.
Активность карбоксипептидазы N определяли по отщеплению Arg от карбоксибензоил-Gly-Arg, как Со2+-активируемую [9, 10]. В данном случае опытные пробы содержали 20 мкл 3,5 мМ CoS04 в 100 мМ трис-HCl, рН=7,6 и 40 мкл сыворотки. Контрольные пробы содержали 30 мкл буфера и 40 мкл сыворотки. Пробы инкубировали 8 мин при 37°С. Затем вносили по 10 мкл карбоксибензоил-Gly-Arg. Пробы инкубировали 120 мин при 37°С. Реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Осадок отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 4000 об/мин. Затем отбирали по 50 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося продукта по приросту свободных аминогрупп нингидриновым методом [11]. Активность ферментов выражали в нмоль продукта в расчете на 1 мин инкубации и 1 мг белка.
Активность КПН оценивали по гидролизу дан-сил-Phe-Ala-Arg при рН 5.6 как ингибируемую высокоспецифичным ингибитором фермента гуаниди-ноэтилмеркаптоянтарной кислотой (ГЭМЯК) [8], ФМСФ-КП по гидролизу дансил-Phe-Leu-Arg при рН 5.6 как ингибируемую ФМСФ [7]. Опытные пробы содержали 50 мкл гомогената и 150 мкл 50 мМ натрий ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl. В контрольные пробы вносили гЭМяК (в случае КПН) и ФМСФ (в случае ФМСФ-КП) в конечной концентрации 1 мкМ и 1 мМ соответственно. Пробы преинкубировали 8 мин при 37oC, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37oC раствора субстрата (концентрация в пробе 42 мкМ), приготовленного на том же буфере и инкубировали в течении 60 мин при 37oC. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl. Для экстракции продукта реакции (дансил-Phe-Ala в случае КПН и дансил-Phe-Leu в случае ФМСФ-КП) к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000об/мин.
Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ-2 при Хех=360 нм и Хеш=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 2 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.
Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ингибитор, и выражали в нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка. Количество белка в пробах определяли по Lowry [12].
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием ^критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Введении атропина в дозе 2,5 мг/кг вызывало снижение активности КПН в гипофизе через 0,5 и 4 ч после инъекции (рис. 1). В обонятельном мозге активность исследуемого фермента снижалась через 24 ч на 55 % и оставалась сниженной спустя 72 ч после введения (на 13 %). В четверохолмии обнаружено снижение активности КПН через 0,5, 24 и 72 ч, при этом максимальное снижение активности фермента (на 55 %) наблюдается через 72 ч после инъекции. В продолговатом мозге активность КПН была снижена через 4 и 72 ч на 45-50 %, тогда как через 0,5 и 24 ч не отличалась от контрольной группы. Введение атропина вызывало снижение активности исследуемого фермента в гипоталамусе во всех исследуемых промежутках времени на 35-40 %. В гиппокампе и стриатуме активность КПН через 0,5 ч снижалась на 30-40 %, через 4 ч на 40-45 % и через 72 ч примерно на 30 %. В надпочечниках достоверное изменение активности отмечено только через 72 ч после введения атропина: снижение на 60 % по отношению к контролю.
Таким образом, введение атропина в дозе 2,5 мг/кг вызывает длительное, сохраняющееся по крайней мере 72 ч, снижение активности КПН во всех отделах мозга и надпочечниках крыс.
Результаты исследования влияния атропина (2,5 мг/кг) на активность фенилметилсульфонилфто-рид-ингибируемой карбоксипептидазы в отделах мозга и надпочечниках крыс представлены на рис. 2.
В гипофизе наблюдалось снижение активности ФМСФ-КП через 0,5 ч на 70 %, а через 4 ч на 95 % по сравнению с контрольной группой. В надпочечниках снижение активности исследуемого фермента наблюдалось спустя те же промежутки времени: через 0,5 ч на 35 % и на 70 % по прошествии 4 ч. В обонятельном мозге активность ФМСФ-КП снижалась по сравнению с контрольными животными на 35 % через 4 и 24 ч. В четверохолмии и стриатуме активность исследуемой карбоксипептидазы через 4 ч была на 30-35 % ниже, чем у контрольной группы. Атропин не оказывал влияния на активность ФМСФ-КП в продолговатом мозге на протяжении всего времени исследования. В гипоталамусе активность фермента снижалась только через 72 ч после инъекции. В гиппокампе активность ФМСФ-КП снижалась в два раза относительно контроля через 0,5 и 24 ч.
Таким образом, введение атропина в дозе 2,5 мг/кг вызывало снижение активности ФМСФ-КП во всех отделах мозга и надпочечниках крыс, кроме продолговатого мозга.
Несмотря на общую тенденцию снижения активности исследуемых ферментов в мозге и надпочечниках при введении атропина, имеют место и некоторые различия в степени снижения активности карбок-сипептидазо-В-подобных ферментов. Так, наиболее существенное снижение активности в гипофизе при действии атропина наблюдалось для ФМСФ-КП - на 75 % через 0,5 ч после инъекции и на 95 % через 4 ч после введения, в то время как для КПН отмечено снижение активности лишь на 30 %. Гипофиз является отделом, синтезирующим и/или секретирующим большой спектр регуляторных пептидов [7, 8]. По-видимому, КПН принадлежит преобладающая роль в процессинге большинства пептидов - тропных гормонов, оксито-цина, вазопрессина, атриального натрийуретического пептида, вещества Р и др. [7, 8]. ФМСФ-КП, вероятно, участвует в процессинге опиоидных пептидов, синтезирующихся в гипофизе - энкефалинов и р-эндорфи-на - уровень которых по данным других авторов [4, 13] значительно снижается при введении атропина. Снижение активности ФМСФ-КП в наших опытах при введении атропина может свидетельствовать о вовлечении данного фермента преимущественно в обмен энкефалинов.
Обращает на себя внимание тот факт, что в надпочечниках наиболее существенное снижение активности отмечено для ФМСФ-КП, в то время как для гипоталамуса и стриатума наиболее выраженные изменения активности наблюдались для КПН. Вероятно, снижение активности ферментов процессинга регуляторных пептидов может быть одним из механизмов снижения уровня энкефалинов и р-эндорфина при введении атропина [4, 13, 14, 15]. Учитывая преимущественную локализацию ФМСФ-КП в надпочечниках, можно предположить, что именно здесь данный фермент участвует в генезе регуляторных пептидов, в то время как в стриатуме эта роль принадлежит КПН. В гипоталамусе синтез и секреция биологически активных пептидов этого отдела (аргинин-вазопрессин, окситоцин и др.) также подвержена влиянию холинергической системы [14, 15]. Значительное снижение активности КПН, участвующей в образовании активных форм этих пептидов из предшественников [6, 7], по всей видимости, обеспечивает снижение уровня аргинин-вазопрессина и окситоцина атропином [4].
Таким образом, ФМСФ-КП, как и КПН, вероятно, принадлежит важная роль в регуляции уровня активных форм нейропептидов при введении атропина. При этом КПН и ФМСФ-КП, по-видимому, участвуют в процессинге не только разных биологических пептидов, но и вовлекаются в процессинг одних и тех же нейропептидов в разных отделах нервной системы.
Кратковременное повышение активности кар-боксипептидазы N через 4 ч после введения атропина (рис. 3) происходит, вероятно, за счет снижения ингибирующего действия энкефалинов [16]. Поскольку
Рис. 1. Активность КПН при действии атропина в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, М±т, п=4+6). Здесь: Q - контроль, Ц - атропин 2,5 мг/кг. * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 относительно контроля.
Рис. 2. Активность ФМСФ-КП при действии атропина в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, М±т, п=4+6). Здесь: Q - контроль, Ц - атропин 2,5 мг/кг. * - р < 0,05, ** - р <0,01, *** - р < 0,001 относительно контроля.
карбоксипептидаза N является одним из ферментов процессинга энкефалинов [1б], то дальнейшее снижение ее активности через 24 и 72 ч может, по всей видимости, приводить к снижению уровня опиоидных пептидов при воздействии атропина.
1.2 -i
05 ч 4 ч 24 ч 72 ч
Рис. 3. Активность КПЫ при действии атропина в сыворотке крови крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, Mim, n=4+6). Здесь: □ - контроль, Ц - атропин 2,5 мг/кг. * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 относительно контроля
Таким образом, полученные в работе данные позволяют предположить, что вызванные введением атропина изменения в активности основных карбоксипеп-тидаз являются одним из факторов, обусловливающих снижение уровня регуляторных пептидов при действии токсических доз атропина.
список литературы
1. Судаков С. К. Клеточные и нейрохимические механизмы действия холинотропных препаратов // Успехи совр. биол. 19б8. Т. 105. № 1. С. 100-10б.
2. Laubie M., Schmitt H. Sites of action of clonidine: centrally mediated increase in vagal tone, centrally mediated hypotensive and sympatho-inhibito™ effects // J. Phama-col. 1985. Vol. 1б. P. б9-94.
3. Malcolm P., Caulfield, Nigel J.M. Classification of Muscarinic Acetylcholine Receptora // Pham. Reviews. 1998. Vol. 50. P. 279-290.
4. Крылов С. С., Ливанов Г. А., Петров А. H., Семенов E. В., Спринц А. M., Бучко В. M. Клиническая токсикология
лекарственных средств. Холинотропные препараты. СПб.: Лань, 1999. 160 с.
5. Громов Л. А., Жила В. А. Влияние центральных холи-нолитиков на содержание опиоидных нейропептидов в мозгу животных // Укр. биохим. журн. 1986. Т. 58. № 6. С. 61-63.
6. Beinfeld M. С. Prohormone and proneuropeptide processing. Recent progress and future challenges // Endocrine. 1998. Vol. 8. P. 1-5.
7. Вернигора А. H., Генгин М. Т. Протеолитические ферменты: субклеточная локализация, свойства и участие в обмене нейропептидов // Биохимия. 1996. Т. 61. № 5.
С. 771-785.
8. Fricker L.D., Snyder S.H. Purification and characterization of enkephalin convertase, an enkephaline-synthesizing carboxypeptidase // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. P. 10950-10955.
9. Hendriks D., Sande M., Scharpe S. Colorimetric assay for carboxypeptidase N in serum // Clin. Chim. Acta. 1986. Vol. 157. P. 103-108.
10. Hendriks D., Scharpe S., van Sande M., Lommaert M.P. Characterisation of a carboxypeptidase in human serum distinct from carboxypeptidase N // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1989. Vol. 27. P. 277-285.
11. Lee P. N., Takahaski T. N. An improved colorimetric determination of amino acid with the use of ninhydrine // Analyt. Biochem. 1966. Vol. 14. P. 71-77.
12. Lowry O. H., Rosebrought N. J., Farr A. G., Randall R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. № 1. P. 265-275.
13. Громов Л. А., Лохвицкая К. H. Влияние амизила на медиаторный обмен мозга // Фармакология и токсикология. 1971. Т. 6. С. 24-26.
14. Andersson K., Eneroth P., Fuxe K., Harfstrand A. Effects of Intravenous Cocaine and Cigarette Smoking on Luteinizing Hormone, Testosterone, and Prolactin in Men // Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1998. Vol. 337. P. 131-139.
15. Pitkinen A., Beal M.F., Sirvits J., Swartz K.J., Minnist P.T., Riekkinen P.J. Somatostatin, neuropeptide Y, GAB A and cholinergic enzymes in brain of pentylenetetrazol-kindled rats // Neuropeptides. 1989. Vol. 14. P. 197-207.
16. Лишманов Ю. Б., Трифонова Ж. В., Цибин А. H. Бета-эндорфин и стресс-гормоны плазмы крови при состояниях напряжения и адаптации // Бюлл. эксперим. биол. медицины. 1987. Т. 103. № 4. С. 422-424.
УДК. 577.1
комЕТАБолиЗм ЭдТА и глюкозы бактериального штамма LPM-4
Е. И. ЮДИНА, Э. Г. ДЕДЮХИНА, В. А. СМЕТАНИН Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского
кафедра биохимии
Мониторинг окружающей среды показывает, что в ней происходит постоянное накопление ЭДТА. Многочисленные исследования показали, что деградации ЭДТА в очистных сооружениях не происходит, а в природе существует лишь один значимый способ деградации ЭДТА - разложение комплекса Fe (Ш)EDTA под действием УФ лучей, который происходит лишь на поверхности воды [2]. Накопление ЭДТА в воде приводит к ухудшению качества питьевой воды, так
как ЭДТА способствует переходу в растворенное состояние ионов металлов (в том числе тяжелых и токсичных). Следует обратить внимание на то, что здоровью человека в первую очередь угрожают комплексы ЭДТА с токсичными металлами, а не ЭДТА как химическое соединение.
В настоящее время известно несколько смешанных культур и всего три чистые культуры ЭДТА-де-
