Сравнение активности основных карбоксипептидаз в тканях самцов крыс при введении диазепама Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.152.342

Н. А. Правосудова, М. Т. Генгин

СРАВНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ САМЦОВ КРЫС ПРИ ВВЕДЕНИИ ДИАЗЕПАМА

В статье проводится сравнение изменения активности ферментов обмена регуляторных пептидов - карбоксипептидазы Н и фенилметилсульфонил-фторид-ингибируемой карбоксипептидазы - в отделах мозга и периферических тканях самцов крыс при однократном и хроническом введении диазепама. На основании полученных результатов и анализа литературы высказываются предположения об участии ферментов в реализации эффектов диазепама.

Введение

Психические заболевания занимают в современной медицине довольно обширную нишу болезней человека. Их можно отнести к группе наиболее трудноизлечимых. Учитывая высокий риск возникновения психических расстройств, в том числе из-за роста в современном мире различных стрессовых воздействий, экологических факторов, актуальной является проблема профилактики и лечения патологии нервной системы.

В психофармакологии используют препараты, действующие на медиа-торные системы [1]. Диазепам является экзогенным лигандом бензодиазепи-новых рецепторов. Он изменяет уровень многих нейропептидов, в частности АКТГ, кортикотропин-рилизинг гормона, энкефалинов, а также эндогенных лигандов бензодиазепиновых рецепторов - эндозепинов (БЫ). Однако молекулярные механизмы влияния диазепама на уровень биологически активных пептидов не изучены.

Содержание регуляторных пептидов в организме зависит от соотношения скоростей их синтеза и распада [2]. Нейропептиды синтезируются в виде высокомолекулярных предшественников, которые активируются при ограниченном расщеплении пептид-гидролазами (процессинге) [3]. В конечной стадии процессинга участвуют основные карбоксипептидазы - ферменты, катализирующие отщепление остатков аргинина и лизина с С-конца предшественников регуляторных пептидов [4]. Одним из основных ферментов, участвующих в биосинтезе таких нейропептидов, как АКТГ, энкефалины, вещество Р, гормон роста, пролак-тин, является карбоксипептидаза Н (КП Н) (КФ 3.4.17.10) [5]. Вместе с тем предполагают, что функции недавно обнаруженной фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-КП) сходны с таковыми КП Н [4]. Однако биологическая роль этого фермента практически остается неясной.

Таким образом, изучение активности КП Н и ФМСФ-КП в отделах мозга и органах крыс при введении диазепама может способствовать уточнению биологической роли этих ферментов, а также выяснению молекулярных механизмов взаимодействия ГАМК-ергической системы с пептидергической.

1. Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили гипоталамус, четверохолмие, мозжечок, стриатум, гиппокамп, большие полушария, гипофиз, надпочечники и семенники самцов лабораторных белых беспородных крыс массой 200-250 г.

При изучении острого влияния диазепама на активность КП Н и ФМСФ-КП in vivo препарат вводили внутрибрюшинно в физрастворе в дозе 5 мг/кг веса. Контрольные животные получали равное количество физраствора. Крыс декапитировали под наркозом через 0,5, 4, 24 и 72 часа после введения препаратов. При изучении хронического влияния диазепама вышеуказанную дозу препарата вводили в течение 10 дней. Через одни и трое суток после воздействия животных декапитировали. Для исследования влияния транквилизатора на КП Н и ФМСФ-КП in vitro гомогенаты тканей инкубировали с диазепамом в течение 60 мин при 4°С. Концентрация препарата соответствовала дозе при введении in vivo.

Активность ферментов определяли флюорометрическим методом: КП Н - с использованием специфического ингибитора гуанидиноэтилмеркапто-янтарной кислоты и дансил-фен-ала-арг в качестве субстрата при рН 5,6 [6]; ФМСФ-КП - с использованием фенилметилсульфонилфторида и субстрата дансил-фен-лей-арг при рН 5,6 [7]. Концентрацию белка в пробах определяли по методу Lowry [8].

Экспериментальные данные обрабатывали статистически с использованием г-критерия Стьюдента.

2. Результаты и их обсуждение

2.1 Активность КПН и ФМСФ-КП в отделах мозга и органах крыс при остром воздействии диазепама

Введение диазепама приводило к значительному уменьшению активности КП Н в гипофизе через 24 и 72 часа, гипоталамусе через 4, 24 и 72 часа и надпочечниках через 72 часа (рис. 1), что согласуется с представлениями о стресс-протективном действии диазепама [9] путем ингибирования гипота-ламо-гипофизарно-надпочечниковой системы и уменьшения секреции и образования АКТГ при его введении [10].

Инъекция диазепама понижала активность КП Н в четверохолмии, больших полушариях, мозжечке и гиппокампе через 4, 24 и 72 часа относительно соответствующих значений контроля. При этом наибольшие изменения зафиксированы в больших полушариях и гиппокампе (в 1,3—1,4 раза), в отделах с высоким содержанием холецистокининов и вовлекающихся в развитие эмоциональных реакций и невротических состояний [11]. На основе полученных данных можно предположить, что уменьшение уровня холецистокининов под действием бензодиазепинов [11] вызвано снижением активности КП Н. Вещество Р, по данным ряда исследователей [12], вовлекается в модуляцию стресса, и его уровень повышен у пациентов с депрессивными расстройствами. Понижение уровня этого пептида в гиппокампе при введении диазепама [13] можно быть связано с понижением активности КП Н. В семенниках активность КП Н снижалась через 72 часа после инъекции диазепама. В половых железах самцов синтезируются энкефалины, холецистокинины и другие биологически активные пептиды [14], в обмене которых участвует карбоксипептидаза Н, поэтому снижение активности фермента может влиять на уровень пептидов в семенниках.

Активность ФМСФ-ингибируемой КП после инъекции диазепама (рис. 2) изменялась подобно активности КП Н: уменьшалась в гипофизе через 4 и 72 часа; в гипоталамусе, мозжечке, стриатуме и больших полушариях через 24 и 72 часа; в гиппокампе, четверохолмии и надпочечниках через 4, 24 и 72 часа после воздействия.

и)

ю

2

1.5

1

0,5

0

Гипофиз

★ * г-гч

**★ + И*

яя йя (Ь 1ь Й

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

сутки

3

сутки

0,6

0,4

0,2

0

Гипоталамус

***

+ + + +

Я

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

I

сутки

3

сутки

0,6

0,4

0,2

О

Четверохолмие

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

сутки сутки

0,4

0,3

0,2

0,1

О

Большие полушария

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

сутки сутки Ш контроль (физраствор)

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

I 3 сутки сутки

Надпочечники

0,3

0,2

0,1

0

0,6

0,4

0,2

о

+++ ++

' Ш Ь. Ь. Ш

а!

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

Семенники

I 3

сутки сутки

Ш.

0,4

в. вя а» а: я;

П яи £зъ О»

.. ★★★ :И:й

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

I

сутки сутки диазепам (острый)

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

1

сутки сутки диазепам (хронический)

Стриатум

Гиппокамп

Мозжечок

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч 1 л

сутки сутки

Рис. 1 Активность КП Н в тканях крыс при введении диазепама: по оси У - активность фермента, нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мгбелка; М ± пг, п = 5^6; * -р < 0,05; ** -р< 0,01; *** -р < 0,001 относительно нормы; + -р< 0,05; ++ -р< 0,01; +++ -р < 0,001 относительно контроля

Известия высших учебных заведений.

Гипофиз

Гипоталамус

Четверохолмие ++

*** *** +

Норма 0,5 ч

сутки

сутки сутки

Мозжечок

Стриатум

Гиппокамп

0,6

0,4

0,2

0

*** *** ++

++

■лмжйЖ

<кй

Норма 0*5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

I 3

сутки сутки

0,8

0,6

0,4

0,2

0

*** ++

+ + *

++ т +Н

0,6

0,4

0,2

ґ* ** +** ++ ++ ++

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

I 3

сутки сутки

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

1 3

сутки сутки

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Большие полушария

*** ++ 4-+

++

Я

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч

I

сутки сутки контроль (физраствор)

Надпочечники

1,5

ЙА °ІІЛ

*** ***

++

++ +

іі-Л.

1

0,5

0

Семенники

+ ++ п __________ПЙ ЕДЙ ДЕл

++

АА

Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч ^ ^ Норма 0,5 ч 4 ч 24 ч 72 ч 1 л

сутки сутки г сутки сутки

диазепам (острый)

диазепам (хронический)

Рис* 2 Активность ФМСФ-КП в тканях крыс при введении диазепама: по оси У- активность фермента, нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка; М±т: п = 5^6; * -р < 0,05; ** -р< 0П01 ;***-/? < 0,001 относительно нормы; + -р < 0,05; ++-/?< 0,01; +-Ь+ -р < 0,001 относительно контроля

№ 4, 2007 Медицинские науки. Теоретическая и экспериментальная медицина

Обнаруженное нами снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП позволяет предположить ее участие в обмене регуляторных пептидов при введении диазепама.

Имеются данные о понижении уровня мет-энкефалина в стриатуме при остром воздействии диазепама [15]. В наших исследованиях изменения активности КП Н в этом отделе мозга не были обнаружены, но произошло понижение активности ФМСФ-ингибируемой КП. Отсюда можно предположить, что ФМСФ-ингибируемая КП участвует в обмене энкефалинов в стриатуме, предшественники которых являются более предпочтительными субстратами для ФМСФ-ингибируемой КП [4]. Понижение активности фермента в семенниках через 0,5 и 72 часа после воздействия может быть связано с увеличением уровня тестостерона под действием диазепама [16].

2.2 Активность основных карбоксипептидаз в отделах мозга и органах крыс при хроническом введении диазепама

Введение диазепама в течение 10 дней вызывало снижение активности КП Н в гипофизе, гипоталамусе, четверохолмии, мозжечке, стриатуме через сутки после воздействия (см. рис. 1). Наибольшее понижение активности фермента в этот период обнаружены в периферических тканях: в надпочечниках и семенниках - относительно контрольной группы. Таким образом, хроническое введение диазепама приводило к таким же изменениям активности КП Н, как и при остром воздействии препарата. Диазепам, вводимый в течение 10 дней, вызывал ингибирование гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и гипоталамо-гипофизарно-гонадной систем, а также отделов, отвечающих за двигательную активность животных. Через трое суток после хронического введения диазепама снижение активности КП Н обнаружено в отделах с высоким содержанием опиоидных пептидов: в гиппокампе и надпочечниках. Следовательно, хроническое введение диазепама вызывало наибольшие изменения активности карбоксипептидазы Н через сутки после воздействия.

Снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП через сутки после хронического введения диазепама наблюдалось в гипофизе, мозжечке, гиппокампе и больших полушариях по сравнению с контрольной группой (см. рис. 2). Активность фермента через сутки после воздействия повышалась в стриатуме, надпочечниках и семенниках. Хроническое введение диазепама приводило к снижению активности ФМСФ-КП через трое суток после воздействия в гипофизе, мозжечке, стриатуме и гиппокампе относительно контрольных животных. Повышение активности фермента зафиксировано в гипоталамусе, четверохолмии и надпочечниках по сравнению с контролем.

Таким образом, в отличие от действия однократной инъекции диазепама хроническое введение препарата приводило к разнонаправленным изменениям активности ФМСФ-ингибируемой КП во всех исследуемых отделах мозга и тканях относительно контрольных животных. Кроме того, диазепам, вводимый в течение 10 дней, вызывал снижение активности КП Н и разнонаправленные изменения активности ФМСФ-КП. Возможно, что подобное отличие в изменении активности этих ферментов связано с разной ролью исследуемых карбо-ксипептидаз в различных отделах мозга и периферических органах, что согласуется с данными, полученными другими исследователями [4].

Известно, что карбоксипептидаза Н участвует в процессинге предшественников АКТГ, энкефалинов, холецистокинина, вещества Р, нейротензина и многих других биологически активных пептидов [5]. Анализ аминокислотной последовательности данных пептидов и субстратной специфичности ФМСФ-ингибируемой КП позволяет предположить, что данная карбоксипептидаза наряду с КП Н может вовлекаться в процессинг предшественников этих регуляторных пептидов [4].

Таким образом, одним из механизмов изменения уровня биологически активных пептидов диазепамом может быть изменение активности ферментов их обмена - КП Н и ФМСФ-КП.

Заключение

В последнее время широко обсуждаются вопросы участия нейропептидов в развитии эндогенных психических заболеваний [17]. Кроме того, биологически активные пептиды участвуют в процессах формирования памяти, оказывают седативное, анксиогенное, анальгетическое, гипотермическое и ряд других действий [18]. В связи с этим данные пептиды могут участвовать в проявлении основных и побочных действиях транквилизаторов. Хроническое введение диазепама приводило к более выраженным изменениям активности исследуемых карбоксипептидаз по сравнению с острым. В клинической практике при лечении психических заболеваний применяют длительную терапию психолептиками. Поэтому можно предположить, что только длительное воздействие психолептиков приводит к значительному изменению функционирования пептидергической системы мозга и реализации лечебного эффекта препаратов. Наиболее сильное влияние диазепама на активность КП Н наблюдалось в железах (гипофизе, гипоталамусе, надпочечниках и семенниках), а ФМСФ-ингибируемой КП - в отделах мозга. Исходя из распределения исследуемых ферментов в тканях крыс, можно предположить, что в железах ведущую роль в обмене регуляторных пептидов играет КП Н, а в отделах мозга - ФМСФ-КП. Полученные результаты согласуются с представлениями об антистрессорном действии диазепама и вовлечении КП Н в развитие стрессорной реакции [9].

Весьма важным является вопрос о механизмах изменения активности основных карбоксипептидаз под влиянием диазепама. Известно, что в структуре гена КП Н обнаружен целый ряд тканеспецифичных регуляторных участков, через которые осуществляется регуляция скорости транскрипции гена фермента [19]. Поскольку введение диазепама приводит к снижению уровня стероидных гормонов [10], а синтез мРНК КП Н может регулироваться этими гормонами [20], то можно предположить, что активность фермента регулируется на уровне экспрессии гена. Аналогичные механизмы регуляции можно предположить для ФМСФ-КП.

Диазепам непосредственно не влияет на активность исследуемых карбоксипептидаз, т.к. в проведенных нами опытах in vitro психолептик в концентрациях, соответствующих дозам при введении in vivo не влиял на активность КП Н и ФМСФ-КП.

Таким образом, вероятно, активность КП Н и ФМСФ-КП регулируется на уровне экспрессии гена. Однако наличие существенных изменений в активности изучаемых ферментов уже через 0,5 часа после воздействия указывает на возможность и других способов регуляции активности фермента: на

уровне процессинга проформы ферментов, который осуществляется активируемыми ионами Са2+ эндопептидазами, а также регуляция активности зрелой формы фермента за счет конформационных изменений молекулы и, как следствие, изменение свойств активного центра фермента.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что активность основных карбоксипептидаз регулируется диазепамом. Изменение активности КП Н и ФМСФ-КП может влиять на уровень регуляторных пептидов в мозге и плазме крови, а через них на функционирование других систем организма и вовлекаться в механизмы основного и побочного действия препарата на организм.

Список литературы

1. Машковский, М. Д. Лекарственные средства : в 2-х т. / М. Д. Машковский. -14-е изд., перераб., испр. и доп. - М. : Новая волна, 2002. - Т. 1. - 540 с.

2. Khanna, A. S. Metabolism and intracellular processing of protein hormones / A. S. Khanna, D. M. Waisman // Hormon. Act. - 1988. - № 1. - P. 117-132.

3. Steiner, D. F. The biosynthesis of biologically active peptides: a perspective / D. F. Steiner // Peptide Biosynthesis and Processing (Fricker L. D., ed.). - Florida : CRC Press, Boca Raton, 1991. - P. 1-16.

4. Генгин, М. Т. Особенности структурно-функциональной организации и физикохимические свойства нелизосомальных пептидгидролаз мозга животных : дис. ... д-ра биол. наук / М. Т. Генгин. - М., 2002. - 330 с.

5. Fricker, L. D. Isolation and sequence analysis of cDNA for rat carboxypeptidase E [EC 3.4.17.10], a neuropeptide processing enzyme / L. D. Fricker, J. P. Adelman, J. Douglass [et al.] // Mol. Endocrinol. - 1989. - V. 3. - № 4. - P. 666-673.

6. Fricker, L. D. Purification and characterization of enkephalin convertase, an en-kephaline-synthesizing carboxypeptidase / L. D. Fricker, S. H. Snyder // J. Biol. Chem. -1983. - V. 258. - № 18. - P. 10950-10955.

7. Вернигора, А. Н. Частичная характеристика фенилметилсульфонилфторидин-гибируемой карбоксипептидазы из головного мозга кошки / А. Н. Вернигора, Н. Н. Никишин, М. Т. Генгин // Биохимия. - 1995. - Т. 60. - № 11. - С. 1860-1866.

8. Lowry, O. H. Protein measurement with Folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosebrought, A. G. Farr, R. J. Randall // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - № 1. -P. 265-275.

9. Середенин, С. Б. Влияние феназепама на содержание АКТГ в плазме крови инбредных мышей при стрессовых воздействиях / С. Б. Середенин, Ю. А. Бледнов // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1986. - Т. 102. - № 12. - С. 724-726.

10. Pivac, N. Inhibitory Effect of Diazepam on the Activity of the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis in Female Rats / N. Pivac, D. Fericic // Journal of neural transmission-general section. - 1993. - V. 92. - № 2-3. - Р. 173-186.

11. Воронина, Т. А. Перспективы поиска новых анксиолитиков / Т. А. Воронина, С. Б. Середенин // Эксп. и клин. фармакология. - 2002. - Т. 65. - № 5. - С. 4-17.

12. Ebner, K. Substance P in the medial amygdala: Emotional stress-sensitive release and modulation of anxiety-related behavior in rats / K. Ebner, N. М. Rupniak, A. Saria [et al.] // PNAS. - 2004. - V. 101. - № 12. - Р. 4280-4285.

13. Brodin, E. Effects of Sequential Removal of Rats from a Group Cage, and of Individual Housing of Rats, on Substance P, Cholecystokinin and Somatostatin Levels in the Periaqueductal Gray and Limbic Regions / E. Brodin, A. Rosen, E. Schott [et al.] // NEUROPEPTIDES. - 1994. - V. 26. - № 4. - Р. 253-260.

14. Persson, H. Transient expression of the cholecystokinin gene in male germ cells and accumulation of the peptide in the acrosomal granule: possible role of cholecystokinin in fertilization / H. Persson, J. F. Rehfeld, A. Ericsson [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1989. - V. 86. - № 16. - P. 6166-6170.

15. Mitchell, V. GABAergic afferents modulate proenkephalin mRNA expression in the guinea pig hypothalamic magnocellular dorsal nucleus / V. Mitchell, J. C. Beauvillain, M. Mazzuca // Neurosci. Lett. - 1992. - V. 144. - № 1-2. - Р. 189-194.

16. Dong, E. Diazepam binding inhibitor (DBI) reduces testosterone and estradiol levels in vivo / E. Dong, K. Matsumoto, H. Watanabe // Life Sci. - 2002. - V. 70. - № 11. -Р. 1317-1323.

17. De Wied D. Neuropeptides involved in the pathophysiology of schizophrenia and major depression / De Wied D., H. O. Sigling // Neurotox. Res. - 2002. - V. 4. - № 5-6. -Р. 453-468.

18. Нейрохимия / под ред. И. П. Ашмарина, П. В. Стукалова. - М. : Изд-во Института биомед. химии РАМН, 1996. - 470 с.

19. Jung, Y. K. Structural characterization of the rat carboxypeptidase-E gene / Y. K. Jung, C. J. Kunczt, J. E. Dixon [et al.] // Mol. Endocrinol. - 1991. - V. 5. - № 9. -Р. 1257-1268.

20. Rodriguez, C. Rat preprocarboxypeptidase H. Cloning, characterization, and sequence of the cDNA and regulation of the mRNA by corticotropin releasing factor / C. Rodriguez, K. A. Brayton, M. Brownstein [et al.] // J. Biol. Chem. - 1989. - V. 264. -№ 10. - P. 5988-5995.