CC BY
1130
биохимия
УДК 616.432-008.931-02
влияние некоторых фармакологических препаратов на Активность ферментов обмена нейропептидов при стрессе
А. н. ВЕРНИГОРА
Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского Кафедра химии и теории и методики обучения химии
Обнаружено, что глюкокортикоиды, гидроксибутират натрия, верапамил, каптоприл и гуанидиноэтилмеркапто-янтарная кислота предотвращают повышение активности карбоксипептидаз Ни Ыи ангиотензинпревращающе-го фермента, вызванное внутрибрюшинной инъекцией физиологического раствора. Обсуждается роль ферментов обмена нейропептидов в антистрессовом действии вышеуказанных препаратов, а также механизм влияния этих веществ на активность исследуемых ферментов.
Важная роль в развитии стрессорных реакций принадлежит стресс-пептидам. Нейропептиды синтезируются в виде высокомолекулярных предшественников, которые активируются при ограниченном расщеплении протеолитическими ферментами [19]. В конечной стадии процессинга участвует карбоксипептидаза Н (КПН, КФ 3.4.17.10) - экзопептидаза секреторных везикул, отщепляющая остатки аргинина и лизина с С-конца пропептидов [1, 5]. В результате её действия образуются зрелые секретируемые формы нейропеп-тидов, в частности адренокортикотропин, р-эндорфин, пролактин и др. [5]. То есть, КПН контролирует уровень активных форм этих пептидов.
Модификация и инактивация нейропептидов осуществляется также путём протеолитического расщепления [19]. Одним из ферментов, расщепляющих вышеуказанные пептиды является ангиотензинпре-вращающий фермент (АПФ, КФ 3.4.15.1) [10]. В обмене нейропептидов участвует и карбоксипептидаза N (КПЧ КФ 3.4.17.3) [18].
Показано, что АПФ, КПН и КПN вовлекаются в развитие стрессорных реакций [2]. Известно, что внут-рибрюшинное введение физиологического раствора является стрессирующим фактором для крыс [16] и, как и другие виды стресса, вызывает повышение активности вышеуказанных ферментов [3].
Целью данной работы было исследование влияния гидрокортизона, дексаметазона, верапамила, гидроксибутирата натрия, каптоприла - высокоспецифичного ингибитора АПФ, и гуанидиноэтилмер-каптоянтарной кислоты (ГЭМЯК) - высокоспецифичного ингибитора КПН и КП^ на активность ан-гиотензинпревращающего фермента, карбоксипепти-даз Н и N при стрессе, вызванном внутрибрюшинной инъекцией физраствора. Активность КПН и АПФ исследовали в гипофизе - отделе, синтезирующем стресс-пептиды и отличающемся очень высокой по сравнению с остальными отделами мозга активностью этих ферментов [1, 5, 10], КПN - в сыворотке крови - единственном месте локализации карбокси-пептидазы N в организме [18].
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Исследование выполнено на самцах белых беспородных крыс весом 150-180 г. В качестве контрольной группы использовали интактных животных (п = 12). Стресс вызывали внутрибрюшинной инъекцией 0,9 % раствора №С1 в дозе 2 мл на кг веса (п = 10-12 для каждого временного интервала). Фармакологические препараты вводили внутрибрюшинно в эквивалентном количестве физраствора в следующих дозах: гидрокортизон - 100 мг на кг веса (п = 5-6 для каждой временной группы), дексаметазон - 1 мг на кг веса (п = 5-6), гидроксибутират натрия - 100 мг на кг веса (п = 5), верапамил - 25 мг на кг веса (п = 5), ГЭМЯК -1 мкмоль на кг веса (п = 9-10), каптоприл - 100 мкмоль на кг веса (п = 9-10). Животных декапитировали через 0,5, 4 и 24 ч после введения. Выделяли гипофиз и собирали кровь. Сыворотку получали стандартным способом.
Активность КПН определяли по образованию дансил-Phe-Leu из дансил-Phe-Leu-Arg при рН 5,6 флюориметрически [7]. Активность КПN определяли по высвобождению аргинина из гиппурил-А^ при рН 7,6 нингидриновым методом [4]. Активность АПФ определяли по образованию Gly-Arg из карбобензок-си^1у^1у-А^ как ингибируемую каптоприлом при рН 7,6 по нингидриновой реакции [4]. Концентрацию белка определяли методом Лоури [15]. Активность ферментов выражали в нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин, на 1 мг белка.
Достоверность отличия между средними значениями показателей оценивали по ^критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ Внутрибрюшинная инъекция физиологического раствора вызывала повышение активности КПН и АПФ через 0,5, 4 и 24 ч, КПN через 4 и 24 ч после введения (рис.).
Введение гидрокортизона приводило к снижению по сравнению с введением физраствора активности КПН через 4 и 24 ч, АПФ - через 0,5 ч, КПN - через 4 и 24 ч после инъекции. Таким образом, введение гидрокортизона снижало повышение активности КПН и
ИЗВЕСТИЯ ПГПУ - Естественные науки - № 5 (9) 2007 г.
Рис. Влияние фармакологических препаратов на активность ферментов обмена нейропептидов. 0,5, 4 и 24 - время после введения, ■ - контроль, □-физраствор, Ш-гидрокортизон, Щ-дексаметазон, |§ - оксибутират натрия, Щ - верапамил, Щ - ГЭМЯК, Ш- каптоприл; * - р < 0,05 по сравнению с контролем,+ - р < 0,05 по сравнению с введением физиологического раствора.
КП^ вызванное стрессом введения, причём в случае КПН активность была ниже, чем у контрольных животных.
При введении дексаметазона активность КПН была ниже активности у стрессированных животных в случае всех исследованных промежутков времени, АПФ через 0,5 ч, а КПN через 4 и 24 ч после введения была ниже, чем при стрессе. При этом активность КПН снижалась ниже уровня контроля, АПФ оставалась повышенной, а КПN не отличалась от активности у контрольной группы животных.
В случае воздействия гидроксибутирата натрия активность КПН была ниже, чем при введении физраствора и ниже контроля; АПФ - ниже, чем при стрессе, но через 0,5 и 4 ч не отличалась от контроля, а через 24 ч была повышенной по сравнению с контролем. Активность КПN через 4 ч после введения была выше контроля и не отличалась от активности при стрессе, через 24 ч - промежуточной между активностью у контрольной и стрессированной групп.
При введении верапамила активность КПН была ниже, чем при инъекции физраствора. В случае всех исследованных интервалов времени она не отличалась от активности у контрольных крыс. Активность АПФ через 0,5 и 24 ч была ниже активности у стрес-сированных животных и не отличалась от активности
у контрольной группы, через 4 ч - выше контроля и не отличалась от активности при стрессе. Активность KnN через 4 и 24 ч после введения верапамила была промежуточной между активностью у контрольной и стрессированной групп.
В случае введения ГЭМЯК активность КПН через 0,5 и 4 ч была ниже, чем при введении физраствора, через 24 ч не отличалась от неё. Через все исследованные промежутки времени активность фермента не отличалась от активности у контрольных животных. Активность АПФ была ниже активности при инъекции физиологического раствора и во всех случаях, кроме 4 ч после введения, ниже активности у контрольных животных. Активность KnN через 0,5 ч после введения была выше, чем при инъекции физраствора и у интак-тных животных, через 4 ч не отличалась от активности у стрессированных и была выше активности у контрольных крыс, через 24 ч была промежуточной между активностью у этих групп животных. Таким образом, высокоспецифичный ингибитор кПН гЭМяк, не влияющий на активность АПФ in vitro (табл.), in vivo подавлял активность не только КПН, но и АПФ. ГЭМЯК, которая in vitro ингибирует и КП^ хотя и в значительно меньшей степени, чем КПН (табл.), через короткий промежуток времени после введения повышала активность КП^ а при более длительных - подавляла.
Таблица.
Влияние фармакологических препаратов на активность ферментов обмена нейропептидов in vitro (в % к контролю (100%), концентрации препаратов равны дозам, вводимым in vivo)
Препарат кпн KnN АПФ
Контроль 100 100 100
Гидрокортизон 94 103 90
Дексаметазон 84 110 91
Гидроксибутират натрия 90 111 88
Верапамил 96 113 113
ГЭМЯК 0 41 102
Каптоприл 99 106 0
При введении каптоприла наблюдалось снижение активности КПН через 4 ч после инъекции, через 0,5 и 24 ч после введения каптоприл на активность фермента не влиял. Активность АПФ в случае введения каптоприла была существенно ниже, чем при инъекции физраствора, и через 0,5 и 4 ч ниже, чем у контрольной группы. Активность KПN через 4 и 24 ч после воздействия была промежуточной между активностью у стрессированных и интактных животных. Таким образом, высокоспецифичный ингибитор АПФ при введении in vivo подавлял не только его активность, но и активность КПН и КП^ на которые in vitro не влиял (табл.).
ОБСУЖДЕНИЕ Таким образом, все исследованные фармакологические препараты, вне зависимости от механизма их действия, в той или иной мере предотвращают повы-
шение активности КПН, КПN и АПФ, вызванное инъекцией физраствора. Однако, динамика влияния этих веществ зависит как от используемого препарата, так и от исследуемого фермента. Внутрибрюшинная инъекция физиологического раствора является стрессирую-щим фактором для крыс [16] и, как и многие другие виды стресса, приводит к возрастанию активности исследуемых ферментов [3]. Дексаметазон и гидрокортизон подавляют секрецию стресс-пептидов по механизму обратной связи [17]. Таким образом, одним из возможных механизмов воздействия глюкокортикоидов на уровень стресс-пептидов является снижение активности КПН - фермента, участвующего в образовании активных форм этих пептидов [5]. Вместе с тем, при уменьшении секреции стресс-пептидов предотвращается повышение их уровня и, следовательно, исчезает необходимость в повышении активности АПФ и КП^ которые участвуют в их деградации.
ИЗВЕСТИЯ ПГПУ • Естественные науки • № 5 (9) 2007 г.
Гидроксибутират натрия и верапамил обладают антистрессорным действием и вызывают снижение активности исследуемых ферментов по сравнению с крысами, подвергнувшихся воздействию только физраствора. То есть, одним из возможных механизмов антистрессорного действия этих веществ является их влияние на активность ферментов обмена стресс-пептидов.
Ингибиторы АПФ - каптоприл и карбокси-пептидазы Н - ГЭМЯК также, в основном, вызывают снижение активности исследуемых ферментов (исключая KnN через 0,5 ч после введения). Известно, что ингибиторы АПФ подавляют синтез и секрецию адренокортикотропина [21]. Поэтому представляется интересным изучение антистрессорного действия ингибиторов ферментов обмена стресс-пептидов с целью получения направленных средств воздействия на стресс-систему.
Необходимо отметить, что в ряде случаев, особенно при использовании ингибиторов, активность ферментов снижалась значительно ниже уровня нормы. То есть, данные вещества не являются специфичными стресс-протективными препаратами, нормализирующими функционирование системы стресс-пептидов, а просто подавляют выработку стресс-пептидов, как, возможно, и других нейропептидов, путём ингибиро-вания ферментов их обмена, обеспечивая таким способом антистрессовое действие. Следовательно, адап-тогенное действие этих препаратов представляется весьма проблематичным.
Вызывает интерес вопрос о механизмах влияния исследуемых фармакологических препаратов на активность изучаемых ферментов. не вызывает сомнения, что влияние гидрокортизона, дексаметазона, гидроксибутирата натрия и верапамила на активность всех исследованных ферментов, гЭМяк на активность АПФ и каптоприла на активность КПН и KnN не связано с прямым влиянием указанных веществ на ферменты, так как in vitro они не влияют на их активность (табл.).
Известно, что глюкокортикоиды регулируют активность многих ферментов путём изменения экспрессии их генов. Однако, исследования на культуре AtT20 клеток показали, что глюкокортикоиды, изменяя уровень мРНК проопиомеланокортина, не влияют на уровень мРНК КПН [20]. Более того, участков связывания стероидных гормонов в структуре гена КПН не обнаружено [12]. Вопрос о возможности влияния глюкокортикоидов на уровень экспрессии KПN и АПФ остаётся пока открытым.
Что касается влияния каптоприла на активность АПФ и гЭМяК на активность КПН, то здесь оно осуществляется путём прямого ингибирования активности ферментов. однако, при действии каптоприла на активность КПН и КП^ а также ГЭМЯК на активность АПФ прямое ингибирование исключено. Известно, что и КПН и АПФ ингибируются многими биологически активными пептидами, в обмене которых они и участвуют [9, 13]. Поэтому изменение концентрации нейропептидов в результате ингибирования КПН при
введении ГЭМЯК может приводить к изменению активности АПФ и наоборот. Однако, если АПФ, являющийся мембраносвязанным эктопротеином [10], доступен для действия веществ пептидной природы, то КПН локализована внутри секреторных везикул [1, 5], и не доступна для действия пептидов, находящихся вне везикул. Вместе с тем, многие нейропеп-тиды влияют на экспрессию генов, в том числе генов АПФ [8] и КПН [6, 14]. Таким образом, изменение уровня нейропептидов вследствие ингибирования активности одного из ферментов его специфичным ингибитором может приводить к изменению активности и другого фермента, посредством влияния этих нейро-пептидов на уровень экспрессии мРНК фермента. Более того, вследствие эффекта обратной связи, по этому механизму может изменяться и активность фермента, подавляемого специфичным ингибитором. Этим, вероятно, объясняется длительный и фазный характер влияния данных ингибиторов, несмотря на то. Сходным образом на активность данных ферментов могут влиять и другие исследуемые вещества, в особенности глюкокортикоиды, которые, влияют на уровень не только стресс-пептидов, но и многих других нейро-пептидов, в частности энкефалинов [11]. Последние вовлекаются в регуляцию уровня стресс-пептидов [17]. Таким образом, представляется вероятным, что влияние исследуемых фармакологических препаратов на активность ферментов обмена стресс-пептидов опосредуется различными нейромедиаторными, в том числе и пептидергическими системами.
список ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вернигора А. Н., Генгин М. Т. Механизмы регуляции активности и биологическая роль карбоксипептида-зы Н - фермента процессинга нейропептидов // Биохимия. 1995. Т. 60. № 12. С. 1953-1963.
2. Вернигора А. Н., Генгин М. Т., Никишин Н. Н. Об участии некоторых ферментов обмена нейропептидов в механизмах эмоционального стресса // Физиол. ж. 1995. Т. 81. № 5. С. 103-112.
3. Вернигора А. Н., Никишин Н. Н., Генгин М. Т. Влияние внутрибрюшинного введения физиологического раствора на поведение крыс в тесте «открытое поле» и активность ферментов, участвующих в обмене нейропептидов // Физиол. ж. 1995. Т. 81. № 12. С. 121-125.
4. Генгин М. Т., Вернигора А. Н., Никишин Н. Н., Щетинина Н. В. Активность карбоксипептидазы N и ангио-тензинпревращающего фермента в сыворотке крови крыс в норме и при эмоциональном стрессе // Укр. биохим. журн. 1994. Т. 66. № 2. С. 116-119.
5. Fricker L. D. Peptide processing exopeptidases: amino- and carboxypeptidases involved with peptide biosynthesis // Peptide biosynthesis and processing (Fricker L. D. ed.). Florida: CRC Press, Boca Raton, 1991. P. 199-230.
6. Fricker L. D., Rigual R. J., Diliberto E. J. Jr., Viveros O. Н. Reflex splanchnic nerve stimulation increases levels of carboxypeptidase E mRNA and enzymatic activity in the rat adrenal medulla // J. Neurochem. 1990. Vol. 55. № 2. P. 461-467.
7. Fricker L. D., Supattapone S., Snyder S. Н. Enkephalin convertase: a specific enkephalin synthesizing carboxy-
peptidase in adrenal chromaffin granules, brain and pituitary gland // Life Sci. 1982. Vol. 31. P. 1841-1844.
8. Goraya T. Y., Kessler S. P., Kumar R. S., Douglas J., Sen G. C. Identification of positive and negative transcriptional regulatory elements of the rabbit angiotensin-con-verting enzyme gene // Nucleic Acids Res. 1994. Vol. 22. № 7. P. 1194-1201.
9. Hook V. Y. H., LaGamma E. F. Product inhibition of car-boxypeptidase H // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. № 26. P. 12583-12588.
10. Hooper N. M. Angiotensin converting enzyme: implications from molecular biology for its physiological functions // Int. J. Biochem. 1991. Vol. 23. № 7/8. P. 641-647.
11. Inturrisi C., Franklin S., Shapiro J., Calvano S., Yoburn B. Adrenal enkephalin biosynthesis regulated by glucocorti-coid // NIDA Res. Monogr. 1988. Vol. 81. P. 129-135.
12. Jung Y. K., Kunczt C. J., Pearson R. K., Dixon J. E., Frick-er L. D. Structural characterization of the rat carboxy-peptidase E gene. // Mol. Endocrinol. 1991. Vol. 5. № 9. P. 1257-1268.
13. Kariya K., Okamoto H., Kaktmoto M., Tsuda Y., Okada Y. Inhibition of angiotensin converting enzyme of rat brain with the bradykinin and its fragments // Biochim. Biophys. Res. Commun. 1981. Vol. 100. P. 31-35.
14. Laslop A., Tschernitz C. Effects of nerve growth factor on the biosynthesis of chromogranin A and B, secretogranin II and carboxypeptidase H in rat PC12 cells // Neurosci. 1992. Vol. 49. № 2. P. 443-450.
15. Lowry O. H., Rosebrought N. J., Farr A. G., Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. № 1. P. 265-275.
16. Rosen A., Brodin K., Eneroth P., Brodin E. Short-term restraint stress and sc saline injection alter the tissue-levels of substance P and cholecystokinin in the peri-aqueductal gray and limbic regions of rat brain // Acta Physiol. Scand. 1992. Vol. 146. № 3. P. 341-348.
17. Shipston M. J. Mechanisms(s) of early glucocorticoid inhibition of adrenocorticotropin secretion from anterior-pituitary corticotropes // Trends Endocrin. Met. 1995. Vol. 6. № 8. P. 261-266.
18. Skidgel R. A. Human carboxypeptidase N: lysine carboxypeptidase // Methods Enzymol. 1995. Vol. 248. P. 653-663.
19. Steiner D. F. The biosynthesis of biologically active peptides: a perspective // Peptide Biosynthesis and Processing (Fricker L. D., ed.). Florida: CRC Press, Boca Raton, 1991. P. 1-16.
20. Thiele E. A., Eipper B. A. Effect of secretagogues on components of the secretory system in AtT-20 cells // Endocrinology. 1990. Vol. 126. № 2. P. 809-817.
21. Zacharieva S., Matrozov P., Stoeva I., Andonova K. The effect of angiotensin-converting enzyme inhibition on ACTH response to corticotropin-releasing hormone (CRH) in normal men // Horm. Metab. Res. 1991. Vol. 23. № 5. P. 245-246.
