CC BY
94
ИЗВЕСТИЯ
ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 10 (14)2008
IZVESTIA
PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 10 (14) 2008
УДК 577.156
ВЛИЯНИЕ ВЕРАПАМИЛА НА АКТИВНОСТЬ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ H
В ОТДЕЛАХ МОЗГА КРЫС
© А. Н. ВЕРНИГОРА
Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского кафедра химии и теории и методики обучения химии e-mail: [email protected]
Вернигора А. Н. - Влияние верапамила на активность карбоксипептидазы Н в отделах мозга крыс. - Известия
ПГПУ им. В. Г. Белинского. 2008. № 10 (14). - С. 43-45. - Изучено влияние однократного введения антагониста кальция верапамила на активность фермента обмена нейропептидов карбоксипептидазы H в отделах мозга крыс. Обнаружено, что in vivo верапамил вызывает сильное длительное снижение активности фермента во всех изученных отделах головного мозга. In vitro верапамил и ионы кальция не влияют на активность фермента. Предполагается, что in vivo ионы кальция могут ускорять превращение неактивной проформы карбоксипептидазы H в активный фермент.
Ключевые слова: верапамил, карбокиспептидаза Н, мозг, обмен нейропептидов.
Vernigora A. N. - Effect of the verapamil on the carboxypeptidase h activity in the rat brain regions. - Izv. Penz. gos. pedagog. univ. im.i V. G. Belinskogo. 2008. № 10 (14). P. 43-45. - Effect of the acute administration of calcium antagonist verapamil on the carboxypeptidase H that enzyme of neuropeptides exchange activities in the rat brain regions were studied. Verapamil strongly reduced the enzyme activities in all studied brain regions in vivo. Verapamil and calcium ions are don’t effect on the enzyme activity in vitro. It is proposed that calcium ions can be accelerate the conversion of carboxypeptidase H proform to mature form in vivo.
Keywords: verapamil, carboxypeptidase H, brain, neuropeptides exchange.
Регуляторные пептиды синтезируются в виде высокомолекулярных неактивных предшественников, которые активируются в результате протеолитическо-го процессинга [15]. В конечной стадии процессинга участвует карбоксипептидаза Н - экзопептидаза секреторных везикул, отщепляющая остатки аргинина и лизина с С-конца пропептидов, что приводит к образованию пептидов, обладающих биологической активностью [4]. В регуляции образования и экзоцитоза секреторных везикул, синтеза и секреции многих регуляторных пептидов участвуют ионы Са2+ [3]. Повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция инициирует созревание секреторных везикул и выброс их содержимого из клетки [2]. В связи с этим представляет интерес изучение возможности регуляции активности карбоксипептидазы Н ионами кальция. В структуре фермента обнаружен участок связывания ионов кальция [10], но in vitro ионы Са2+ не влияют на активность очищенного фермента [1, 4].
Целью нашей работы было исследование возможности регуляции активности карбоксипептидазы Н ионами кальция in vivo. Для этого изучали влияние на активность фермента анатагониста кальция - вера-памила, который блокирует кальциевые каналы, что
приводит к снижению концентрации ионов Ca2+ в цитоплазме [13]. Поскольку фермент существует в виде мембраносвязанной и растворимой форм [4], исследовали его активность в растворимой и мембранной фракциях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследование выполнено на самцах белых беспородных крыс массой 150-180 г. Верапамил вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг на кг веса. Контрольной группе животных вводили соответствующее количество (2 мл на кг веса) физиологического раствора. Животных декапитировали через 0,5, 4 и 24 ч после введения. Выделяли гипофиз, гипоталамус, стриатум. Навески тканей гомогенизировали в 10 мМ натрий ацетатном буфере в соотношении 1 : 100 (вес : объем). Для получения растворимой и мембранной фракций гомогенат центрифугировали 60 мин при 30000 g при 4°C. Осадок ресуспендировали в исходном объёме среды гомогенизации и использовали в качестве мембранной фракции, супернатант - в качестве растворимой. В полученных фракциях определяли активность карбоксипептидазы H и количество белка методом Lowry [9].
ИЗВЕСТИЯ ПГПУ им. В. Г. Белинского • Естественные науки • № 10 (14) 2008 г.
Очищенный препарат карбоксипептидазы Н получали, как описано ранее [1].
Для исследования влияния верапамила и ионов Са2+ на активность фермента in vitro препараты фермента преинкубировали 30 мин при 37оС с вера-памилом (конечная концентрация в пробе 1 мг/мл) и Ca(N03)2 (1 мМ) а затем определяли активность как описано ниже.
Активность карбоксипептидазы Н определяли флюориметрически как описано ранее [6] с дансил-Phe-Leu-Arg в качестве субстрата. Препараты фермента (200 мкл) инкубировали с 200 мкл 2,5 мМ СоSО4 в 50 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,6, или 200 мкл буфера 8 мин при 37оС. Затем в пробы вносили по 100 мкл раствора дансил-Phe-Leu-Arg (концентрация в пробе 42 мкМ) в том же буфере. Реакцию (30 мин, 37оС) останавливали прибавлением 50 мкл 1 М НС1. Продукт реакции (дансил-Phe-Leu) экстрагировали хлороформом и измеряли флюоресценцию хлороформной фазы (Xex = 360 нм, Xem = 530 нм). Активность фермента определяли как разность в скорости накопления дансил-Phe-Leu в пробах, содержащих и не содержащих ионы кобальта и выражали в нМ дансил-Phe-Leu, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Активность фермента у животных, которым вводили верапамил, выражали в процентах от активности у контрольных крыс.
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Введение верапамила вызывало снижение активности карбоксипептидазы Н в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме крыс через все исследованные интервалы времени (0.5, 4 и 24 ч) (табл. 1). Существенных отличий во влиянии препарата на активность фермента в различных отделах мозга и в различных фракциях не обнаружено. Поскольку верапамил снижает внутриклеточную концентрацию ионов Ca2+ [13], то полученные результаты свидетельствуют о том, что in vivo ионы кальция участвуют в регуляции активности карбоксипептидазы Н, причем повышение их концентрации приводит к активации фермента. Однако, поскольку in vitro ни ионы кальция, ни верапамил не влияли на активность ни очищенного фермента, ни на активность фермента во фракциях (табл. 2), то влияние этих веществ на активность фермента in vivo, вероятно, имеет опосредованный характер.
Карбоксипептидаза Н синтезируется в виде неактивного предшественника [7], который акти-
Таблица 1
Влияние однократного введения верапамила на активность карбоксипептидазы Н в отделах мозга крыс (в % от контроля, контроль - 100%, М ± т, п = 5 - 6)
Фракция Время после введения
0.5 ч 4 ч 24 ч
Гипофиз
Гомогенат 43 ± 4 *** 33 ± 5 *** 53 ± 9 ***
Растворимая 55 ± 2 *** б9 ± 7 ** 48 ± б ***
Мембранная б7 ± 9 ** б0 ± 4 *** бб ± 7 ***
Гипоталамус
Гомогенат 54 ± 5 *** 37 ± 4 *** 35 ± 3 ***
Растворимая 44 ± 2 *** 52 ± 5 *** 50 ± 8 ***
Мембранная 42 ± 3 *** 45 ± 7 *** 35 ± 2 ***
Стриатум
Гомогенат б7 ± 7 ** 35 ± 3 *** 45 ± 5***
Растворимая 50 ± 7 *** 44 ± 7 *** 27 ±1 ***
Мембранная 38 ± 2 *** 52 ± 3 *** 39 ± 2 ***
Примечание: **, -p < 0,01, *** -p < 0,001 соответственно
вируется по мере созревания секреторных везикул [8] под действием субтилизиновой эндопептидазы [5]. Последняя активируется ионами Ca2+ [5]. Следовательно, введение верапамила животным и вызываемое этим снижение внутриклеточной концентрации ионов кальция может приводить к снижению активности этого фермента и нарушать процессинг прокарбоксипептидазы H, следствием этого может быть снижение ее активности. Недостаточная активность фермента приводит к нарушению процессинга и сортировки многих регуляторных пептидов [11, 12, 14]. Таким образом, повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция, приводящее к секреции биологически активных пептидов, вероятно, способствует превращению неактивной проформы карбоксипептидазы H в активный фермент, что ускоряет превращение предшественников нейропептидов в биологически активные формы.
Таким образом, ионы кальция in vivo, вероятно, участвуют в регуляции активности карбоксипептида-зы H на уровне активации проформы фермента.
Таблица 2
Влияние верапамила и ионов Ca2+ на активность карбоксипептидазы H in vitro (в % от контроля, контроль - 100%)
Фактор Очищенный фермент гомогенат Растворимая Мембранная
Контроль 100 100 100 100
Ca* 117 105 108 103
Верапамил 104 9б 10б 98
биохимия ►►►►►
список ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вернигора А. Н., Генгин М. Т., Никишин Н. Н. Очистка и физико-химические свойства растворимой карбоксипептидазы Н из серого вещества головного мозга кошки // Биохимия. 1992. 57. № 11. С. 1712-1719.
2. Bader М. F., Simon J. P., Sontag J. М., Langley К., Aunis D. Role of calcium in secretion and synthesis in bovine adrenal chromaffin cells // Adv. Exp. Med. Biol. 1990. V. 269. P. 93-97.[4
3. Dannies P. S. Protein hormone storage in secretory granules: mechanisms for concentration and sorting // Endocrine Rev. 1999. V. 20. № 1. P. 3-21.
4. Fricker L. D. Peptide processing exopeptidases: amino- and carboxypeptidases involved with peptide biosynthesis // Peptide biosynthesis and processing / Ed. by Fricker L. D. Boca Raton, Florida, CRC Press. 1991. P. 199-230.
5. Fricker L. D., Devi L. Posttranslational processing of carboxypeptidase E, a neuropeptide-processing enzyme, in AtT-20 cells and bovine pituitary secretory granules // J. Neurochem. 1993. V. 61. № 4. P. 1404-1415.
6. Fricker L. D., Snyder S. Н. Enkephalin convertase: purification and charasterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenall chromaffin granules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 3886-3890.
7. ^ok V. Y. Н., Affolter Н. U. Identification of zymogen and mature forms of human carboxypeptidase Н. A processing enzyme for the synthesis of peptide hormones // FEBS Lett. 1988. V. 238. № 2. P. 338-342.
8. Hook V. Y. H., Affolter H. U., Palkovits M. Carboxypep-tidase H in the hypothalamo-neurohypophysal system: evidence for processing of a prohormone-processing enzyme during axonal transport УУ J. Neurosci. 1990. V. 10. № 10. P. 3219-322б.
9. Lowry О. H., Rosebrought N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent ^ J. Biol. Chem. 1951. V. 193. № 1. P. 2б5-275.
10. Nalamachu S. R., Song L. X., Fricker L. D. Regulation of carboxypeptidase E - effect of Ca2* on enzyme activity and stability ^ J. Biol. Chem. 1994. V. 2б9. № 15. P. 11192-11195.
11. Rovere C., Viale A., Nahon J., Kitabgi P. Impaired processing of brain proneurotensin and promelanin-concentrating hormone in obese fa^fat mice ^ Endocrinology. 199б. V. 137. № 7. P. 2954-2958.
12. Shen F. S., Loh Y. P. Intracellular misrouting and abnormal secretion of adrenocorticotropin and growth-hor-mone in Cpe(fat) mice associated with a carboxypep-tidase E mutation ^ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. № 10. P. 5314-5319.
13. Singh B. N., Ellrodt G., Peter C. T. Verapamil: a review of its pharmacological properties and therapeutic use ^ Drugs. 1978. V. 15. № 1. P. 1б9-197.
14. Srinivasan S., Bunch D. О., Feng Y., Rodriguiz R. M., Li M., Ravenell R. L., Luo G. X., Arimura A., Fricker L. D., Eddy E. M., Wets W. C. УУ Endocrinology. 2004. V. 145. №. 4. P. 2023-2034.
15. Steiner D. F. The biosynthesis of biologically active peptides: a perspective УУ Peptide Biosynthesis and Processing У Ed. by Fricker L. D. Boca Raton, Florida: CRC Press. 1991. P. 1-1б.
