CC BY
96
ИЗВЕСТИЯ
ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 14 (18)2009
IZ VESTIA
PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 14 (18)2009
УДК 577.156
ВЛИЯНИЕ ПОЛОВЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕНИЛМЕТИЛСУЛЬФОНИЛТОРИД-ИНГИБИРУЕМОй КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ
ПРИ СТРЕССЕ
© А. Н. ВЕРНИГОРА*, Д. А. САЛДАЕВ** Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского, *кафедра химии и теории и методики обучения химии **кафедра анатомии, физиологии и гигиены человека e-mail: vanvan7@yandex.ru
Вернигора А. Н., Салдаев Д. А. - Влияние половых стероидных гормонов на активность фенилметилсуль-фонилторид-ингибируемой карбоксипептидазы при стрессе // Известия ПГПУ им. В. Г. Белинского. 2009.
№ 14 (18). С. 39-43. - Изучено влияние однократного введения половых стероидных гормонов - тестостерона и прогестерона на активность фермента обмена нейропептидов фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-КП) в отделах гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и гипоталамо-гипофизарно-го-надной систем самцов и самок мышей при стрессе. Обнаружено, что в некоторых случаях оба стероида частично предотвращают повышение активности фермента, вызванное стрессом. Влияние половых стероидов на активность фермента у самок было более выраженным, чем у самцов, причем не зависело от вида гормона. Наиболее сильное влияние обоих половых стероидов на активность ФМСФ-КП наблюдалось в гипофизе и половых железах. Обсуждается роль ФМСФ-КП в регуляции уровня пептидных гормонов, контролирующих уровень половых стероидов. Ключевые слова: фенилметилсульфонилторид-ингибируемая карбоксипептидаза, тестостерон, прогестерон, стресс.
Vernigora A. N., Saldaev D. A. - Effect of the sex steroid hormones on the phenylmethylsulphonilfluorid-inhibited carboxypeptidase activity during the stress // Izv. Penz. gos. pedagog. univ. im.i V.G. Belinskogo. 2009. № 14 (18). P. 39-43. - Effect of the acute administration of sex steroid hormones - testosterone and progesterone on the phenylmeth ylsulphonilfluorid-inhibited carboxypeptidase that enzyme of neuropeptides exchange activities in the white mongrel mouse regions of the hypotalamo-pituitary-adrenall-gonadal system during the stress were studied. Both steroids partially prevent the increasing enzyme activity that caused stress. The effect of sex steroid hormones on the enzyme activity in female was largest, than male. The effect was not depended on kind of hormones. The effect was largest in pituitary gland and gonads. The role of phenylmethylsulphonilfluorid-inhibited carboxypeptidase in regulation of level peptide hormones that controlling the level of sex steroids are discussed.
Keywords: phenylmethylsulphonilfluorid-inhibited carboxypeptidase, testosterone, progesterone, stress.
Гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая и гипоталамо-гипофизарно-гонадная системы находятся в тесной функциональной взаимосвязи [6, 7]. Адре-нокортикотропный гормон стимулирует секрецию не только кортикостероидов, но и половых стероидов, го-надотропные гормоны гипофиза влияют на секрецию не только половых стероидов, но и кортикостероидов [20, 23, 24]. Синтез и секреция кортикотропин-рили-зинг фактора и кортикотропина регулируется по механизму обратной связи не только глюкокортикоидами, но и тестостероном и прогестероном [20, 22, 26], тогда как высвобождение гонадотропин-рилизинг фактора, лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов регулируются не только половыми стероидами, но и кортикостероном [18].
Стресс сильно влияет на функционирование половой системы. Он вызывает нарушение синтеза и секреции половых гормонов, что приводит к нарушению сперматогенеза, эстрального цикла, прекращению овуляции, развитию бесплодия [5, 10, 11, 16, 18, 19, 23, 24]. Вместе с тем, андрогены и эстрогены влияют на многие биохимические и физиологические показатели при стрессе [8, 14, 15, 25]. Влияние стресса на активность фермента обмена нейропепти-дов - фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-КП) зависит от пола и стадии эстрального цикла [4]. Этот факт позволяет предположить, что активность указанного фермента при стрессе может зависеть от уровня половых стероидов.
ФМСФ-КП - экзопептидаза, отщепляющая остатки аргинина с C-конца пептидов [3]. Предполагается, что фермент может вовлекаться в обмен различных нейропептидов [3, 4].
Целью нашей работы было исследование влияния тестостерона и прогестерона на активность ФМСФ-КП указанных ферментов при стрессе, вызванном внутрибрюшинной инъекцией.
материал и методика
Опыты выполнены на самцах и самках белых беспородных мышей в возрасте 90-100 суток. В работе использовали 4 группы животных: 1-я - интактные (контроль); животным 2-ой группы (стресс) вводили внутрибрюшинно 0,1 мл оливкового масла, животным 3-ей и 4-ой - соответственно тестостерона пропионат в дозе 3 мг на кг веса и прогестерон в дозе 1 мг на кг веса в оливковом масле (объем 0,1 мл). Животных декапи-тировали через 0,5, 4 и 24 ч после введения, выделяли гипофиз, гипоталамус, надпочечники и яичники.
Активность ФМСФ-КП определяли по гидролизу dansyl-Phe-Leu-Arg при pH 5,6 как ингибируемую 1 мМ фенилметилсульфонилфторидом [3]. Опытные пробы содержали 50 мкл гомогената и 150 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl. В контрольные пробы вносили фенилметилсульфо-нилфторид в конечной концентрации 1 мМ. Пробирки инкубировали 8 мин при 37о C. Затем в пробы вносили по 50 мкл раствора dansyl-Phe-Leu-Arg (концентрация в пробе 42 мкМ) в том же буфере. Реакцию (60 мин, 37о C) останавливали прибавлением 50 мкл 1 М HCl. Экстракцию продукта реакции (dansyl-Phe-Leu) хлороформом и измерение флюоресценции хлороформной фазы (^ex=360 нм, ^em=530 нм) проводили как описано ранее [12]. Активность фермента определяли как разность в скорости накопления продуктов в пробах, не содержащих и содержащих фенилметилсульфо-нилфторид, и выражали в нмоль dansyl-Phe-Leu, высвобождающегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Белок определяли методом Лоури [18].
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента.
результаты и обсуждение
Активность ФМСФ-КП у самцов в гипофизе через 24 ч после введения прогестерона была выше, чем после введения масла, в надпочечниках через 0,5 ч выше, чем у контрольных и получавших масло мышей, а через 4 ч после инъекции обоих гормонов выше, чем у контрольной группы (рис. 1). В семенниках прогестерон вызывал повышение активности фермента по отношению как к контрольным, так и получавшим масло самцам. В гипоталамусе достоверного влияния гормонов не выявлено.
У самок в гипофизе активность ФМСФ-КП через 0,5 ч после введения обоих гормонов была промежуточной между активностью у контрольных и получавших инъекцию масла мышей, а через 4 ч в случае тестостерона и 24 ч в случае обоих стероидов - существенно ниже, чем у обеих сравниваемых групп (рис. 2).
В гипоталамусе через 4 и 24 ч и в яичниках через 24 ч после введения обоих гормонов, а также в яичниках через 0,5 и 4 ч после введения тестостерона активность фермента была ниже, чем у контрольных и получавших масло мышей. В надпочечниках активность фермента в случае введения обоих стероидов не отличалась от таковой в случае инъекции масла.
То есть, влияние половых стероидных гормонов на активность ФМСФ-КП у самок было намного более выраженным, чем у самцов, причем, в основном, не зависело от вида гормона. Таким образом, влияние стероидных гормонов на активность фермента зависело от пола животных. Выявленные половые отличия во влиянии половых стероидов на активность исследуемого фермента могут быть, вероятно, связаны с отличиями в чувствительности самцов и самок к половым гормонам [9], а также с половыми отличиями в функционировании гипоталамо-гипофизарно-надпочечни-ково-гонадной системы [7].
Необходимо отметить, что влияние прогестерона и тестостерона на активность исследуемой КП, было, как правило, однонаправленным, и не зависело от вида гормона (табл.). Возможно, это обусловлено тем, что в организме животных первый является предшественником второго [6], и, следовательно, многие эффекты прогестерона могут опосредоваться его превращением в тестостерон.
таблица
дисперсионный анализ влияния вида гормона на активность ФмсФ-кп
отдел значения критерия Фишера
самцы самки
Гипоталамус 0,1 0,8
Гипофиз 1,3 1,5
Надпочечники 1,1 0,8
Половые железы 4,1 4,0
Наиболее сильное влияние обоих половых стероидов на активность ФМСФ-КП у животных обоего пола наблюдалось в гипофизе и половых железах, причем в гипофизе активность фермента, как правило, снижалась. В гипофизе синтезируются лютеинизиру-ющий и фолликулостимулирующий гормоны, отвечающие за синтез и секрецию как тестостерона, так и прогестерона. Половые железы являются местом синтеза и основным объектом воздействия половых стероидных гормонов. Повышение уровня тестостерона и прогестерона в крови при парентеральном введении, по-видимому, в первую очередь влияет на гипофиз и половые железы. Известно, что тестостерон и прогестерон участвуют в контроле секреции гонадотропинов [1, 7]. Таким образом, снижение активности исследуемых карбоксипептидаз при воздействии экзогенно введенных половых стероидов в гипофизе, вероятно, способствует снижению уровня лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов и снижению выработки и секреции эндогенных стероидов.
ГИПОФИЗ
1К Пм От Шп
НАДПОЧЕЧНИКИ
1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
0,5 ч 4 ч
ГИПОТАЛАМУС
24 ч
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0
1
0,5 ч 4 ч 24 ч СЕМЕННИКИ
0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
I
1
1
0,5 ч
4 ч
24 ч
0,5 ч
4 ч
24 ч
Рис. 1. Влияние однократного введения половых стероидных гормонов на активность ФМСФ-КП в тканях самцов мышей
(нмоль дансил-РИе-1_еи, освободившегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка; здесь и на рис. 2: М ± т, п = 5 4 6; К - контроль (интактные животные), М - масло, Т - тестостерон, П - прогестерон; 0,5 ч, 4 ч, 24 ч - время после введения; *, **,*" - р < 0,05, р < 0,01, р < 0,001 по отношению к контролю, +, ++,+++ - р < 0,05, р < 0,01, р < 0,001 по отношению к введению масла.
6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0
I
ГИПОФИЗ
1К Ом Вт Шп
НАДПОЧЕЧНИКИ
8,0 6,0 4,0 2,0 0,0
1
0,5 ч 4 ч
24 ч
0,5 ч 4 ч
24 ч
2,0 1,5 1,0 0,5 0,0
ГИПОТАЛАМУС
0,5 ч 4 ч
24 ч
10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0
ЯИЧНИКИ
X.
0,5 ч 4 ч
Д!" + + +
24 ч
Рис. 2. Влияние однократного введения половых стероидных гормонов на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях самок мышей (нмоль дансил-РЬе-Ьеи, освободившегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка).
+
+
* *
+
Следует отметить, что в некоторых случаях оба стероида частично предотвращали повышение активности фермента, вызванное инъекцией оливкового масла (рис. 2), причем в случае тестостерона этот эффект был более выраженным по сравнению с прогестероном, что, возможно, связано с отличиями в вводимых дозах гормонов. Известно, что однократный стресс вызывает повышение активности ФМСФ-КП в гипофизе [2]. Это позволяет предположить, что половые стероидные гормоны могут обладать антистрес-сорным действием, реализуемым через модуляцию активности ФМСФ-КП. Однако данные литературы о характере влияния этих гормонов при стрессе крайне противоречивы [8, 14, 15]. Вместе с тем, половые стероиды подавляют секрецию как кортикостероидов [13], так и кортикотропина по механизму обратной связи [6, 21]. То есть, высокий уровень половых стероидных гормонов при их экзогенном введении действительно может способствовать снижению уровня кортикотро-пина и, вероятно, подавлять развитие стресса. однако специфичное стресс-протективное действие тестостерона и прогестерона, реализуемое посредством модуляции изменений активности ФМСФ-КП в гипофизе представляется маловероятным. Это предположение, вероятно, подтверждается и тем фактом, что во многих случаях тестостерон и прогестерон усугубляли изменения активности исследуемого фермента, вызываемое введением масла (рис. 1, 2).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что активность ФМСФ-КП регулируется уровнем половых стероидных гормонов в организме. При этом фермент, вероятно, участвует в регуляции уровня гонадотропин-рилизинг фактора, лютеинизирующего, фолликулостимулирующего, адренокортикотропного гормонов и других биологически активных пептидов, контролирующих уровень стероидных гормонов. Полученные результаты позволяют предположить, что ФМСФ-КП, посредством изменения уровня нейропептидов, регулирующих содержание половых стероидных гормонов в организме, участвует в формировании полового диморфизма функционирования пептидергических и других нейро-медиаторных систем, а также вовлекается в контроль процессов половой дифференциации и размножения.
список ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бабичев В. Н. Нейрогормональная регуляция овари-ального цикла. М.: Медицина, 1984. 240 с.
2. Вернигора А. Н., Бардинова Ж. С., Сметанин В. А., Генгин М. Т. Влияние однократного эмоционально-болевого стресса на активность основных карбокси-пептидаз в отделах мозга и надпочечниках крыс // Укр. биохим. журн. 2004. 76. № 3. С. 67-72.
3. Вернигора А. Н., Генгин М. Т. Выделение, частичная очистка, характеристика и тканевое распределение фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой кар-боксипептидазы кошки // Биохимия. 2003. 68. № 1. С. 96-102.
4. Вернигора А. Н., Генгин М. Т., Бардинова Ж. С., Сметанин В. А., Петрушова О. П. Активность основных
карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла // Укр. биохим. журн. 2003. 75. № 5. С. 99-102.
5. Вундер П. А. О механизмах тормозного и стимулирующего влияния женского полового гормона на секрецию гонадотропинов // Усп. совр. биол. 1992. 112. № 4. С. 609-625.
6. Теппермен Дж., Теппермен У. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. Вводный курс / Под ред. Ажипа Я. И. М.: Мир, 1989. 656 с.
7. Тинников А. А. Роль гипоталамо-гипофизарно-надпо-чечниковой системы в регуляции полового развития // Усп. совр. биол. 1990. 110. № 3. С. 419-428.
8. Ahlbom Е., Prins G. S., Ceccatelli S. Testosterone protects cerebellar granule cells from oxidative stress-induced cell-death through a receptor-mediated mechanism // Brain Res. 2001. 892. N 2. P. 255-262.
9. Brown T. J., MacLusky N. J., Shanabrough M., Naftolin F. Comparison of age and sex-related changes in cell nuclear estrogen-binding capasity and progestin receptor induction in the rat brain // Endocrinology. 1990. 126. P. 2965-2972.
10. Ferin M. Stress and the reproductive cycle // J. Clin. Endocrinol. Met. 1998. 84. N 6. P. 1768-1774.
11. Figueiredo H. F., Dolgas C. M., Herman J. P. Stress activation of cortex and hippocampus is modulated by sex and stage of estrus // Endocrinology. 2002. 143. N 7. P. 2534-2540.
12. Fricker L. D., Snyder S. H. Enkephalin convertase: purification and charasterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenall chromaffin granules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. 79. P. 3886-3890.
13. Gaskin J. H., Kitay J. I. Adrenocortical function in the hamster: sex differences and effects of gonadal hormones // Endocrinology. 1970. 87. P. 779-786.
14. Golczynska M., Zukowskagroiec Z. Are testosterone and neuropeptide Y (NPY) mediators of male hyperrespon-siveness to stress // FASEB J. 1994. 8. N 5. P. A620.
15. Handa R. J., Hejna G. M., Lorens S. A. Androgen inhibits neurotransmitter turnover in the medial prefrontal cortex of the rat following exposure to a novel environment // Brain Res. 1997. 751. N 1. P. 131-138.
16. Levine J. E. Editorial: Stressing the importance of sex // Endocrinology. 2002. 143. N 12. P. 4502-4504.
17. Lowry O. H., Rosebrought N. J., Farr A. G., Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. 193. N 1. P. 265-275.
18. Martini L., Motta M., Piva F., Zanisi M. LHRF, LHRH, GnRH - what controls the secretion of this hormone // Mol. Psychiatry. 1997. 2. N 5. P. 373-376.
19. Matteri R. L., Watson J. G., Moberg G. P. Stress and acute adrenocorticotrophin treatment suppresses LHRH-induced LH release in the ram // J. Endocrinol. 1984. N 72. P. 385-393.
20. McCormick C. M., Smythe J. W., Sharma S., Meaney M. J. Sex-specific effects of prenatal stress on hypothalamic-pituitary-adrenal responses to stress and brain glucocorticoid receptor density in adult rats // Brain. Res. Dev. Brain. Res. 1995. 84. N 1. P. 55-61.
21. Putnam K., Chrousos G. P., Nieman L. K., Rubinow D. R. Sex-related differences in stimulated hypothalamic-
pituitary-adrenalaxisduringinducedgonadalsuppression // J. Clin. Endocrinol. Met. 90, N 7. P. 4224-4231.
22. Reisine T. D., Axelrod J. Regulation of ACTH secration and synthesis // Horm. Proteins Peptides. 1987. 13. P. 173-196.
23. Tsuma V. T., Einarsson S., Madej A., Forsberg M., Lundeheim N. Plasma levels of progesterone and Cortisol afterACTHadministrationinlactatingprimiparoussows // Acta Veterinar. Scand. 1998. 39. N 1. P. 71-76.
24. Vanlier E., Andersson H., Clariget R. P., Forsberg M. Effects of administration of adrenocorticotropic hor-
mone (ACTH) on extragonadal progesterone levels in sheep // Reproduction Domest. Anim. 1998. 33. N 2. P. 55-59.
25. Wallace D. R., Dodson S., Nath A., Booze R. M. Estrogen attenuates gp120- and tat(1-72)-induced oxidative stress and prevents loss of dopamine transporter function // Synapse. 2006. 59. N 1. P. 51-60.
26. Wood C. E., Saoud C. J., Stoner T. A., Kellerwood M. Estrogen and androgen influence hypothalamic AVP and CRF concentrations in fetal and adult sheep // Regul. Peptides. 2001. 98. N 1-2. P. 63-68.
