CC BY
89
УДК 577.114.4
ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОГО КИСЛОТНОГО И ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА НА СТРУКТУРУ И АНТИОКСИДАНТНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕКТИНОВ
© Н.Я. Михалева , М.Ф. Борисенков, Е.А. Гюнтер, О.В. Попейко, Ю.С. Оводов
Институт физиологии Коми научного центра УрО РАН, ул. Первомайская, 50, Сыктывкар, 167982 (Россия) e-mail: nmichaleva@gmail.com
Показано, что обработка пектинов в условиях, приближенных к условиям искусственной гастроэнтеральной среды, приводила к деструкции их углеводной цепи. Степень деструкции пектинов обусловлена особенностями строения их макромолекул, В ходе последовательного кислотного и ферментативного гидролиза пектинов происходило увеличение количества молекул с молекулярной массой 300-400 и 100-300 кДа, атакже отщепление моно- и олигосахаридов, Найдено, что комаруман, бергенан, потамогетонан, пектины сабельника болотного, бадана толстолистного и рдеста плавающего обладают высокой антиоксидантной активностью и содержат большое количество общих фенолов, Обработка соляной кислотой и пектиназой приводила к существенному снижению их антиоксидантной активности и одновременно к снижению содержания в них общих фенолов,
Ключевые слова: пектины, кислотный и ферментативный гидролиз, антиоксидантная активность, общие фенолы, Сокращения: H - продукт кислотного гидролиза; F - продукт ферментативного гидролиза; АОА - антиоксидантная активность; ОФ - общие фенолы; ДФПГ - 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил; ФК - феруловая кислота (га/>анс-4-гидрокси-3-метоксикоричная кислота); ЖКТ - желудочно-кишечный тракт,
Работа выполнена при финансовой поддержке Президиума РАН (грант «Молекулярная и клеточная биология»), РФФИ (грант №06-04-48-079), совместный грант УрО РАН и ДВО РАН, программы «Ведущие научные школы» (грант SS №2383-2008.4).
Введение
Составляя основную биомассу растений, полисахариды являются одним из необходимых компонентов питания. Ежедневно с пищей в организм человека поступает более 300 г углеводов, около 64% от этого количества составляют растительные полисахариды: крахмал, целлюлоза, гемицеллюлозы и пектиновые вещества [1]. Известно, что пектиновые полисахариды участвуют в деятельности пищеварительного тракта, в астности, в образовании гелеобразных структур. Попадая в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), пектины подвергаются воздействию различных деструктирующих агентов: соляной кислоты в желудке и пектиназ в кишечнике, что сопровождается изменением их структуры и свойств.
В связи с вышесказанным актуальным является получение и характеристика строения и свойств макромо-лекулярных фрагментов пектинов, аналогичных тем, которые образуются во внутренней среде ЖКТ человека.
В данном исследовании были использованы пектины с различным типом главной углеводной цепи: бергенан (BC), пектин бадана толстолистного Bergenia crassifolia L., значительная часть макромолекулы которого представлена метилэтерифицированным линейным галактуронаном [2]; гераклиуман (HS), пектин борщевика сибирского Heracleum sibiricum L., главным компонентом макромолекулы которого является линейный галактуронан; комаруман (CP), пектин сабельника болотного Comarum palustre L., в состав которого входят разветвленный и линейный галактуронан, а также разветвленный рамногалактуронан I [3]; потамогетонан (PN), пектин рдеста плавающего Potamogeton natans L., главным элементом структуры которо-
* Автор, с которым следует вести переписку,
го является галактуронан; лемнан (LMC), пектин каллуса ряски малой Lemna minor L., в состав которого входят линейный галактуронан, апиогалактуронан и разветвленный рамногалактуронан I [4]; силенан (SVC), пектин каллуса смолевки обыкновенной Silene vulgaris M. (G.), основным компонентом которого является линейный галактуронан и разветвленный рамногалактуронан I [4].
В немногочисленных работах показано, что пектины обладают антиоксидантной активностью (АОА) [5, 6]. Однако отсутствует единое мнение о структурных компонентах пектинов, обусловливающих их АОА. Ранее нами показано, что при обработке каллуса смолевки обыкновенной ультрафиолетом параллельно с увеличением АОА силенана наблюдается увеличение содержания в нем общих фенолов (ОФ) [7], что позволило предположить, что входящие в состав пектина смолевки ОФ обусловливают его АОА. Представляет интерес выяснить, происходит ли изменение АОА пектинов при воздействии на них факторов энтеральной среды.
Цель данной работы - исследование степени деструкции и изменения антиоксидантной активности пектиновых полисахаридов в результате кислотного и ферментативного гидролиза в условиях in vitro, приближенных к условиям гастроэнтеральной среды.
Экспериментальная часть
Объекты исследования. В качестве объектов исследования использованы следующие пектины: комаруман (CP) - пектин сабельника болотного Comarum palustre L. (Rosaceae Benth.), бергенан (BC) - пектин бадана толстолистного Bergenia crassifolia L. (Saxifragaceae Juss.), потамогетонан (PN) - пектин рдеста плавающего Potamogeton natans L. (Potamogetonaceae Rchb.), гераклиуман (HS) - пектин борщевика сибирского Heracleum sibiricum L. (Apiaceae Lindl.), лемнан (LMC) - пектин каллуса ряски малой Lemna minor L. (Lemnaceae Engl.), силенан (SVC) - пектин каллуса смолевки обыкновенной Silene vulgaris M. (G.) (Caryophyllaceae Juss.). Пектины были выделены из свежего растительного сырья (сбор проводили в июле-августе на территории Ботанического сада СыктГУ и на берегу реки Малая Визинга Сысольского района Республики Коми), а также из каллу сных культур путем экстракции оксалатом аммония, как было описано ранее [2].
Общие аналитические методы. В полисахаридных фракциях определяли содержание гликуроновых кислот по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии концентрированной серной кислоты [8] и калибровочному графику для D-галактуроновой кислоты, содержание белка - по методу Лоури [9] и калибровочному графику для бычьего сывороточного альбумина. Общее содержание углеводов находили по реакции с фенолом в присутствии серной кислоты [10]. Спектрофотометрические измерения проводили на приборе Ultrospec 3000 («Pharmacia Biotech», Великобритания). Газожидкостную хроматографию (ГЖХ) выполняли на приборе Hewlett-Packard 4890А (США) с пламенно-ионизационным детектором и интегратором HP 3395А на капиллярной колонке RTX-1 (0,25 мм х 30 м), газ-носитель - аргон. Полисахаридные фракции лиофилизовали на лиофильной сушке («VirTis», США).
Частичный кислотный гидролиз пектинов раствором соляной кислоты. К 500 мг комарумана CP приливали 100 мл водного раствора соляной кислоты с pH 1,9. Смесь выдерживали при 37 °С в течение 4 ч при постоянном перемешивании. Гидролизат осаждали трехкратным объемом этилового спирта, осадок отделяли центрифугированием, растворяли в дистиллированной воде и лиофилизовали. В результате получили высокомолекулярную фракцию CPH - модифицированный пектин, который подвергали дальнейшему ферментативному гидролизу. Супернатант, содержащий моно- и олигосахариды, анализировали при помощи бумажной и газожидкостной хроматографии. Частичный кислотный гидролиз гераклиумана HS, бергенана BC, потамогетонана PN, лемнана LMC и силенана SVC проводили аналогичным образом, получили фракции HSH, BCH, PNH, LMCH и SVCH соответственно.
Ферментативный гидролиз продуктов кислотного гидролиза пектинов. 150 мг модифицированного полисахарида CPH растворяли в 30 мл дистиллированной воды, к полученному раствору добавляли a-1,4-D-полигалактуроназу (EC 3.2.1.15; активность 753 ед/г «Sigma»), варьируя количество фермента от 0,5 (F1) до
1,0 мг (F2). Смесь инкубировали в течение 2-4 ч при 37 °С. Процесс ферментативного гидролиза контролировали по возрастанию количества восстанавливающих сахаров, которое определяли по методу Нельсона-Сомоджи [11] до прекращения их роста в реакционной смеси. После окончания ферментативного гидролиза для дезактивации фермента реакционную смесь нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения раствора образовавшийся осадок отделяли центрифугированием. Раствор концентрировали и осаждали 3-кратным объемом 96%-ного этилового спирта. Выпавший осадок отделяли центрифугирова-
нием, промывали этиловым спиртом, растворяли в воде и лиофилизовали. В результате получили высокомолекулярные фракции CPHF1 и CPHF2, которые подвергали дальнейшему исследованию. Супернатант, содержащий моно- и олигосахариды, анализировали при помощи бумажной и газожидкостной хроматографии. Ферментативный гидролиз модифицированных пектинов HSH, BCH, PNH, LMCH и SVCH проводили аналогичным образом, получили фракции HSHF1 и HSHF2, BCHF1 и BCHF2, PNHF1 и PNHF2, LMCHF1 и LMCHF2, SVCHF1 и SVCHF2, соответственно.
Полный кислотный гидролиз. Полисахаридные фракции (5 мг) гидролизовали 2 М трифторуксусной кислотой (ТФУ, 1,0 мл) при 100 °С в течение 5 ч, гидролизаты упаривали в вакууме с метиловым спиртом до полного удаления ТФУ. В качестве внутреннего стандарта использовали .мио-инозит (1,0 мг/мл). Моносахариды идентифицировали с помощью ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов [12].
Молекулярную массу образцов определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматогра-фии (ВЭЖХ). Образец (2-3 мг) растворяли в 0,15 M NaCl (1,0 мл) и фильтровали. Для анализа использовали хроматографическую систему «Shimadzu» (Япония): колонка Shodex Asahipak GS-620HQ (7,6 мм х 30 см) иредколонка Shodex GS-26 7В (7,6 мм х 5 см), термостат CT0-10AS, рефрактометр RID 10A, насос LC-20AD, дегазатор 0GH-20A3. Элюирование проводили 0,15 M NaCl при 40 °С со скоростью подачи элюента
0,3 мл/мин. В качестве стандартов использовали декстраны с молекулярными массами 36-50, 100, 300, 400600 и 500 кДа («Sigma», США).
Определение АОА пектинов. Активность определяли по способности препаратов в условиях in vitro реагировать со стабильным радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) («Sigma», США) [5]. Реакцию проводили в планшетах. Каждый образец анализировали в трех независимых исследованиях, в шести повторностях в каждом (общее число анализов - 18). Контролем служила смесь, содержащая все компоненты, за исключением пектина. К 50 мкл 1%-ного водного раствора пектина добавляли 150 мкл 0,6 мМ ДФПГ в этаноле. Оптическую плотность измеряли на планшетном спектрофотометре PowerWave 200TM («Bio-Tek Instruments», США) при 517 нм сначала сразу после добавления ДФПГ и интенсивного перемешивания (t0), затем - через три часа инкубации в темноте под полиэтиленовой пленкой (ti). АОА рассчитывали по формуле [13]:
АОА (%) = (ОП517 бланк (0) - ОП517 проба (1))/ОП517 бланк (0) Х 100,
где ОП517 бланк (0) - оптическая плотность бланка, измеренная сразу после добавления ДФПГ, ОП517 проба (1) - оптическая плотность пробы, измеренная через три часа инкубации. Определяли АОА образцов и параллельно 1%-ного спиртового раствора Тролокса (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота) («Sigma», США). АОА пектинов выражали в процентах от активности Тролокса, приняв АОА Тролокса за 100%.
Определение общего содержания фенольных соединений. Определение осуществляли с использованием реактива Фолина-Чиокальтеу (Ф-Ч) («Sigma», США) по методу, описанному в работе [14] с модификациями. Каждый образец анализировали в трех повторностях. К 30 мкл 1%-ного водного раствора пектина добавляли 120 мкл реактива Ф-Ч и тщательно перемешивали. Через 10 мин добавляли 50 мкл 0,2 М раствора бикарбоната натрия в 0,1 M NaOH. Содержимое пробирок тщательно перемешивали и инкубировали в течение двух часов в темноте при комнатной температуре. По окончании инкубации смесь центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин, по 120 мкл надосадочной жидкости переносили в лунки планшета и измеряли оптическую плотность растворов при длине волны 765 нм. Общее содержание фенольных соединений в пектине определяли по калибровочному графику, построенному для да/>анс-4-гидрокси-3-метоксикоричной кислоты (ФК) («Sigma», США) (1-60 мкг ФК на лунку), и выражали в мг-эквивалентах ФК/г сухого вещества.
Результаты и обсуждение
Изменение структуры пектинов при последовательном кислотном и ферментативном гидролизе.
С помощью ВЭЖХ показано, что в состав исходных пектинов входят молекулы с молекулярной массой 400-600 и 300-400 кДа (табл. 1).
Таблица 1. Молекулярно-массовая характеристика полисахаридных фракций, полученных в результате
последовательного кислотного и ферментативного гидролиза пектиновых полисахаридов, %
Фракция Mw 400-600 кДа Mw 300-400 кДа Олигосахариды Моносахариды
CP 41,5 58,5 - -
CPH 33,0 66,7 0,2 0,1
CPHF1 17,9 81,8 0,3 -
CPHF2 17,1 82,5 0,3 0,1
HS 25,6 74,4 - -
HSH 16,9 82,6 0,4 0,1
HSHF1 12,9 86,5 0,4 0,2
HSHF2 8,8 90,3 0,6 0,3
BC 38,6 61,4 - -
BCH 16,2 83,5 0,2 0,1
BCHF1 14,6 85,4 - -
BCHF2 12,5 87,5 - -
PN 3,3 96,7 - -
PNH 2,4 97,4 0,1 0,1
PNHF1 1,4 98,3 0,2 0,1
PNHF2 2,2 97,5 0,3 0,1
Mw 300-500 кДа Mw 100-300 кДа Mw 10-100 кДа
SVC 100,0 - -
SVCH 97,0 3,0 -
SVCHF1 81,7 13,4 3,8
SVCHF2 64,0 4,2 3,3
LMC 100,0 - -
LMCH 60,8 2,3 36,9
LMCHF1
LMCHF2 64,1 21,5 10,0
Установлено, что максимальная степень деструкции в результате гидролиза наблюдалась у комарумана CP, имеющего разветвленную главную углеводную цепь. Его деструкция составила 16% на стадии кислотного и до 29% на стадии ферментативного гидролиза. В процессе обработки комарумана происходило образование фрагментов с Mw 300-400 кДа (табл. 1), отщепление олиго- и моносахаридов, в результате чего в его составе снижалось количество остатков нейтральных моносахаридов (табл. 2). Это свидетельствует о разрыве глико-зидных связей в его главной углеводной цепи, сопровождающемся отщеплением боковых нейтральных углеводных цепей [7]. Содержание белка в комарумане также снижалось в результате его обработки (табл. 2).
Деструкция гераклиумана HS составила 10% после кислотного гидролиза и до 20% после ферментативного гидролиза, что свидетельствует о меньшей степени деструкции гераклиумана по сравнению с комару-маном. В результате последовательной обработки гераклиумана возрастало количество фрагментов с молекулярной массой 300-400 кДа и уменьшалось количество остатков нейтральных моносахаридов в молекуле (табл. 2). Это может быть связано с тем, что основную часть его макромолекулы составляет линейный рамногалактуронан, который устойчив к кислотному гидролизу, но расщепляется под действием 1,4-a-D-полигалактуроназы. Содержание белка в гераклиумане HS оставалось практически неизменным после обработки гераклиумана раствором соляной кислоты и ферментативного гидролиза (табл. 2).
Степень деструкции бергенана BC составила 15% в ходе кислотного и до 7% в ходе ферментативного гидролиза. В результате в составе бергенана увеличивалось количество фрагментов с молекулярной массой 300-400 кДа и уменьшалось количество остатков нейтральных моносахаридов, а также происходило образование олиго- и моносахаридов (табл. 1, 2). Деструкция бергенана на стадии кислотного гидролиза выше, чем на стадии ферментативного, поскольку метилэтерифицированный линейный галактуронан, основной компонент макромолекулы бергенана [2], устойчив к действию пектиназы, тогда как на стадии кислотного гидролиза происходило отщепление нейтральных боковых цепей.
Показано, что деструкция потамогетонана PN составила 17% после кислотного гидролиза и до 15% после ферментативного гидролиза. В результате последовательного гидролиза потамогетонана происходило обра-зование моно- и олигосахаридов, а количество остатков нейтральных моносахаридов и фрагментов с молекулярной массой 300-400 кДа оставалось практически неизменным (табл. 1, 2). Количество белка в полисахариде в процессе обработки незначительно возрастало. Это свидетельствовало о том, что, аналогично бер-
генану, основные изменения с потамогетонаном, в состав которого входит линейный галактуронан, происходили на стадии кислотного гидролиза, однако при этом не было разрыва главной углеводной цепи макромолекулы потамогетонана и образования фрагментов с молеклярной массой 300-400 кДа.
В результате частичного кислотного гидролиза силенана 8УС из каллуса смолевки обыкновеной и лемнана ЬМС из каллуса ряски малой получены фракции 8УСИ и ЬМСИ, степень деструкции которых составила 10 и 7% соответственно. Фракции имели моносахаридный состав, близкий с составом исходных полисахаридов (табл. 2).
В результате последовательного кислотного и ферментативного гидролиза силенана 8УС при концентрациях пектиназы 0,5 и 1,0 мг/150 мг пектина получены фракции 8УСИР1 и 8УСИБ2. Выход 8УСИР1 и 8УСИБ2 составил 81 и 83% соответственно (табл. 1). Степень деструкции полисахаридов после ферментативного гидролиза равнялась 17-19%. Фракции характеризовались гетерогенностью и состояли из фрагментов с молекулярными массами 300-500 кДа (выход 64-82%), 100-300 кДа (выход 4-13%) и 50-100 кДа (выход 2-4%). При увеличении концентрации пектиназы снижался выход фракций с молекулярными массами 300-500, 100-300 и 50-100 кДа, а также содержание в них остатков галактуроновой кислоты, что говорит о ольшем расщеплении пектина при более высокой концентрации пектиназы.
При последовательном гидролизе лемнана ЬМС получены фракции ЬМСИШ и ЬМСИБ2, выход которых составлял 40 и 43% соответственно (табл. 2). Степень деструкции полисахаридов после ферментативного гидролиза достигала 57-60%. Показано, что при концентрации пектиназы 1,0 мг/150 мг пектина происходила фрагментация лемнана ЬМСИ с образованием фрагментов с молекулярными массами 300-500 кДа (выход 64%), 100-300 кДа (выход 22%), 50-100 кДа (выход 4%) и 10-50 кДа (выход 6%).
Данные свидетельствуют о деструкции пектинов при последовательной обработке раствором соляной кислоты и пектиназой, при этом лемнан подвергался расщеплению в большей степени, чем силенан, что, вероятно, связано с различиями в строении полисахаридов. Лемнан содержал большое количество нейтральных мо-носахаридных остатков и представлял собой более разветвленный пектин, чем силенан. Вследствие этого он более подвержен разрушению боковых цепей под действием кислоты и пектиназы, по сравнению с силенаном.
Таблица 2. Общая химическая характеристика продуктов последовательного кислотного и ферментативного гидролиза пектинов
Фракция Выход*, Нейтральные моносахариды, % Оа1 А, Белок,
% Оа1 Ага РЬа 01с Ху1 Мап Арі Сумма % %
СР - 11,3 6,0 9,3 2,1 - - - 33,4 70 6,4
СРН 84,1 4,4 2,7 1,7 0,6 - - - 9,4 89 5,6
СРЫЛ 61,1 2,7 1,8 1,9 0,9 - - - 7,3 96 2,0
СРОТ2 55,0 2,7 1,4 1,9 0,2 - - - 6,3 95 2,9
НБ - 4,2 4,7 2,5 1,1 0,1 - - 12,6 85 3,3
НБН 90,2 2,7 2,1 1,1 0,5 - - - 6,4 89 2,3
НБЫЛ 72,5 1,3 1,7 0,6 0,6 - - - 4,2 89 3,8
ШНЕ2 70,9 2,1 1,8 1,2 0,6 - - - 5,7 85 4,9
ВС - 1,2 2,1 1,1 1,1 0,2 0,1 - 5,8 89 7,8
ВСН 85,3 0,8 1,4 0,9 0,6 - - - 3,6 93 6,9
ВСОТ1 78,5 1,0 0,9 0,9 0,3 - - - 3,1 96 5,9
ВСОТ2 78,2 0,5 0,6 0,8 0,2 - - - 2,1 98 3,0
РЫ - 1,9 0,9 0,6 0,9 0,3 0,2 - 4,9 92 4,6
РЫН 82,6 1,7 1,1 1,0 0,8 0,3 - - 4,9 93 5,3
РЫНЛ 80,4 1,4 0,9 0,8 1,3 0,3 0,2 - 4,9 90 5,1
РЫНЕ2 67,8 1,7 1,1 1,7 1,0 0,2 0,1 - 5,3 87 6,9
БУС - 2,3 1,8 0,9 0,4 0,2 0,3 - 5,9 79,0 13,3
БУСН 89,5 3,7 3,1 1,0 0,8 1,5 0,5 - 10,6 79,0 14,1
БУСНЛ 79,7 2,1 3,1 0,8 0 0 0 - 6,0 64,5 14,5
БУСНР2 74,3 1,7 1,8 0,9 0,5 0,2 0,3 - 5,4 60,3 11,9
ЬМС - 10,0 20,7 3,2 1,0 2,8 0,2 1,5 39,3 55,7 4,1
ЬМСН 93,0 11,7 21,2 3,8 1,1 2,9 0,2 0 42,7 57,5 0
ЬМСНЛ 37,4 10,7 19,9 3,0 1,0 3,0 0 1,8 39,4 56,2 7,6
ЬМСОТ2 40,2 14,7 21,9 5,2 1,9 3,8 0,1 1,9 49,5 54,5 5,9
* Выход от исходного полисахарида.
Показано, что в результате последовательной обработки пектинов в условиях, приближенных к условиям ЖКТ (последовательная обработка раствором соляной кислоты (рИ=1,9) и а-1,4-Б-полигалактуроназой (количество фермента от 0,5 (И) до 1,0 мг (Г2) на 150 мг пектина при 1=37 °С)), пектины подвергаются частичной деструкции, в результате которой образуются фрагменты с молекулярной массой 300-400 кДа, олиго-и моносахариды. При этом в молекуле увеличивалось содержание остатков галактуроновой кислоты и снижалось содержание остатков нейтральных моносахаридов (табл. 2). Степень деструкции пектинов связана с особенностями построения их макромолекул.
Изменение АОА пектинов под действием соляной кислоты и пектиназы. Исходные пектины - комаруман, бергенан и потамогетонан - обладали большей АОА, чем полисахариды, подвергнутые обработке (табл. 3). АОА СР, ВС и РМ достоверно снижалась при кислотном гидролизе препаратов. Последовательный кислотный и ферментативный гидролиз не приводил к дальнейшему снижению АОА пектинов, за исключением препарата СР. АОА гераклиумана, подвергнутого кислотному и ферментативному гидролизу, не отличалась от АОА исходного пектина. АОА высокомолекулярной фракции лемнана (ЬМС) под действием кислотного гидролиза не изменялась, но снижалась при последовательной обработке соляной кислотой и пек-тиназой (ЬМСИЛ). Это может быть связано с изменением строения пектина после обработки и деструкцией доминирующей фракции с молекулярной массой 300-500 кДа. АОА силенана немного снижалась при кислотном гидролизе, однако последовательное воздействие кислоты и полигалактуроназы не приводило к заметным изменениям АОА пектина, что объясняется незначительной деструкцией доминирующей фракции с молекулярной массой 300-500 кДа.
Содержание ОФ в исходных пектинах (комарумане, бергенане и потамогетонане) достоверно выше, чем в образцах, подвергнутых кислотному и последовательному кислотному и ферментативному гидролизу (табл. 3). Исходные препараты И8, ЬМС и 8УС содержали небольшое количество ОФ. При всех видах обработки содержание ОФ в них достоверно не изменялось, за исключением лемнана, у которого при последовательном гидролизе содержание ОФ увеличивалось.
Отмечена достоверная положительная корреляция между показателями АОА и ОФ исследованных пектинов (Я=0,81; /><0,001).
Ранее было показано, что пектиновые вещества [6, 15] и водорастворимые растительные полисахариды [16-20] обладают антиоксидантной активностью (АОА), хотя структурные части молекулы, ответственные за эту активность, до сих пор не известны. Установлено [7], что при кислотном гидролизе силенана происходило снижение его АОА и одновременно снижалось содержание в нем ОФ. Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о том, что аналогичным образом кислота действовала практически на все исследованные пектины.
Таблица 3. Антиоксидантная активность (АОА) и содержание общих фенолов (ОФ) в пектинах и пектиновых фракциях, полученных в результате последовательного кислотного и ферментативного гидролиза
Пектин Исходный Кислотный Последовательный кислотный и ферментативный гидролиз
гидролиз(Н) НИ НБ2
СР АОА 78,6±4,1 51,5±1,84 43,3±1,8 48,4±3,3
ОФ 59,8±2,5 8,3±2,0 6,0±0,7 5,7±2,7
ВС АОА 60,6±6,1 39,8±2,8 35,4±1,9 34,3±2,1
ОФ 28,0±3,8 1,3±0,3 2,0±0,2 1,9±0,4
РЫ АОА 42,8±2,0 30,3±3,5 24,0±3,2 26,3±2,8
ОФ 8,0±1,5 1,7±0,5 3,0±0,8 1,3±0,1
НБ АОА 33,6±2,9 35,7±2,0 33,3±4,0 32,2±5,1
ОФ 2,8±0,6 1,3±0,5 1,7±1,0 4,4±0,7
ЬМС АОА 36,1±4,1 40,4±2,9 29,5±1,7
ОФ 2,6±1,0 4,3±2,1 16,7±2,8
БУС АОА 38,9±6,0 25,2±2,5 33,1±4,5 41,2±5,7
ОФ 6,7±2,7 2,6±0,6 2,4±0,5 7,0±3,4
% активности тролокса; мг-экв ФК/г сухого вещества.
Известно, что эфиры ФК и некоторых других монолигнолов образуют ковалентные связи с остатками нейтральных сахаров, входящих в состав боковых цепей пектинов [21, 22]. При мягком кислотном гидролизе главным образом происходит отщепление боковых фрагментов макромолекулы [3]. Можно предположить, что при этом вместе с фрагментами боковых цепей из состава пектинов удаляются фенольные соединения и одновременно снижается их АОА.
Выводы
Таким образом, в проведенном исследовании показано, что обработка пектинов в условиях, приближенных к условиям гастроэнтеральной среды, приводила к деструкции их углеводной цепи. Степень деструкции пектинов обусловлена особенностями строения их макромолекул. В ходе последовательного кислотного и ферментативного гидролиза пектинов происходило увеличение количества молекул с молекулярной массой 300-400 и 100-300 кДа, а также отщепление моно- и олигосахаридов.
Наибольшая степень деструкции наблюдалась у комарумана и лемнана. Степень деструкции гераклиумана, бергенана, потамогетонана и силенана ниже, чем у комарумана и лемнана.
Комаруман, бергенан и потамогетонан обладали высокой антиоксидантной активностью и содержали большое количество общих фенолов. Обработка соляной кислотой и пектиназой приводила к существенному снижению их антиоксидантной активности и одновременно к снижению содержания в них общих фенолов.
Авторы благодарят к.х.н. В.В. Головченко, к.х.н. Р.Г. Оводову, Ф.В. Витязева (Институт физиологии
КомиНЦ УрО РАИ) за помощь в выполненииработы.
Список литературы
1. Камкин А.Г., Каменский А.А. Фундаментальная и клиническая физиология. М., 2004. 1072 с.
2. Головченко В.В., Бушнева О.А., Оводова Р.Г., Шашков А.С., Чижов А.О., Оводов Ю.С. Структурное исследование бергенана, пектина из бадана толстолистного Bergenia crassifolia // Биоорганическая химия. 2007. Т. 33. №1. С. 54-63.
3. Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Шашков А.С., Чижов А.О., Оводов Ю.С. Структурное изучение пектина сабельника болотного Comarumpalustre L. // Биохимия. 2005. Т. 70. №8. С. 1051-1062.
4. Оводов Ю.С., Головченко В.В., Гюнтер Е.А., Попов С.В. Пектиновые вещества растений европейского Севера России. Екатеринбург, 2009. 112 с.
5. Yang S.S., Cheng K.T., Lin Y.S., Liu Y.W., Hou W.C. Pectin hydroxamic acids exhibit antioxidant activities in vitro // J. Agric. Food Chem. 2004. V. 52. №13. Pp. 4270-4273.
6. Колесниченко E.A., Сонина Л.Н., Хотимченко Ю.С. Сравнительная оценка антиоксидантной активности низ-коэтерифицированного пектина из морской травы Zostera marina и препаратов-антиоксидантов in vitro // Биология моря. 2005. Т. 31. №5. С. 380-383.
7. Гюнтер Е.А., Борисенков М.Ф., Оводов Ю.С. Изменение строения и антиоксидантной активности пектинов каллуса смолевки обыкновенной под действием ультрафиолета В и С // Прикл. биохим. микробиол. 2009. Т. 45. №4. С. 470-475.
8. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugar and related substances // Anal. Chem. 1956. V. 28. №2. Pp. 350-356.
9. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. C. 265-275.
10. Usov A.T., Bilan M.I., Klochkova N.G. Polysaccharides of Algae. Polysaccharide composition of several calcareous red algae: isolation of alginate from Corallina pilulifera P. et R. (Rhodophyta, Crallinaceae). // Bot. marina. 1995. V. 38. Pp. 43-51.
11. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. 1944. V. 153. Pp. 375-380.
12. York W.S., Darvil A.G., McNeil M., Stevenson T.T. Isolation and characterization of plant cell walls and cell-wall components // Meth. Enzymol. 1986. V. 118. Pp. 3-40.
13. Yen G.C., Duh P.D. Scavenging effect of methanolic extracts of peanut hulls on free-radical and active-oxygen species // J. Agric. Food. Chem. 1994. V. 42. Pp. 629-632.
14. Singleton V.L., Rossi J.A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents // Am. J. Enol. Vitic. 1965. V. 16. N3. Pp. 144-158.
15. Yang S.S., Cheng K.T., Lin Y.S., Liu Y.W., Hou W.C. Pectin hydroxamic acids exhibit antioxidant activities in vitro // J. Agric. Food Chem. 2004. V.52. N13. Pp. 4270-4273.
16. Nara A., Yamaguchi N., Maeda N., Koge H. Antioxidant activity of water soluble polysaccharide in pumpkin fruits (Cucurbita maxima Duchesne) // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009. V. 73. N6. Pp. 1416-1418.
17. Hai-Hong Sun, Wen-Jun Mao, Yin Chen, Shou-Dong Guo, Hong-Yan Li, Xiao-Hui Qi, Yan-Li Chen. Isolation, chemical characteristics and antioxidant properties of the polysaccharides from marine fungus Penicillium sp. F23-2 // Carbohydrate polymers. 2009. V. 78. Pp. 117-124.
18. Jun Liu, Jianguang Luo, Hong Ye, Yi Sun, Zhaoxin Lu, Xiaoxiong Zeng. Production, characterization and antioxidant activities in vitro of exopolysaccharides from endopolytic bacterium Paenibacillus polymyxa EJS-3 // Carbohydrate polymers. 2009. V. 78. Pp. 275-281.
19. Agurre M.J., Isaacs M., Matsuhiro B., Mendosa L., Zuniga E.A. Characterization of a neutral polysaccharide with antioxidant capacity from red wine // Carbohydrate research. 2009. V. 344. Pp. 1095-1101.
20. Deliang Qiao, Chunling Ke, Bing Hu, Jianguang Luo, Hong Ye, Yi Sun, Xiaoyan Yan, Xiaoxiong Zeng. Antioxidant activities of polysaccharides from Hyriopsis cumingii // Carbohydrate polymers. 2009. V. 78. Pp. 199-204.
21. Ralet M.C., Thibault J.F., Faulds C.B., Williamson G. Isolation and purification of feruloylated ligosaccharides from cell walls of sugar-beet pulp // Carbohydr. Res. 1994. V. 263. Pp. 227-241.
22. Bunzel M., Ralph J., Steinhart H. Association of non-starch polysaccharides and ferulic acid in grain amaranth (Ama-ranthus caudatus L.) dietary fiber // Mol. Nutr. Food Res. 2005. V. 49. N6. Pp. 551-559.
Поступило вредакцию 4 февраля 2010 г.
