CC BY
68
Химия растительного сырья. 1999. №1. С. 27-32
УДК: 577.114; 581.192; 574.917; 633, 88
СИЛЕНАНЫ - ПОЛИСАХАРИДЫ СМОЛЕВКИ ОБЫКНОВЕННОЙ (SILENE VULGARIS)
© О.А. Бушнева, Р.Г. Оводова, Е.А. Мишарина
Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, Сыктывкар (Россия) E-mail: [email protected]
Исследование поддержано фондами РФФИ (грант № 96-04-49641), Научного совета “Химия и технология переработки растительного сырья” (грант № 96-22) и ФЦП “Интеграция” (грант № К0929).
Из широко распространенной на территории Европейского Севера России смолевки обыкновенной Silene vulgaris (Moench) Garke (Oberna behen (L.) Ikonn) впервые выделен и охарактеризован пектиновый полисахарид интактного растения силенан SV1 . В состав углеводной цепи силенана входят остатки галактуроновой кислоты (66%), арабино-зы, рамнозы и галактозы в качестве основных компонентов. Ферментативное расщепление силенана SV1 с помощью специфической пектиназы указывает на наличие а-1,4 связанных остатков D-галактуроновой кислоты в основной цепи.
Из каллуса смолевки выделены полисахариды: силенан SVR1 и силенан SVR2. Силенан SVR1 представляет собой кислый арабиногалактан, отличный от пектина. Силенан SVR2 - пектиновый полисахарид, близкий по своему составу к силенану SV1 .
Введение
За последние двадцать лет из высших растений исследователями выделено и исследуется большое число водорастворимых полисахаридов, проявляющих выраженную иммуномодулирующую активность, среди них одно из первых мест занимают пектины и кислые арабино-3,6-галактаны [1, 2].
Смолевка обыкновенная (Silene vulgaris
(Moench) Garke; Oberna behen (L.) Ikonn) - широко распространенное в европейской части России лекарственное растение, произрастающее на берегах рек, в светлых лесах, среди кустарников, на лугах. Как сорняк смолевка встречается в посевах и на огородах. Известно, что отвар надземной части растения используется как диурическое и отхаркивающее средство, наружно - при кожных заболеваниях и ревматизме [3, с. 203, 4, с. 46]. Из биологически активных соединений, содержащих-
ся в растениях этого рода, внимание исследователей привлекали в основном тритерпеновые сапонины [5], органические кислоты, флавоноиды, дубильные вещества, кумарины [3, с. 203]. Сведения о строении и биологической активности полисахаридов, содержащихся в S. vulgaris, в литературе отсутствуют. Описаны лишь олигосахариды [6].
Ранее нами выявлена иммуномодулирующая активность силенанов интактного растения и кал-лусной культуры в отношении усиления фагоцитоза [7].
Целью настоящей работы является общая химическая характеристика силенанов, выделенных из интактного растения и каллуса Silene vulgaris.
Обсуждение результатов
Надземную часть смолевки S. vulgaris, собранную в июле на берегу реки Вычегда, обрабатывали хлороформом и этанолом для удаления низко-
молекулярных примесей. Полученный обезжиренный растительный материал использовали в качестве исходного сырья для выделения полисахаридов, названных нами силенанами.
Схема выделения силенанов приведена на рисунке 1. Водорастворимые фракции силенанов получены последовательной экстракцией интакт-ного растения водой при 20°С и при 70°С. Для удаления сопутствующего белка применяли осаждение белка подкислением экстракта до рН 4.5 -4.8. В результате были получены две фракции силенанов интактного растения: 8У1 и 8У2. В таблице 1 приведен выход полученных силенанов и их аналитические данные. Общее содержание углеводов и гликуроновых кислот в обеих фракциях оказалось близким (табл. 1). Незначительные различия наблюдаются в качественном и количественном составе нейтральных моносахаридов водорастворимых полисахаридов смолевки (табл. 1). На основании полученных данных можно предположить, что обе фракции представляют собой один и тот же полисахарид 8У1.
Для того чтобы выделить пектиновый полисахарид из нерастворимого протопектина, остаток растительного сырья обрабатывали подкисленной водой (рН 4) и экстрагировали 0.7-процентным водным раствором оксалата аммония. В результате была получена полисахаридная фракция 8У3, выход которой, а также аналитические данные приведены в таблице 1, из которой видно, что си-ленаны 8У1 и 8У3 близки по моносахаридному составу. Присутствие в гидролизатах глюкозы и маннозы (табл. 1), скорее всего, указывает на наличие в полисахаридных фракциях резервного глюкана и/или глюкоманнана.
Аналогичным путем из каллусной культуры смолевки получены две полисахаридных фракции: силенан 8УК1 (водная экстракция) и силенан 8УК2 (экстракция оксалатом аммония). Выходы и аналитические данные для силенанов 8УК1 и 8УК2 представлены в сравнении с силенанами интактного растения (табл. 1 ).
Рис. 1. Выделение силенанов из интактного растения и каллуса Silene Vulgaris
Таблица 1
Сравнение силенанов из каллуса и интактного растения S. vulgaris
Сырье Интактное растение Каллус
Силенаны SV1 SV2 SV3 SVK1 SVK2
Выход (%): 2.0* 0.3* 2.5* 1.8 0.8
Содержание (%):
Углеводы 41 40 44 47 43
Белок 23 15 8 29 8
Уроновые кислоты 38 34 66 9 53
Моносахаридный состав (вес. %):
Rha 2.7 1.8 2.1 2.7 2.1
Ara 6.7 6.7 4.2 14.2 5.3
Xyl 2.3 2.5 сл. сл. сл.
Man 2.4 3.4 сл. 5.1 2.0
Glc 5.1 4.3 сл. 3.3 сл.
Gal 8.2 11.4 1.8 28.7 10.8
Rha - рамноза; Ara - арабиноза; Xyl - ксилоза; Man - манноза; Glc - глюкоза; Gal - галактоза; сл. следовые количества; ‘выход от исходного материала после обработки хлороформом и метанолом
Выделенная методом препаративной бумажной хроматографии (БХ) гликуроновая кислота была идентифицирована как галактуроновая кислота методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сравнении с заведомыми образцами [8].
При обработке силенанов SV1 и SV3 интактно-го растения с помощью специфической пектиназы наблюдается заметное расщепление полисахаридов, что указывает на наличие в их углеводной цепи а-1,4 связанных остатков D-галактуроновой кислоты [9]. Это же имеет место и для силенана SVK2 из каллуса. Для силенана SV3 исчерпывающий ферментативный гидролиз привел к полному расщеплению полисахарида. Это позволяет предположить, что основным фрагментом силена-на SV3 является линейный полигалактуронан.
Таким образом, все силенаны интактного растения и силенан SVK2 из каллуса, скорее всего, представляют собой пектиновые полисахариды. Кроме того, из каллусной культуры растения вы-
делен еще один полисахарид - силенан SVK1, который отличается низким содержанием глику-роновых кислот и повышенным содержанием ара-бинозы и галактозы (табл. 1 ).
С помощью метода ионообменной хроматографии на ТЭАЭ-целлюлозе было показано, что силенаны SV1 и SV3 являются кислыми полисахаридами и характеризуются значительной гетерогенностью. Выходы и аналитические данные для отдельных фракций, полученные в результате элюирования 0.01М-0.4М раствором хлорида натрия, представлены в таблице 2.
Таким образом, можно предположить, что в результате проведенной экстракции из интактного растения S. vulgaris последовательно выделены различные компоненты одного и того же пектинового полисахарида, силенана SV1 . Полисахариды каллуса, скорее всего, представлены подобным пектином, силенаном SVK2, и кислым арабинога-лактаном, силенаном SVK1, отличным от пектина.
Таблица 2
Аналитические данные и моносахаридный состав (вес. %) полисахаридных фракций, полученные после фракционирования силенанов SV1 и SV3 на ТЭАЭ-целлюлозе
Исходный Силенан SV1 Силенан SV3
Фракция SV1-1 SV1-2 SV1-3 SV1-4 SV3-1 SV3-2 SV3-3 SV3-4
Выход (%): Содержание: 5 15 21 53 2 16 29 20
Белок(%) Уроновые 6 0 0 0 7 0 0 0
кислоты(%) Сахара: 0 46 68 94 0 73 91 94
Rha 1.1 4.5 6.4 1.4 1.2 1.7 1.0 0.5
Ara 7.4 9.5 5.5 1.3 14.4 2.3 1.0 0.5
Xyl 3.1 1.7 1.4 0.3 4.4 0.4 0.6 0.8
Man 10.5 1.2 2.4 0.3 4.5 0.6 0.3 0.3
Glc 4.4 3.8 3.2 0.5 4.9 1.2 0.5 0.4
Gal 8.3 14.5 7.9 3.0 3.1 2.2 1.0 0.6
Rha - рамноза; Ara - арабиноза; Xyl - ксилоза; Man - манноза; Glc - глюкоза; Gal галактоза; сл. -
следовые количества Экспериментальная часть
Сырье. Надземную часть смолевки обыкновенной S. vulgaris собирали на берегу р. Вычегды вблизи г. Сыктывкара в июле 1997 г. Собранный материал высушивали на воздухе, измельчали и экстрагировали органическими растворителями (хлороформ, этанол) для удаления низкомолекулярных примесей.
Каллусную культуру индуцировали из прикорневых почек S. vulgaris и культивировали на ага-ризованной среде, содержащей соли по Мурасиге и Скугу [10] и гормоны: 2,4-дихлорфеноксиук-сусную кислоту (1.0 мг/л) и 6-бензиламинопурин (0.5 мг/л). Каллус субкультивировали с интервалом в 27 дней при 26°С в темноте.
Общие экспериментальные условия. Общее содержание углеводов определяли фенол-серным методом [11], содержание уроновых кислот - по реакции с концентрированной H2SO4 и 2,3-диметилфенолом [8], белка - по методу Лоури [12]. Спектрофотометрические измерения проводили на приборе СФ-26.
Газожидкостную хроматографию (ГЖХ) выполняли на хроматографе Нетс^еИ-РаскаМ 4890А с пламенно-ионизационным детектором и интегратором НР 3395А на капиллярной колонке ЯТХ-1 (0.25 мм 0 х 30 м), газ-носитель - Не, сброс 1:60. Моносахариды анализировали в виде ацетатов полиолов [13] в температурном режиме: 175°С (1 мин) ^ 250 °С (2 мин), А 3°/мин. Процентное содержание моносахаридов от суммарного препарата вычисляли из площадей пиков, используя коэффициенты отклика детектора.
Распределительную нисходящую БХ выполняли в системе - бутанол: пиридин: вода (6/4/3 : у/у/у) на бумаге БШтак - 12, 13. Для индикации пятен моносахаридов использовали раствор кислого анилинфталата при 105°С. Препаративное выделение галактуроновой кислоты проводили хроматографией на бумаге БМ-18.
Все растворы упаривали в вакууме при 30-40°С.
Центрифугирование растворов проводили в течение 20 мин со скоростью 4000 - 6000 об/мин.
Кислотный гидролиз. Навеску полисахаридной фракции (3-5 мг) нагревали в запаянной ампуле 8 ч. при 100°С с 1 мл 2 М трифторуксусной кислоты, содержащей мио-инозит (0.3 мг). Гидролизат упаривали досуха, прибавляя по 0.5 мл метанола, и исследовали методами БХ и ГЖХ.
Выделение. Воздушно-сухое измельченное растительное сырье (110 г) последовательно экстрагировали в аппарате Сокслета метанолом и хлороформом. Полученный воздушно-сухой остаток сырья (100 г) несколько раз экстрагировали дис-тилированной водой (по 1 л) при перемешивании в гомогенизаторе (20°С) до отрицательной реакции по фенол-серному методу [11]. Остаток отделяли центрифугированием. Объединенный супернатант, содержащий раствор полисахарида, очищали от несвязанного белка следующим методом: экстракт концентрировали до половины объема и при интенсивном перемешивании подкисляли разбавленной уксусной кислотой до рН 4.5-4.8. Смесь выдерживали в течение 0.5 ч. и, если рН не повышался, оставляли на ночь при +5-10°С. Белок, выпавший в осадок, удаляли центрифугированием. Супернатант диализовали 2 сут. против дист. воды, концентрировали до 50-100 мл и осаждали 3-кратным объемом 96%-ного этанола. Выпавший осадок отделяли центрифугированием, растворяли в воде и лиофилизовали, получили силенан 8У1.
Остаток сырья экстрагировали дистилирован-ной водой при 70°С (по 1 л) до отрицательной реакции по фенол-серному методу [11]. Объединенные экстракты обрабатывали, как описано выше. Получили силенан 8У2, который объединяли с силенаном 8У1.
К остатку сырья добавляли подкисленную дист. воду (рН 4; 1 л) и при постоянном рН смесь выдерживали в течение 3 ч (50°С) при перемешивании. Обработанный остаток отделяли центрифугированием и экстрагировали 0.7 %-ным водным оксалатом аммония (по 1 л, 68°С). Экстракцию проводили до отрицательной реакции по фенол-
серному методу [11]. Экстракты центрифугировали, объединяли и концентрировали до 50-100 мл. Полисахарид осаждали из раствора 3-х кратным объемом 96-процентного этанола. Выпавший осадок отделяли центрифугированием, растворяли в минимальном количестве воды. Подкисленный раствор (рН 4) диализовали 2 сут против дистили-рованной воды и лиофилизовали. Получили фракцию SV3.
Полисахаридные фракции SVK1 и SVK2 выделяли из каллуса S. vulgaris аналогичным путем, но без очистки от несвязанного белка (рисунок 1 ).
Ионообменная хроматография полисахаридных фракций на ТЭАЭ-целлюлозе. Образцы силенанов SV1 и SV3 (100-150 мг), растворяли в воде (1 0 мл), фильтровали и фильтрат наносили на колонку (25 х 3 см; элюция 60 мл/ч) с ТЭАЭ-цел-люлозой (С1--форма). Отбирали фракции по 10 мл. Колонку элюировали последовательно 0.01 М, 0.1 М, 0.2 М, 0.3 М, 0.4 М и 1 М NaCl. Элюцию полисахаридов контролировали по фенол-серному методу [11]. Объединенные фракции диализовали и лиофилизовали. Получили полисахаридные фракции. Результаты приведены в таблице 2.
Идентификация галактуроновой кислоты. Образец силенана SV3 (20 мг) гидролизовали 2М трифторуксусной кислотой (5 мл) в течение 8 ч при 100°С в запаянной ампуле. Избыток кислоты удаляли 4-кратным упариванием, прибавляя по
0.5 мл метанола. Галактуроновую кислоту (6 мг), выделенную из гидролизата методом препаративной БХ, идентифицировали сравнением с заведомыми образцами, используя анализатор Biotronic LC-2000, как описано ранее [8].
Ферментативный гидролиз. Образцы силе-нанов (50 мг) растворяли в воде (20 мл), добавляли водный раствор пектиназы (2 мг, Ferak, Berlin), смесь инкубировали при 37°С в течение 3 ч. Далее реакционную смесь нагревали в течение 5 мин на водяной бане при температуре 1 00°С. Скоагули-рованный белок отделяли центрифугированием. Полученный супернатант концентрировали до
3 мл и добавляли в 96%-ный этанол (4-кратный объем). Осадок отделяли центрифугированием. Спиртовой супернатант концентрировали и анализировали методом БХ. Осадок растворяли в воде и повторно проводили ферментативный гидролиз в течение 2 ч, добавив 2 мг пектиназы. Полученную смесь обрабатывали, как описано выше. Остаток лиофилизовали, гидролизовали и анализировали методом БХ.
Выводы
1. Из широко распространенного растения Европейского Севера России смолевки обыкновенной Silene vulgaris и каллусной культуры этого растения впервые выделены и охарактеризованы пектиновые полисахариды: силенан SV1 и силе-нан SVK2 соответственно. Оба полисахарида близки друг другу по моносахаридному составу.
2. Из каллуса смолевки, кроме того, получен силенан SVK1, представляющий собой кислый арабиногалактан, отличный от пектина.
Благодарности
Авторы признательны профессору А.И. Усову за ценные консультации и помощь в идентификации галактуроновой кислоты.
Литература
1. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность // Биорг. хим. 1998. Т. 42. №7. С. 483-501.
2. Wagner H. Immunostimulants of plant origin // Croatica Chem. Acta. 1995. Vol. 68. Р. 615-626.
3. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование / Отв. ред. Ал.А. Федоров. Л., 1985. 571 с.
4. Ильина И.В. Народная медицина коми. Сыктывкар, 1997. 130 с.
5. Тагисбаев Е.Т., Писаев А.А. К исследованию химического состава и фармакодинамики выделенных веществ из корней смолевки широколистной // Тр. 24-й итог. науч. конф. Алма-Ата, 1963. С. 102-104.
6. Courtois J.-D., Courtois J.-E. Oligosaccharides of Silene inflata // Fac. Pharm. Paris. 1966. Vol. 28. P. 197-210.
7. Popov S.V., Bushneva O.A., Misharina E.A., Ovodova R.G. Characterization of chemical composition and phagocytic activity of S. vulgaris bioglycans // Intern. GlycoBioTechnol. Symp. 98. Brauschweig, 1998. P. 43.
8. Usov A.I., Bilan M.I., and Klochkova N.G. Polysaccharides of Algae. 48. Polysaccharide composition of several Calcareous Red Algae: Isolation of alginate from Corallinapilulitara // Bot. marina. 1995. Vol. 38. P. 43-51.
9. Родионова Н.А., Безбородов А.М. О локализации систем ферментов, катализирующих расщепление полисахаридов растительных клеточных стенок у высших растений. Пектиназы (обзор) // Прикл. биохим. микробиол. 1997. Т. 33. №5. С. 467-487.
10. Murashige T., Skoog S.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. P. 473-479.
11. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., and Smith F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances // Analyt. Chem. 1956. Vol. 28. Р. 350-356.
12. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., and Randall R.J. Protein measurement with the Fholin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.
13. York W.S., Darvill A.G., McNeil M.A, Stevenson T.T., Albersheim P. Isolation and characterization of plant cell walls and cell-wall components. // Meth. Enzymol. 1985. Vol. 118. Р. 3-40.
Поступило в редакцию 21.11.98
