CC BY
133
Биополимеры растений
УДК 577.114+57.021
ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕКТИНОВ И ИХ ГАЛАКТУРОНАНОВОГО КОРА*
© П.А. Марков , С.В. Попов, И.Р. Никитина, Р.Г. Оводова, Ю.С. Оводов
Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, ул. Первомайская, 50, Сыктывкар,
167982 (Россия). E-mail: marpa@physiol.komisc.ru
Установлено, что в зависимости от структуры пектиновые полисахариды из различных растений либо способны защищать стенку кишки млекопитающих от повреждения и ингибировать развитие воспаления, либо, напротив, обладают про-тивоспалительным действием. При этом показано, что галактуронан, выделенный из любого пектина и представляющий главную углеводную цепь (кор) его макромолекулы, проявляет выраженный противовоспалительный эффект.
Снижение количества нейтрофилов в стенке кишки после индукции воспаления указывает на то, что в основе противовоспалительного действия пектинов может лежать их влияние на функциональную активность лейкоцитов.
Ключевые слова: галактуронан, пектин, противовоспалительный эффект, колит
Работа выполнена в соответствии с планами НИР Учреждения РАН Института физиологии Коми НЦ УрО РАН на 2003-2005 гг. (ГР №01.200107401) и поддержана грантом ведущих научных школ (№ НШ-5796.2006.4), грантом РФФИ (.№06-04-48079), программами президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки - медицине».
Введение
Ранее установлено, что пектины при пероральном введении ингибируют развитие воспаления стенки кишки у экспериментальных животных, при этом исследования противовоспалительного действия пектинов при повреждении кишечной стенки проводились с использованием коммерческих пектинов, главным образом цитрусового и яблочного [1-4]. Данный подход не учитывает всего структурного разнообразия пектинов, встречающихся в природе. В то же время в ряде работ показано, что макромолекула пектинов, выделенных из разных растений, различается структурой линейной и разветвленной области [5-8].
Ранее было найдено [5], что действие пектинов на воспаление зависит от строения линейной и разветвленной области их макромолекулы. Так, например, галактуронановый фрагмент макромолекулы комарума-на CP ингибирует развитие воспаления [9], а апиогалактуронан, фрагмент разветвленной области макромолекулы лемнана LM, оказывает провоспалительное действие [10].
Связь между особенностями строения макромолекулы пектинов и их действием на воспаление кишечника не исследована.
Цель исследования - получить дополнительную информацию о действии пектинов на воспаление и выявить область макромолекулы пектинов, обусловливающую их противовоспалительную активность при повреждении кишечника у мышей.
Экспериментальная часть
Объект исследования. Пектины были выделены из разных растений и охарактеризованы сотрудниками Лаборатории гликологии и Лаборатории биотехнологии ИФ Коми НЦ УрО РАН. В работе использовали следующие
* Статья рекомендована к публикации оргкомитетом научно-практической конференции, посвященной 10-летию создания учебно-научного центра «Физико-химическая биология» в Республике Коми.
Автор, с которым следует вести переписку.
пектины: вакциниуман из ягод брусники Vaccinium vitis-idaea L. (VV), бергенан из листьев бадана толстолистного Bergenia crassifolia L. (BC), лемнан из ряски малой Lemna minor L. (LM), силенан из вегетативной части смолевки обыкновенной Silene vulgaris L. (SV), зостеран из морской травы Zostera marina L. (ZM) и алиуман из чеснока Allium sativum L. (АС). Выделение проводили по ранее описанной методике (патент РФ №2149642). Для сравнения использовали коммерческие пектины (МР Biomedicals): яблочный (АР) и цитрусовый (РС).
Галактуронановый фрагмент макромолекулы был выделен из следующих пектинов: комарумана СР, рау-вольфиана RS, лемнана LM, силенана SV и пектина яблочного АР. Для получения галактуронана пектин (1 г) подвергали частичному кислотному гидролизу 2 М TFA (200 мл) в течение 5 ч при 100 °C. Выпавший осадок отделяли центрифугированием, промывали 96% этанолом, растворяли в водном растворе аммиака, доводя рН раствора до 4,0-4,5. Полученный раствор диализовали в ультрафильтрационных ячейках (Millipore, США) через мембрану (полисульфон, 100 kDa) против постоянно сменяемой дистиллированной воды до полного отсутствия углеводов в диализате. Раствор после диализа лиофилизовали. Получили 250-270 мг галактуронана, [a]D20 = + 237,6° (с 0,17; вода), содержание галактуроновой кислоты 99%, следы рамнозы (менее 0,5%), метоксильные группы и примеси белка отсутствуют.
Животные. Исследования проводили на самках и самцах половозрелых белых лабораторных мышей A/HeJ массой тела 25-30 г, полученных из специализированного питомника «Рапполово» (ФГУП, РАМН). Животных содержали на диете с неограниченным доступом к воде и корму. Эксперименты на животных осуществляли в соответствии с рекомендациями по обращению с экспериментальными животными Комитета по биоэтике Коми НЦ УрО.
Введение полисахаридов животным. Навеску полисахаридов растворяли в воде непосредственно перед введением. Введение производили перорально (200 мг/кг) через пластиковый зонд (5 см), однократно утром, натощак, за два дня до индукции колита. Контрольные животные получали воду.
Индукция кишечного воспаления и его оценка. Воспаление толстой кишки у мышей вызывали разовым ректальным введением 5% уксусной кислоты (0,1 мл). Введение кислоты производили через мягкий катетер на 3 см проксимальней ануса [11]. Мышей умерщвляли через сутки и изолировали 5-сантиметровый фрагмент толстой кишки проксимальней ануса. Фрагмент кишки вскрывали, промывали от содержимого в физрастворе. С помощью светового микроскопа (х20) определяли степень и площадь поражения. Степень поражения выражали в баллах, используя при этом следующую шкалу: 0 - нет признаков воспаления, 1 - гиперемия, без язв и эрозий, 2 - поверхностные язвы без разрушения слизистой, 3 - язвы с разрушением слизистой, 4 - глубокие некротические язвы [12]. Площадь поражения выражали в процентах от общей площади фрагмента кишки. В качестве положительного контроля использовали преднизолон (5 мг/кг).
Определение активности миелопероксидазы (МПО). Изолированный фрагмент кишки очищали от содержимого, взвешивали и гомогенизировали в фосфатно-буферном растворе (PBS). Гомогенат центрифугировали при 10000*g в течение 20 мин, для анализа отбирали надосадочную жидкость (0,1 мл). Содержание МПО определяли спектрофотометрически. Полученный супернатант вносили в лунки 96-луночного плоскодонного планшета. К образцам добавляли 0,1 мл субстрата - раствора фосфатно-цитратного буфера, содержащего ор-то-фенилендиамин (0,4 мг/мл) и 0,015% Н202 [13]. Определяли оптическую плотность образцов при 492 нм с помощью спектрофотометра Power Wave 200 (Bio-Tek Instruments, USA). Активность МПО рассчитывали, используя калибровочный график, построенный для пероксидазы хрена (ПХ), и выражали в ед/мг сырой ткани.
Статистический анализ. При обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение, среднее квадратичное отклонение. Достоверность различий оценивалась по ^/-критерию Манна-Уитни, с использованием программного обеспечения «Statistica 6.0» (Stat Soft. Inc).
Результаты и их обсуждение
Исследовано действие пектинов на воспаление стенки толстой кишки у мышей, индуцированное уксусной кислотой. Установлено, что ряд пектинов оказывает действие только на отдельные параметры повреждения кишки. Так, например, алиуман AS снижает активность МПО в стенке кишки и уменьшает площадь поражения, но не действует на степень повреждения (рис. 1-3). Вакциниуман VV уменьшает степень и площадь поражения, но не действует на активность МПО в стенке кишки (рис. 1-3).
Обнаружено, что лемнан LM и силенан SV способствуют увеличению площади поражения стенки толстой кишки. Однако активность МПО и степень повреждения остаются на уровне, характерном для мышей, получавших до индукции воспаления воду.
40
*30
контроль ВС І.М $У 2М А$ УУ РС АР ПН
Рис. 1. Площадь поражения стенки толстой кишки у мышей при пероральном введении пектинов (200 мг/кг), за 48 ч до ректального введения уксусной кислоты. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество животных - 7. * - различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05. Контроль: вода, ВС - бергенан, ЬМ - лемнан, 8У - силенан, 2М - зостеран, Л8 - алиуман, УУ - вакциниуман, РС - пектин цитрусовый, АР - пектин яблочный, ПН - преднизолон
контроль ВС ЬМ ЭУ гм АЭ УУ РС АР ПН
Рис. 2. Степень повреждения стенки толстой кишки у мышей при пероральном введении пектинов (200 мг/кг), за 48 ч до ректального введения уксусной кислоты. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество животных - 7. - различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05. ПН - преднизолон
200
контроль ВС ЬМ 5У гм АЭ УУ РС АР ПН
Рис. 3. Активность МПО в стенке толстой кишки у мышей при пероральном введении пектинов (200 мг/кг) за 48 ч до ректального введения уксусной кислоты. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество животных - 7. * - различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05. ПН - преднизолон
Зостеран ZM, бергенан BC, пектин цитрусовый PC и пектин яблочный AP не оказывают действия на повреждение стенки кишки при химическом поражении. У мышей, получивших эти пектины, и у контрольных мышей, получивших воду до индукции воспаления, отмечаются сравнимые активность МПО, площадь и степень поражения стенки толстой кишки (рис. 1-3).
Полученные данные свидетельствуют не только о том, что физиологическая активность пектинов зависит от их структуры, но и о том, что механизмы действия пектинов на воспаление могут различаться. Таким образом, выявлено, что не все пектины оказывают противовоспалительное действие.
Ранее нами было показано, что пектины, выделенные из сабельника болотного Comarum palustre L. [14], ягод клюквы четырехлистной Vaccinium oxycoccos L. [15] и каллуса раувольфии змеевидной Rauwolfia serpentina [16], ингибируют развитие кишечного воспаления у мышей. Однако не известно, почему, обладая одним типом строения и близким качественным составом, одни пектины снижают воспаление, другие стимулируют провоспалительное реакции, а третьи не оказывают никакого действия на развитие воспаления. Поэтому сравнивали строение пектинов, предотвращающих (комаруман СР) и не предотвращающих (бергенан ВС) воспаление, а также пектинов, вызывающих увеличение площади поражения после индукции воспаления толстой кишки у мышей (лемнан LM и силенан SV).
В основе макромолекулы всех пектиновых полисахаридов лежит линейная цепь из 1,4-связанных остатков a-D-галактопиранозилуроновой кислоты, образующих фрагменты линейного галактуронана [5]. Исследованные пектины различаются строением разветвленных областей. Разветвленная область макромолекулы лемнана LM представлена апиогалактуронаном [5, 7, 17, 18]. В силенане SV (6), комарумане CP [8] и берге-нане BC [19] она представлена рамногалактуронаном-I (RG-I). Несмотря на однотипное строение разветвленной области этих пектинов, только комаруман CP, имеющий разветвленную главную углеводную цепь галактуронана [5, 8], предотвращает развитие повреждения стенки кишки. Строение боковых областей лемнана LM и силенана SV различно, однако оба пектина вызывают провоспалительную реакцию при химическом поражении стенки кишки.
Таким образом, не все пектины, разветвленная область которых представлена RG-I, обладают противовоспалительным действием. Стимулировать воспаление стенки кишки могут как рамногалактуронановые, так и апиогалактуронановые пектины. Действие пектинов на воспаление, по-видимому, определяется иными особенностями их строения, такими как расположение разветвленных областей на основной углеводной цепи, структура боковых цепей макромолекулы пектинов.
Следующим этапом исследования было выявить действие линейной области пектиновой макромолекулы на воспаление.
Образцы галактуронана были выделены из пектинов, обладающих (комаруман CP, раувольфиан RS) и не обладающих (лемнан LM, силенан SV и пектин яблочный AP) защитным действием на стенку кишки. При оценке противовоспалительной активности образцов галактуронанов: комарумана (CPH), раувольфиана (RSH), лемнана (LMH), силенана (SVH) и пектина яблочного (APH) установлено, что все они защищают стенку толстой кишки от химического повреждения. Площадь поражения стенки кишки уменьшается более чем в два раза после перорального введения галактуронанов (рис. 4). Степень повреждения (рис. 5) и активность МПО (рис. 6) в стенке толстой кишки снижаются более чем на 50% у мышей, получивших галактуро-наны, по сравнению с животными, получившими воду.
Таким образом, установлено, что защитное действие пектинов при повреждении стенки толстой кишки мышей обусловлено галактуронаном, представляющим собой главную углеводную цепь макромолекулы пектина, ее кор. Противовоспалительное действие свойственно всем галактуронанам, независимо от противовоспалительной активности исходных пектинов.
В результате проведенных исследований установлено, что не все пектиновые полисахариды способны защищать стенку кишки млекопитающих от повреждения и ингибировать развитие воспаления. В то же время в макромолекуле любого пектина ее главная углеводная цепь а-1,4^-галактопиранозилуронан потенциально обладает противовоспалительным действием. По всей видимости, строение или расположение боковых цепей на коре макромолекулы пектинов является тем фактором, который определяет действие пектинов на воспаление. Возможно, что боковые цепи пектинов, обладающих противовоспалительным действием, менее устойчивы к гидролитическим факторам гастроэнтеральной полости млекопитающих, что способствует образованию слаборазветвленных галактуронановых фрагментов, которые и взаимодействуют с клетками-мишенями. Механизмы такого взаимодействия пока не изучены. Исследование молекулярных механизмов взаимодействия пектинов с клетками-мишенями позволит найти новые способы регуляции растительными полисахаридами функционального состояния органов и систем организма млекопитающих.
25
контроль СРН RSH LMH SVH АРН
Рис. 4. Площадь поражения стенки толстой кишки у мышей при пероральном введении галактуронанов (200 мг/кг), за 48 ч до ректального введения уксусной кислоты. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество животных - 7. *
- различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05
контроль СРН RSH SVH LMH АРН
Рис. 5. Степень повреждения стенки толстой кишки у мышей при пероральном введении галактуронанов (200 мг/кг), за 48 ч до ректального введения уксусной кислоты. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество животных - 7. *
- различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05
Рис. 6. Активность МПО в стенке толстой кишки у мышей при пероральном введении галактуронанов (200 мг/кг), за 48 ч до ректального введения уксусной кислоты. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество животных - 7.
* - различия достоверны ПО сравнению С контроль СРН 1«Н [_МН $'/Н АРН
контролем при р<0,05
Выводы
1. Показано, что противовоспалительное действие пектиновых полисахаридов обусловлено их главной углеводной цепью - галактуронановым кором макромолекулы.
2. Найдено, что галактуронан ингибирует развитие воспаления стенки толстой кишки независимо от противовоспалительной активности исходного пектина.
3. Сравнение пектинов с различной структурой разветвленной области указывает на отсутствие существенного влияния данной области макромолекулы на противовоспалительную активность пектинов.
Список литературы
1. Rolandelli H.R., Saul S.H., Settle R.G., Jacobs D.O. Comparison of parenteral nutrition and enteral feeding with pectin in experimental colitis in the rat // Am. J. Clin. Nutr. 1988. V. 47. Pp. 715-721.
2. Mao Y., Kasravi B., Nobaek S., Wang D., Jeppsson B. Pectin-supplemented enteral diet reduces the severity of methotrexate induced enterocolitis in rats // Scand. J. Gastroenterol. 1996. V. 31(6). Pp. 558-567.
3. Liu L., Wang Z., Pan B., Zhou S. Effect of Rheum tanguticum polysaccharide on TNBS-induced colitis and CD4+T cells in rats // Word. J. Gastoenterol. 2003. V. 9. Pp. 2284-2288.
4. Lim B.O., Lee S.H., Choue R.W. Effect of dietary pectin on the production of immunoglobulins and cytokines by mesenteric lymph node lymphocytes in mouse colitis induced with dextran sulfate sodium // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. V. 67(8). Pp. 1706-1712.
5. Оводов Ю.С., Головченко В.В., Гюнтер Е.А., Попов С.В. Пектиновые вещества растений Европейского севера России. Екатеринбург, 2009. 111 с.
6. Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Шашков А.С., Оводов Ю.С. Выделение и исследование строения полисахаридов из смолевки обыкновенной Silene vulgaris // Биоорган. химия. 2000. Т. 26. №9. С. 686-692.
7. Оводова Р.Г., Головченко В.В., Шашков А.С., Попов С.В., Оводов Ю.С. Структурное исследование и физиологическая активность лемнана, пектина из Lemna minor L. // Биоорган. химия. 2000. Т. 26. С. 743-751.
8. Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Шашков А.С., Чижов А.О., Оводов Ю.С. Структурное изучение пектина сабельника болотного Comarumpalustre L. // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 1051-1062.
9. Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G., Ovodov Yu.S. Antiinflammatory activity of the pectic polysaccharide from Comarum palustre // Fitoterapia. 2005. V. 76. Pp. 281-287.
10. Popov S.V., Ovodova R.G., Ovodov Yu.S. Effect of lemnan, pectin from Lemna minor L., and its fragments on inflammatory reaction // Phytother. Res. 2006. V. 20. Pp. 403-407.
11. Itoh H., Kataoka H., Tomita M., Hamasuna R., Nawa Y., Kitamura N., Koono M. Upregulation of HGF activator inhibitor type 1 but not type 2 along with regeneration of intestinal mucosa // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 2000. V. 278. P. 635.
12. Mahgoub A. Evaluating the prophylactic potential of zafirlukast against the toxic effects of acetic acid on the rat colon // Toxicol. Lett. 2003. V. 145(1). Pp. 79-87.
13. Пинегин Б.В., Бутаков А.А., Челкина Т.Л. Экологическая иммунология. Комплекс методов для определения функциональной активности фагоцитов / под ред. Р.М. Хаитова, Б.В. Пинегина, Х.И. Истамова. М., 1995. С. 146154.
14. Popov S.V., Ovodova R.G., Markov P.A., Nikitina I.R., Ovodov Yu.S. Protective effect of Comaruman, pectin of cinquefoil Comarum Palustre L., on acetic acid induced colitis in mice // Dig. Dis. Sci. 2006. V. 51. Pp. 1532-1537.
15. Popov S.V., Markov P.A., Nikitina I.R., Petrishev S.V., Smirnov V.V., Ovodov Yu.S. Preventive effect of a pectic polysaccharide of the common cranberry Vaccinium oxycoccos L. on acetic acid-induced colitis in mice // World J. Gastroenterol. 2006. V. 41. Pp. 6646-6651.
16. Попов С.В., Винтер В.Г., Патова О.А., Марков П.А., Никитина И.Р., Оводова Р.Г., Попова Г.Ю., Шашков А.С., Оводов Ю.С. Химическая характеристика и противовоспалительное действие раувольфиана, пектинового полисахарида каллуса раувольфии змеиной // Биохимия. 2007. Т. 72. С. 778-784.
17. Оводов Ю.С. Современные представления о пектиновых веществах // Биоорг. химия. 2009. Т. 35. С. 1-9.
18. Golovchenko V.V., Ovodova R.G., Shashkov A.S., and Ovodov Yu.S. Structural studies of the pectic polysaccharide from duckweed Lemna minor L. // Phytochemistry. 2002. V. 60. Pp. 89-97.
19. Головченко В.В., Бушнева О.А., Оводова Р.Г., Шашков А.С., Чижов А.О. Оводов Ю.С. Структурное изучение бергенана, пектина из Bergenia crassifolia // Биоорган. химия. 2007. Т. 33. С. 54-63.
Поступило в редакцию 22 октября 2010 г.
