CC BY
92
Химия растительного сырья. 2001. №2. С. 63-67.
УДК 577.114:581.143.6:577.175.1 ПОЛИСАХАРИДЫ ИЗ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ LEMNA MINOR L.
© Е.А. Гюнтер
Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, ул. Первомайская, 50, Сыктывкар, 167982 (Россия) e-mail: elena@physiol. komisc. ru
Целью настоящей работы была общая химическая характеристика полисахаридов, выделенных из каллусной культуры Lemna minor L. Полисахариды каллуса L. minor представляют собой нейтральный и кислый арабиногалактаны, пектин. В состав углеводной цепи пектина входят остатки галактуроновой кислоты (66%), арабинозы и галактозы в качестве основных компонентов.
Введение
Клеточные культуры растений являются альтернативным источником получения растительных полисахаридов. С помощью их можно получить нативные полисахариды с большим выходом, чем из интактных растений [1, 2]. В последние годы из культур растительных клеток выделены такие полисахариды, как пектины, арабиногалактаны, галактаны, арабинаны, ксилоглюканы [3, 4].
Ряска малая (Lemna minor L.) - водное растение семейства рясковых (Lemnaceae), широко распространенное на европейской части России. Из ряски выделен редко встречающийся в природе пектиновый полисахарид (лемнан), являющийся апиогалактуронаном, и обладающий иммуномодулирующей активностью [5-7].
Целью настоящей работы является общая химическая характеристика полисахаридов, выделенных из каллусной культуры Lemna minor L.
Результаты
С целью изучения биосинтетических характеристик каллусной культуры Lemna minor L. было проведено выделение полисахаридов из образцов молодого каллуса, полученного на питательных средах с различным содержанием фитогормонов, и стабильного каллуса, выращенного на оптимальной для роста питательной среде (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) 1.0 мг/л + 6-бензиламинопурин (БАП), 0.5 мг/л). К этому времени ткань адаптировалась к питательной среде и имела стабильные ростовые параметры.
Из молодых каллусных культур ряски выделены полисахариды экстракцией водой (I фракция) и раствором оксалата аммония (II фракция). Найдено, что выходы полисахаридов I фракции (0.8-1.0%), содержание в них белка (31-38%) и моносахаридный состав близки для всех каллусов, выращенных на средах с различным соотношением ауксина и цитокинина (табл. 1). При анализе моносахаридного состава показано, что остатки галактозы и арабинозы преобладают, другие моносахариды, такие как
ксилоза, глюкоза, рамноза, манноза, содержатся в небольшом количестве, остатки гликуроновых кислот отсутствуют.
Выходы полисахаридов II фракции изменяются в зависимости от гормональных условий культивирования каллуса и составляют 3.5-5.1% (табл. 1). Максимальный выход наблюдали при соотношении ауксина и цитокинина, равном 1 : 2 (5.1%). Содержание белка составляет 9-11%. Методом ГЖХ показано, что галактоза и арабиноза содержатся в большем количестве, чем другие моносахариды (ксилоза, глюкоза, рамноза, манноза, апиоза). Процентное содержание гликуроновых кислот составляет 17-31% в образцах каллуса, культивированного на различных средах.
Из стабильной каллусной культуры L. minor исчерпывающей водной экстракцией получена фракция LI с выходом 2%. В составе фракции обнаружены остатки следующих моносахаридов: галактоза, арабиноза, глюкоза, рамноза, манноза, ксилоза, гликуроновые кислоты (10%), среди которых первые два являются основными (табл. 2).
Для того чтобы выделить пектиновый полисахарид из нерастворимого протопектина, остаток растительного сырья обрабатывали подкисленной водой (рН 4) и экстрагировали 0.7% водным раствором оксалата аммония. В результате была получена полисахаридная фракция LII, выход которой составляет 3.5%. Аналитические данные этой фракции приведены в таблице 2. В моносахаридном составе фракции преобладают остатки галактуроновой кислоты (66%), галактозы и арабинозы. Остатки апиозы, рамнозы, маннозы, глюкозы и ксилозы присутствуют в меньшем количестве.
Таблица 1. Характеристика полисахаридов, выделенных из молодой каллусной культуры Lemna minor L.
Концентрация гормонов в среде, мг/л 2,4-Д, 0.5 + БАП, 1.0 2,4-Д, 1.0 + БАП, 0.5 2,4-Д, 1.0 + БАП, 1.0
Полисахаридная фракция I II I II I II
Выход полисахарида*, % 1.0 5.1 0.8 4.5 0.8 3.5
Содержание, %:
Белок 37.8 11.2 34.0 10.4 31.0 8.9
Гликуроновые кислоты 0 16.5 0 30.8 0 18.0
Моносахаридный состав, вес. %:
Api 0 0 0 0.5 0 1.1
Rha 1.5 0.8 1.4 0.9 1.8 1.3
Ara 13.5 3.3 19.2 3.6 18.8 4.9
Xyl 5.6 2.8 6.3 2.2 7.3 2.2
Man 1.4 1.0 1.7 0.6 1.5 0.7
Glc 7.2 2.8 5.8 1.8 6.9 4.3
Gal 48.3 5.2 47.4 5.3 50.8 7.4
Примечание. *Выход полисахарида на сухую биомассу после обработки метанолом и хлоро
ормом.
Таблица 2. Аналитические данные полисахаридов, выделенных из стабильной каллусной культуры
Lemna minor L.
Фракция Выход*, Белок, Гликуроновые Мо но О О х р д й состав, вес. %
% % кислоты, % Api Rha Ara Xyl Man Glc Gal
LI 2.0 24.9 9.5 0 3.4 8.3 1.7 2.5 3.1 18.3
LII 3.5 21.3 65.6 1.4 1.9 7.2 4.8 1.2 2.1 8.0
Примечание. *Выход полисахарида на сухую биомассу после обработки метанолом и хлороформом.
Экспериментальная часть
Сырье. Каллусную культуру ряски малой культивировали на модифицированной среде Мурасиге и Скуга [8] с добавлением различных сочетаний ауксина 2,4-Д и цитокинина БАП. В экспериментах были использованы такие комбинации фитогормонов: 2,4-Д, 0.5 мг/л + БАП, 1.0 мг/л; 2,4-Д, 1.0 мг/л + БАП, 1.0 мг/л; 2,4-Д, 1.0 мг/л + БАП, 0.5 мг/л. Стабильно растущую каллусную ткань получали на среде с 2,4-Д, 1.0 мг/л + БАП, 0.5 мг/л. Каллус субкультивировали с интервалом в 28 суток при 26 ± 1 °С в темноте.
Общие аналитические методы. Общее содержание углеводов определяли фенол-сернокислотным методом [9], уроновых кислот - по реакции с конц. И2804 и с 2,3-диметилфенолом [10], белка - по методу Лоури [11]. Спектрофотометрические измерения проводили на приборе иіїгоєрес 3000.
Газожидкостную хроматографию (ГЖХ) выполняли на хроматографе Иетс^еИ-РаскаМ 4890А. Процентное содержание моносахаридов вычисляли из площадей пиков, используя молярные коэффициенты.
Все растворы упаривали на роторных испарителях в вакууме при 40-45°С. Центрифугировали растворы в течение 10 мин со скоростью 6000-7000 об/мин.
Выход полисахаридов был рассчитан на сухую биомассу после обработки метанолом и хлороформом.
Кислотный гидролиз. Навеску полисахаридной фракции (2 мг) гидролизовали с 2 М трифторуксусной кислотой при 100°С в течение 3 ч. Моносахаридный состав определяли методом ГЖХ, переводя моносахариды в соответствующие ацетаты полиолов [12].
Выделение полисахаридных фракций. Каллусную ткань обрабатывали в аппарате Сокслета органическими растворителями (метанолом и хлороформом) для удаления низкомолекулярных примесей. Полученный воздушно-сухой остаток биомассы несколько раз экстрагировали водой (по 0.5 л, 2 ч) при 50°С до отрицательной реакции на углеводы по фенол-сернокислотному методу [9]. Биомассу отфильтровывали через капроновый фильтр. Объединенные водные экстракты концентрировали в вакууме на роторном испарителе, центрифугировали, полисахарид осаждали 2-кратным объемом 96 %-ного этанола и оставляли на сутки в холодильнике. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в дистиллированной воде, диализовали 3 суток против дистиллированной воды, центрифугировали, супернатант лиофилизовали. В результате получили полисахаридные фракции I и Ь1.
Остаток сырья после водной экстракции обрабатывали раствором соляной кислоты (рН 4, 0.5 л) при 50°С в течение 3 ч. Затем биомассу промывали водой и экстрагировали 0.7 %-ным водным оксалатом аммония (по 0.5 л, 2 ч) при 68°С до отрицательной реакции на углеводы по фенол-сернокислотному методу [9]. Экстракты отфильтровывали, объединяли, концентрировали, центрифугировали. Полисахарид осаждали 2-кратным объемом 96%-ного этанола. Выпавший осадок отделяли центрифугированием, растворяли в воде, подкисляли соляной кислотой до рН 4.7, диализовали 3 суток против дистиллированной воды и лиофилизовали. В результате получили полисахаридные фракции II и ЬІІ.
Обсуждение результатов
Исходя из полученных данных можно предположить, что в результате экстракций из молодой каллусной культуры ряски малой выделены нейтральный арабиногалактан (фракция I) и кислый
арабиногалактан (фракция II). Из стабильного каллуса ряски также получен кислый арабиногалактан (фракция LI). Кислый характер арабиногалактана обусловливается наличием остатков D-галактуроновой кислоты [13].
Известно, что арабиногалактан - это один из полисахаридов, которые синтезируются клеточными культурами in vitro. Арабино-содержащие макромолекулы являются предшественниками и одним из составляющих пектинов первичных клеточных стенок растений [14, 15]. Полученные нами арабиногалактаны, вероятно, являются предшественниками синтеза пектина ряски.
Присутствие в большом количестве галактуроновой кислоты (66%) в фракции LII, выделенной из стабильного каллуса, указывает на принадлежность этого полисахарида к классу пектинов. В составе фракции обнаружены в небольшом количестве остатки апиозы.
Из литературных источников известно, что в нативном растении содержится пектиновый полисахарид (апиогалактуронан), в состав углеводной цепи которого входят остатки галактуроновой кислоты (60%), апиозы, рамнозы, галактозы, арабинозы, ксилозы и небольшие количества маннозы и глюкозы. Характерным для лемнана является высокое содержание апиозы [5-7].
Можно предположить, что полисахаридная фракция LII из стабильной каллусной культуры является пектином, подобным пектину из нативного растения.
Во время стабилизации каллусной культуры Lemna minor происходит изменение состава полисахаридов, синтезируемых клетками.
Выводы
1. Каллусные культуры Lemna minor разного возраста отличаются по составу полисахаридов.
2. Из молодой каллусной культуры L. minor , полученной на питательных средах с различным содержанием фитогормонов, выделены и охарактеризованы нейтральный и кислый арабиногалактаны.
3. Полисахариды стабильной каллусной культуры L. minor представлены кислым арабиногалактаном и пектином.
Список литературы
1. Мишарина Е.А., Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Оводов Ю.С. Каллусообразование Silene vulgaris (Moench) Garcke in vitro // Растительные ресурсы. 1999. Т. 35. Вып. 2. С. 88-95.
2 . Бушнева О.А., Оводова Р.Г., Мишарина Е.А. Силенаны - полисахариды смолевки обыкновенной Silene vulgaris // Химия растительного сырья. 1999. №1. С. 27-32.
3. Goubet F., Morvan C. Synthesis of Cell Wall Galactans from Flax (Linum usitatissimum L.) Suspension-Cultured Cells // Plant Cell Physiol. 1994. V. 35. №5. P. 719-727.
4. Takeuchi Y., Nishiyauchi K., Aoyama K., Sato A. Polysaccharides in Primary Cell Walls of Japanese Cypress Cells in
Suspeension Culture // Phytochemistry. 1996. V. 41. №2. P. 461-463.
5. Cheng L., Kindel P.K. Detection and Homogeneity of Cell Wall Pectic Polysaccharides of Lemna minor // Carb. Res.
1997. V. 301. P. 205-212.
6. Ovodov Y.S., Ovodova R.G., Popov S.V., Bil'kova T.B. Studies on Lemnan from Lemna minor in a comparison with
Zosteran as Apiogalacturonan Pectic Polysaccharide from Zosteraceae Family // Abstr. XIXth Intern. Carbohydr. Symp.
San Dieego, August 9-1 4, 1 998. P. DP041 .
7 . Оводова Р.Г., Билькова Т.Б., Попов С.В. Выделение и характеристика лемнана - полисахарида из ряски Lemna minor // Лесохимия и органический синтез: Тез. докл. III Всерос. совещ. Сыктывкар, 28 сентября - 2 октября 1998. Сыктывкар, 1998. С. 67.
8. Murashige T., Skoog S. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-479.
9. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., and Smith F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances // Anal. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.
10. Usov A.I., Bilan M.I., Klochkova N.G. Polysaccharides of Algae. 48. Polysaccharide Composition of Several Calcareous Red Algae: Isolation of Alginate from Corallinapilulitara // Bot. marina. 1995. V. 38. P. 43-51.
11. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., and Randall R.J. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.
12. York W.S., Darvill A.G., McNeil M.A., Stevenson T.T., Albersheim P. Isolation and Characterisation of Plant Cell Walls and Cell-Wall Components // Meth. Enzymol. 1985. V. 188. P. 3-40.
13. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность // Биоорган. химия.
1998. Т. 42, №7. С. 483-501.
14. Takeuchi Y., Komamine A. Changes in the Composition of Cell Wall Polysaccharides of Suspension-Cultured Vinca rosea Cells during Culture // Physiol. Plant. 1978. V. 42. P. 21-28.
15. Kawasaki S. Synthesis of Arabinose-Containing Cell Wall Precursors in Suspension-Cultured Tobacco Cells II. Partial Purification and Some Physical Characterization of an Intracellular Precursor of Cell Wall Glycoproteins // Plant & Cell Physiol. 1982. V. 23. P. 1443-1452.
Поступило в редакцию 9 декабря 2000 г.
