CC BY
24
УДК 597.41.442.574.24
ВЛИЯНИЕ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ И ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ НА СОЗРЕВАНИЕ ИКРЫ И ЭМБРИОНАЛЬНО-ЛИЧИНОЧНОЕ РАЗВИТИЕ КАРПА (CYPRINUS CARPIO L.)
2008 г. А.Р. Исуев1, С.И. Исмаилова1, М.М. Магомедов2
1 Дагестанский государственный университет, 367000, Дагестан, Махачкала, ул. Гаджиева, 43а, bio@doc.dgu.ru
2 Дагестанская государственная медицинская академия, 367012, Дагестан, Махачкала, пл. Ленина, 2, dgma@iwt.ru
1 Dagestan State University, 367000, Dagestan, Makhachkala, Gadjiev St.,43a, bio@doc.dgu.ru
2 Dagestan State Medical Academy, 367012, Dagestan, Makhachkala, Lenin Sq., 2, dgma@iwt.ru
Показано, что введение вышеназванных ксенобиотиков в материнский организм в период созревания ооцитов приводит к торможению созревания яйцеклеток, вызывает разнообразные уродства у зародышей, изменяет сроки вылупления предличинок и индуцирует в зародышах монооксигеназные активности. Предполагается, что индукция монооксигеназных активностей является одним из адаптивных биохимических механизмов, увеличивающих скорость метаболизирования ксенобиотиков.
Ключевые слова: полициклические ароматические углеводороды, полихлорированные бифенилы, созревание икры, эмбрионально-личиночное развитие карпа.
Influence of 3-methylcholantren and Sovola 54 on maturing ооcytes and embriogenesis ofjuvenile larva of a carp (Cyprinus Carpio L.) are studed. It is shown, that introduction mentioned xenobiotics in a parent organism during maturing ооcytes leads to braking of maturing ооcytes, causes various uglinesses in germs, changes terms of hatching out juvenile larva and induces in germs monooxygenase activities. It is supposed, that the induction of monooxygenase activities is one of the adaptive biochemical mechanisms, increasing the rate of metabolism by xenobiotics.
Keywords: polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyl, maturing of caviar, juvenile larva development of a carp.
Разнообразное вмешательство человека в окружающую среду приводит к нарушению жизнедеятельности организма и его воспроизводительной способности.
Важным является изучение влияния химического загрязнения на зародышевое развитие рыб, так как нарушение эмбриогенеза приводит к получению неполноценного потомства и таким путем оказывает влияние на популяцию.
Особую опасность представляет загрязнение гидросферы полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) и полихлорированными бифенилами (ПХБ), ибо они обладают широким спектром действия на живые организмы.
Некоторые из них имеют хорошо выраженные мутагенные свойства [1]. В связи с этим представляет интерес использование в качестве биомаркеров ферментов монооксигеназной системы, играющих важную роль в метаболизме мутагенных веществ [2 - 4].
Исследование посредством отобранных биологических ответов (будь то биотесты или биоиндикаторы) на стресс позволяет заранее обнаружить нарушение в окружающей среде (индикаторы раннего предупреждения) и дает возможность проникнуть в суть причинных отношений между стрессом и эффектами, которые могут быть, в конце концов, обнаружены на популяционном уровне и на уровне сообщества. Именно этот контроль в сложившейся ситуации экономически доступен и чрезвычайно актуален, поскольку позволяет изучить интегральные характеристики опасности вносимого в водоемы загрязнения и одновременно служит базовой информацией о необходимой полноте химического, физического и аэрокосмического мониторинга.
Основная идея биоиндикаторного подхода в биомониторинге заключается в том, что эффект загрязнения проявляется на низших уровнях биологической организации (на молекулярном, клеточном и тканевом) раньше глубоких нарушений, обнаруживаемых на популяционном и экологическом уровнях. Воздействие загрязнения обычно выражается сначала на мо-лекулярно-биохимическом уровне. Эти результаты обнаруживаются в виде изменений активности ферментов, клеточных мембран или генетического материала. Модификации на этих субклеточных уровнях вызывают ряд структурных и функциональных изменений на следующем, более высоком уровне биологической организации, которые могут быть причиной ухудшения комплексных процессов, таких как электролитический баланс, нормальное функционирование иммунной системы и т.д. Эти последствия в свою очередь могут изменять способность организма к росту, размножению и выживанию. В конце концов, необратимые и вредные эффекты могут наблюдаться в популяции, на уровне сообщества или экосистемы.
В связи с этим мы использовали интегральный метод биомониторинга с целью исследовать воздействие ПАУ и ПХБ на созревание ооцитов, эмбриогенез и развитие предличинок карпа.
Предлагаемое исследование актуально в связи с тем, что испытуемые ксенобиотики все более загрязняют гидросферу, становятся постоянно действующими факторами среды, и изучение особенностей раннего развития и размножения рыб в этих условиях представляет несомненный интерес.
Материал и методы исследования
Опыты проводили в марте, октябре и ноябре 20042005 гг. Для каждого опыта использовали по 15 особей карпа. Полученную зрелую икру переносили (по 100 шт.) в эксикаторы и инкубировали при температуре 20,0±1,0 °С. Вылупление в контроле начиналось на 3,5 - 4-е сут.
Рыб содержали в аэрируемых аквариумах при температуре 16-18 °С. После двухнедельной адаптации самкам вводили 3-метилхолантрен (3-МХ) и смеси ПХБ - совол 54 в растворе оливкового масла из расчета 20 мг/кг веса для 3-МХ и 100 мг/кг веса для совола. При этом объем вводимого оливкового масла не превышал 0,5 мл. Одной из контрольных групп рыб вводили чистое оливковое масло. В конце 7-х сут после инъекции всем рыбам вводился экстракт гипофиза для индуцирования созревания половых продуктов. Через 27-28 ч после инъекции получали зрелую икру.
Выделение микросом проводили по методу Джадова [5].
Икру гомогенизировали в растворе, содержащем 1,15 % КС1, 50 ммоль К-фосфатный буфер, рН-7,6. Гомогенат центрифугировали при 15000 g в течение 20 мин на центрифуге «НИасЫ-850». Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость еще раз центрифугировали при тех же условиях.
Далее надосадочную жидкость центрифугировали при 105000 g в течение 1 ч. Осадок использовали в качестве фракции микросом.
Монооксигеназная активность микросом определялась на спектрофотометре «Ш1асЫ-850» по 0-деал-килированию 7-этоксикумарина «Ш1асЫ-850» [6].
Среда инкубации содержала фосфатный буфер 50 ммоль рН-7,6, 1 мг/мл микросомального белка, 5 ммоль НАДФ (Н), 0,1 ммоль 7-этоксикумарина. После добавления в реакционную смесь 10 мкл 10 ммоль НАДФН регистрировали скорость возрастания флуоресценции продукта реакции 7-этоксикумарина при 460 нм (возбуждающего света 360 нм) при постоянном перемешивании и температуре 22-24 °С. Для калибровки в каждую пробу добавляли 10 мкл 0,2 ммоль раствора 7-этоксикумарина (2 нмоль) в фосфатном буфере, рН-7,6.
Скорость реакции выражали в нмоль 7-этоксикумарина в минуту на нмоль ци-тохрома (или мг белка).
Содержание Р-450 определяли по методу Омура и Сато [7], по характерным окисленным и восстановленным спектрам. Определение белка проводили по методу Лоури [8]. Результаты обработаны методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений с последующей оцен-
кой различий с использованием критерия Стьюдента. В таблицах и тексте приведены следующие обозначения: Х - средняя величина; тх - ошибка средней; п - число вариантов; р - степень достоверности различия.
Результаты и их обсуждение
Инъекция самкам карпа 3 -МХ приводила к задержке созревания яйцеклеток на 20-24 ч. При этом, если в контроле процент оплодотворенной икры не снижался ниже 90, то при действии 3-МХ этот показатель составил 75±7 %, а при действии совола- 65±5 %.
Как видно, введение 3-МХ в период созревания половых клеток ведет к изменению клеточных процессов, влияющих на оплодотворение яйцеклеток.
При дальнейшей инкубации и развитии зародышей карпа в различных концентрациях 3 -МХ наблюдались также и хорошо выраженные морфологические изменения. Результаты наблюдений за развитием икры представлены в табл. 1, 2. Патогенное действие усиливается при увеличении концентрации. Это проявляется в значительной гибели зародышей на первых стадиях развития и в появлении большого количества уродливых зародышей.
Так, уже при концентрации 0,1 мг/л количество зародышей, погибших в оболочках, в 1,7 раза выше, чем в контроле.
При более высоких концентрациях смертность достигает 50-80 % и более. Развитие икры в растворах 3-МХ концентрации 1,0-5,0 мг/л прекращалось к началу гаструляции.
Влияние сказывается также на сроках вылупления и характере уродств. Прежде всего, отметим, что при концентрациях 0,1-5,0 мг/л вылупление зародышей из оболочек происходило преждевременно. Зародыши имели ряд нарушений в строении, характер уродств зависел от концентрации 3-МХ. При концентрации 0,1 мг/л у вылупившихся зародышей в основном отмечены нарушения сердечно-сосудистой системы и кровообращения. Одни погибали на 3-5-е сут после вылупления, некоторые же продолжали жить дольше. В концентрациях 1,0-5,0 мг/л наблюдали такие уродства, как искривление тела, недоразвитие туловищного и хвостового отделов, отсутствие отолитов, недоразвитие сердца, нек-
Таблица 1
Гибель ранних зародышей карпа под воздействием 3-МХ, %
Серия опытов Контроль Концентрация 3-МХ, мг/л
0,05 0,1 0,5 1,0 2,0 5,0
1 8,5 7,0 14,5 30,5 60,2 75,0 88,1
2 7,2 7,8 12,4 31,07 61,8 73,2 91,4
3 8,0 6,6 12,0 28,02 58,3 76,4 86,3
X±mx 7,81±0,7 9,1±1,2 12,0±0,9 30,1 60,1±2,5 74,8±3,1 88,6±4,2*
здесь и в табл. 2: достоверные различия на уровне 0,01-0,05.
Процесс вылупления предличинок карпа под воздействием 3-МХ, %
Таблица 2
Серия опытов Контроль Концентрация 3-МХ, мг/л
0,05 | 0,1 | 0,5 11,0 | 2,015,0 0,05 | 0,1 | 0,5 | 1,0 | 2,0 | 5,0
Нормальные Уродливые
1 89,0±1,2 90,0±3,2 76,5±4,6 50,2±1,6 0 0 0 3,0±0,5 9,2±0,3 19,5±1,1 39,2±1,6 25,1±2,1 12,2±0,9
2 91,3±3,1 92,9±2,9 75,2±3,5 51,6±2,7 0 0 0 2,9±0,6 10,1±1,1 20,8±2,1 41,2±2,3 26,0±2,0 11,8±0,8
3 88,5±2,5 90,6±3,5 77,4±3,6 48,1±2,4 0 0 0 4,0±0,9 8,0±0,8 19,0±1,4 38,9±3,4 24,0±1,9 13,3±1,0
Х 89,0±2,9 90,9±3,1 76,3±4,0 29,9±1,8 0 0 0 3,3±0,5 9,1±0,2 19,7±1,2 39,9±3,7 25,3±1,7 12,4±0,7
роз тканей. Следует отметить, что зародыши с такими нарушениями встречались и в концентрациях 0,050,1 мг/л и в контроле, но их количество было существенно меньше. Зародыши с описанными уродствами погибали вскоре после вылупления.
Выход зародышей из оболочек и в контроле, и в концентрации 0,05 мг/л начался после завершения 3-х сут и продолжался 19 ч. При более высоких концентрациях 3-МХ (0,1; 0,5 мг/л) вылупление проходило в два срока: часть зародышей вылупилась через 3 сут 19 ч (концентрация 0,1 мг/л), 2 сут 14 ч (концентрация 0,5 мг/л), т.е. на 10-15 ч раньше, чем в контроле. Все вылупившиеся в это время зародыши были уродливыми; их количество составило 9,0 % (концентрация 0,1 мг/л) и 19,5 (концентрация 0,5 мг/л). Вылупившиеся зародыши по морфологическим признакам не отличались от контрольных, вылупление этих зародышей проходило идентично контрольным. Зародыши, развивающиеся в концентрациях 1,0-5,0 мг/л, начали вылупляться через 2 сут 5 ч. Все вылупившиеся зародыши в этих концентрациях были уродливыми.
Наблюдения за развитием зародышей показывают, что действие 3 -МХ обнаруживается на различных стадиях их развития и выражено комплексом морфо-физиологических нарушений. С ростом концентраций значительно увеличивается гибель зародышей в оболочках (на первых стадиях развития), что особенно заметно при больших концентрациях, когда вылупле-ния нормальных зародышей практически не происходило. При этом наблюдали нарушения дробления, в том числе распад бластодиска на отдельные бласто-меры. С увеличением концентрации 3-МХ возрастает и количество вылупившихся уродливых зародышей. С ростом концентраций усугубляется и характер уродств - от некоторых изменений в сердечно-сосудистой системе при малых концентрациях до появления необратимых нарушений в строении тела при больших концентрациях. Как правило, зародыши, вылупившиеся даже с небольшими морфологическими отклонениями, в дальнейшем погибают.
В условиях высокой концентрации 3-МХ (1,05,0 мг/л) отмечено сильно растянутое во времени вы-лупление зародышей. Это происходило за счет преждевременного вылупления, отсутствия массового и запаздывания окончания вылупления. Вылупившиеся зародыши были большей частью уродливыми и нежизнеспособными. Возможно, что действие 3 -МХ отразилось на состоянии оболочек яиц. Следствием этого могли быть как активный лизис оболочек, так и сильное уплотнение их в результате коагуляции их белковых структур. Как известно, изменение только лишь физико-химических свойств многослойной оболочки яйца, являющейся границей между зародышем и средой, может серьезно отразиться на развитии зародыша. Однако одним этим обстоятельством нельзя объяснить патогенное действие 3-МХ.
Наши данные [9, 10] и анализ литературы [2- 4] показали, что в настоящее время происходит накопление ПАУ и ПХБ в органах промысловых видов рыб, что ведет к изменению поведения, роста и размножения. Попадая в организм, циклические углеводороды подвергаются трансформации системой неспецифических монооксигеназ (цитохром Р-450 гидроксилазная система).
Критерием, с помощью которого можно судить об этом процессе, мы выбрали изменение функциональной активности мембран в процессе эмбриогенеза, для чего изучали цитохром Р-450 - гидроксилазную систему -ключевого звена детоксикации ксенобиотиков в клетке.
Окисляя гидрофобные молекулы чужеродного происхождения, попавшие в клетку, оксигеназные системы превращают их в полярные, водорастворимые соединения, которые уже могут выводиться из организма экстреторными органами [1, 11, 12].
Исследование данной ферментативной системы показало, что монооксигеназная активность, динамика цитохрома Р-450 также оказалась подверженной влиянию 3 -МХ и совола.
В микросомах печени половозрелых карпов регистрируется очень низкий уровень содержания цитохрома Р-450. В норме он составлял около 0,07 нмоль/мг белка и существенно не зависел от пола рыбы. В результате инъекции 3-МХ на 7-е сут содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени увеличивалось до 0,12±0,01 нмоль/мг белка, а при введении совола - до 0,11±0,01 нмоль/мг белка микросом. При этом в обоих случаях скорость 0-деалкилирования 7-этоксикумарина возрастала с 0,007 нмоль/мг белка/мин до 0,049 (максимальное значение).
В икре карпа не удается с достаточной достоверностью измерить уровень содержания цитохрома Р-450. Как в контрольных образцах, так и в микросомах, полученных из икры рыб, которым вводились индукторы монооксигеназ, регистрируется активность 0-деалкилирования 7-этоксикумарина. Уровень этой активности очень низок, зависит от периода развития икры и от типа индуктора (табл. 3).
Таблица 3
Монооксигеназная активность в эмбриогенезе карпа под влиянием 3-МХ, нмоль/мг белка/мин (п=5)*
Стадия эмбриогенеза карпов 7-этоксикумарин 0-деэтилазная активность
Контроль Опыт
Икра 0,0022±0,00005 0,0032±0,00004
Дробление 0,0023±0,00004 0,0031±0,00004
Гаструляция 0,0033±0,00005 0,0063±0,00006
Начало органогенеза 0,0005±0,00001 0,0005±0,00001
Середина органогенеза 0,0005±0,00001 0,0012±0,00002
Конец органогенеза 0,0009±0,00002 0,0015±0,00003
Вылупление предличинок 0,0010±0,00003 0,0023±0,00005
Односуточные предличинки 0,0003±0,00001 0,0015±0,00003
* - достоверность различий между показателями контроля и опыта р<0,01.
При этом он всегда достоверно выше в икре подопытных карпов, чем в икре контрольных рыб. Таким образом, как ПАУ так и ПХБ при попадании в организм рыб способны индуцировать монооксигеназные активности в икре, развивающихся эмбрионах и, по-видимому, в тканях потомства.
Эта способность, очевидно, может рассматриваться как один из адаптивных биохимических механизмов, позволяющих повышать уровень метаболизма попадающих в организм ксенобиотиков и передавать эту способность потомству. Как 3-МХ, так и совол инду-
цируют в микросомной фракции печени рыб изоформу цитохрома Р-450, иммунологически близкую цитохро-му Р-450 у крыс. По-видимому, именно эта изоформа цитохрома Р-450 индуцируется и в мембранах эмбрионов рыб [2].
Ферменты этой группы осуществляют не только де-токсикацию, но и вызывают метаболическую активацию ПАУ, в результате чего они приобретают мутагенные и канцерогенные свойства [13]. Таким образом, попадание индукторов монооксигеназ в ткани половозрелых рыб может иметь далеко идущие последствия не только для этих особей, но и для их потомства.
Полученные результаты показывают, что введение совола и 3-МХ производителям и через них зародышам заметно увеличивает общее содержание цито-хрома Р-450 и монооксигеназную (7-этоксикумарина 0-деэтилаза) активность в микросомах печени карпа и зародышей, что считается одним из доказательств реакции на введение токсикантов.
Резюмируя данные о воздействии ПАУ и ПХБ на процессы созревания ооцитов, эмбриогенеза и состояние личинок карпа, следует подчеркнуть основные моменты.
Действие ксенобиотиков на созревание икры весьма существенно. Они оказывают влияние не только на активность ферментов детоксикации (монооксигеназ), качество половых продуктов, но и на прохождение отдельных стадий эмбриогенеза и выживаемость эмбрионов.
Данные биотесты могут быть использованы для ранней диагностики состояния рыб и для выяснения причинных связей между воздействием загрязнения и биологическими эффектами на уровне организма.
Литература
1. АрчаковА.И. Микросомальное окисление. М., 1975.
2. Котелевцев С.В., Степанова Л.И. Индукция с помощью ароматических углеводородов активности монооксигеназ в тканях рыб // Экспериментальная онкология, 1987. Т. 9. № 5. С.46-49.
3. Котелевцев С.В., Степанова Л.И. Биотестирование канцерогенных и мутагенных компонентов в водных экосистемах // Журн. Рос. хим. общества. 1994. № 1. С. 87-93.
4. Beim A. et al. The Biomonitoring of Cellulose Mill Waste Water in Lake Baikae: 7-th International Bioindicators Symposium and Workshop on Environmental Health. September 28-October, Kuopjo, Finland, 1992. P. 6, 60.
5. Jadow R., Kampffmeyer H., Kiese M. The Preparation of Microcosomes // Naunyn- Schmiedeberg's. Arch. Expt. Phar-makol., 1965. Vol. 251. P. 75-87.
6. Boobis A.R. et al. Biphasic O- deethylation and 7-ethoxy-coumarine by human and rat liver microsomal fractions // Bio-chem. Pharmacol. 1981. Vol. 30. № 17. P. 2451-2456.
7. Omura T., Sato K. The Carbon monoxide pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature // J. Biol. Chem. 1964. Vol. 239. № 7. P. 2370-2378.
8. Lowry D.H. et al. Protein measurement with the Folinphenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.
9. Исуев А.Р. Использование монооксигеназной системы животных организмов в биомониторинге окружающей среды // Вестн. ДГУ. 1998. Вып. 1. С. 27-34.
10. Исуев А.Р., Бутаев А.М. Токсикологическое состояние вод Дагестана // Вестн. ДНЦ РАН. 2004. № 16. С. 41-50.
11. Ляхович В.В., Цырлов И.Б. Структурные аспекты биохимии монооксигеназ. Новосибирск, 1978.
12. ПаркД.В. Биохимия чужеродных соединений. М., 1978.
13. Арчаков А.И. Оксигеназы биологических мембран // 37-е Баховские чтения. М., 1983.
Поступила в редакцию_10 декабря 2007 г.
