CC BY
115
Бензобарбитал и фторбензобарбитал — индукторы фенобарбиталового типа монооксигеназной системы печени
Новожеева Т.П.1, Смагина М.И.2, Черевко Н.А.2, Фатеева С.Н.2
Benzobarbital and fluorbenzobarbital — hepatic monooxygenase system phenobarbital-like inducers
Novozheyeva T.P., Smagina M.I., Cherevko N.A., Fateyeva S.N.
1 НИИ психического здоровья CO РАМН, г. Томск
2 Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
© Новожеева Т.П., Смагина М.И., Черевко Н.А. и др.
Бензобарбитал и фторбензобарбитал как индукторы монооксигеназной системы повышают в печени суммарное содержание цитохрома Р-450 и количество его изоферментов 2B6, 2С9, 2Е1, ускоряют окисление амидопирина, этоксирезоруфина, пентокси-резоруфина, анилина, андростендиона. Ферментиндуцирующая активность бензобарбитала и фторбензобарбитала в значительной степени обусловлена действием их основного метаболита — фенобарбитала. В отличие от фенобарбитала бензобарбитал и фторбензобарбитал индуцируют изофермент 3А4, ответственный за 16р-ОН-гидроксилирование андростендиона. В связи с этим нельзя исключить индуцирующую активность нативных молекул бензобарбитала и фторбензобарбитала по PCN-типу.
Ключевые слова: бензобарбитал, фторбензобарбитал, фенобарбитал, индукция, изоферменты цитохрома Р-450.
Benzobarbital and fluorbenzobarbital as monooxygenase system inductors increase the hepatic cytochrome P-450 level and the content of its isoenzymes 2B6, 2C9, 2E1, accelerate aminopyrine, 7-ethoxyresorufine, 7-pentoxyresorufine, aniline and androstendi-one oxidation. Activity of benzobarbital and fluorbenzobarbital as inductors is to a large degree due to the action of their major metabolite — phenobarbital. Benzobarbital and fluorbenzobarbital unlike phenobarbital induce isoenzyme 3A4, responsible for andro-stendione 16p-OH-hydroxylation. PCN-type induction activity posses also native molecules of benzobarbital and fluorbenzobarbital.
Key words: benzobarbital, fluorbenzobarbital, phenobarbital, induction, isozymes cytochrome P-450.
УДК 547.854.5:577.1:612.35
Введение индуцирующий эффект бензобарбитала и фторбензо-
барбитала проявляется как у интактных животных, Бензобарбитал (бензонал; 5-этил-5-фенил-№бензоил- так и при экспериментальной гипербилирубинемии, барбитуровая кислота) и фторбензобарбитал (галонал; моделях токсической патологии, ишемии и резекции 5-этил-5-фенил-1-о-фтор-^бензоилбарбитуровая кис- печени [6]. По силе и продолжительности действия лота) — оригинальные противосудорожные средства, бензобарбитал и фторбензобарбитал не уступают ре-изученные на кафедре фармакологии Томского меди- ферентному индуктору МОС фенобарбиталу [7, 9]. цинского института (ныне Сибирский государствен- Вместе с тем окончательно не установлен тип фер-ный медицинский университет, г. Томск) (СибГМУ) ментативной активации МОС, вызываемой новы-в 1960—1990-х гг. под руководством профессоров ми индукторами. Известно, что они аналогично Е.М. Думеновой и А.С. Саратикова [2]. Эти бен- фенобарбиталу связываются с цитохромом Р-450 зоильные производные барбитуровой кислоты оказы- по I типу [5].
вают также противоаритмическое и иммуномодули- Цель исследования — с помощью методов биохи-
рующее действие, являются индукторами зависимой мии и иммунохимии определить тип и возможные ме-от цитохрома Р-450 монооксигеназной системы (МОС) ханизмы индукции МОС печени крыс под влиянием детоксикации ксенобиотиков в печени [5, 6]. Фермент- бензобарбитала и фторбензобарбитала.
Материал и методы
Эксперименты проведены на 65 белых аутбредных крысах-самцах массой 140—160 г в соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств» [4]. Животных содержали в виварии Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск) при естественном световом режиме на стандартной диете со свободным доступом к воде и пище. Бензобарбитал и фторбензобарбитал в дозе 70 мг/ кг массы тела, фенобарбитал в дозе 50 мг/ кг массы тела вводили интактным крысам в желудок 1 раз в сутки в течение 3 сут в виде суспензии на 1%-й крахмальной слизи. В этих дозах изученные барбитураты в максимальной степени повышают содержание цитохро-ма Р-450 в печени [7, 9]. Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество крахмальной слизи.
Крыс декапитировали под эфирным наркозом через 48 ч после последнего введения препаратов. По ранее описанным методикам [8, 9] в микросомальной фракции печени определяли содержание белка, цито-хромов Р-450, Ь5, метаболитов андростендиона, активность НАДФ• Н-цитохром Р-450-редуктазы, скорость ¡-деметилирования амидопирина, и-гидроксилирования анилина, О-деалкилирования 7-этоксирезоруфина и 7-пентоксирезоруфина. Из микросом печени выделяли молекулярные изоферменты цитохрома Р-450, ин-
дуцированного фенобарбиталом (изоферменты 2В) и 3-метилхолантреном (изоферменты 1А).
Антитела против изоферментов цитохрома Р-450 получали иммунизацией препаратами цитохромов взрослых беспородных кроликов. Иммуноглобулины из иммунных сывороток, изолированные фракционированием сульфатом аммония, использовали для иммуно-химического анализа микросом. Проводили реакцию двойной иммунодиффузии. Содержание изоферментов цитохрома Р-450 2В1 и 2В6 определяли методом «ракетного» иммуноэлектрофореза. Белки микросомальной фракции разделяли с помощью электрофореза с доде-цилсульфатом натрия в полиакриламидном геле [8].
Статистическую обработку результатов проводили методом парных сравнений с использованием непараметрического критерия Вилкоксона—Манна—Уитни при вероятности ошибочного вывода, не превышающей 5% (р < 0,05) [11]. Данные в таблице представлены в виде М ± т, где М — среднее арифметическое значение, т — ошибка среднего.
Результаты и обсуждение
Бензобарбитал, фторбензобарбитал и фенобарбитал увеличивали количество микросомального белка, суммарное содержание изоферментов цитохрома Р-450 и активность НАДФ - Н-зависимой цитохром Р-450-редуктазы, не изменяя содержания цитохрома Ь5 (таблица).
Влияние бензобарбитала, фторбензобарбитала и фенобарбитала на систему монооксигеназ печени крыс (М ± т)
Показатель Интактные животные Бензобарбитал Фторбензобарбитал Фенобарбитал
Белок микросом, мг/орган 56,20 ± 2,5 73,70 ± 4,70* 78,20 ± 5,34* 75,60 ± 7,35*
Содержание цитохромов нмоль/мг белка:
Р-450 0,53 ± 0,07 1,35 ± 0,07* 1,32 ± 0,15* 1,21 ± 0,08*
2В 0,02 ± 0,002 0,60 ± 0,06* 0,65 ± 0,06* 0,56 ± 0,07*
Ь, 0,44 ± 0,01 0,55 ± 0,03 0,54 ± 0,04 0,48 ± 0,04
Цитохром Р-450-редуктаза, нмоль/мг белка • 1 мин 153,00 ± 13,00 342,00 ± 40,00* 350,00 ± 38,00* 321,00 ± 25,00*
Активность монооксигеназ, нмоль продукта
на 1 мг белка в 1 мин:
¡-деметилаза амидопирина 1,44 ± 0,15 5,29 ± 0,33* 5,36 ± 0,28* 4,78 ± 0,37*
и-гидроксилаза анилина 0,54 ± 0,01 1,11 ± 0,22* 1,12 ± 0,15* 1,12 ± 0,07*
О-деэтилаза 7-оксирезоруфина 0,07 ± 0,02 0,08 ± 0,02 0,06 ± 0,01 0,06 ± 0,02
О-деэтилаза 7-пентоксирезоруфина 0,07 ± 0,01 0,83 ± 0,05* 1,24 ± 0,09* 1,20 ± 0,02*
Андростендионгидроксилаза:
7а-ОН 0,17 ± 0,01 0,17 ± 0,06 0,14 ± 0,05 0,11 ± 0,01
16а-ОН 1,96 ± 0,13 2,69 ± 0,67 1,43 ± 0,42 0,87 ± 0,28*
6р-ОН 1,07 ± 0,03 1,96 ± 0,43* 2,22 ± 0,19* 1,36 ± 0,36
16р-ОН 0,82 ± 0,05 3,33 ± 0,71* 4,50 ± 0,90* 3,11 ± 0,32*
Примечание.
- р < 0.05 по сравнению с интактными животными. Приведены Бюллетень сибирской медицины, №
средние данные 10 определений. 5, 2011
Новожеева Т.П., Смагина М.И., Черевко Н.А. и др. Бензобарбитал и фторбензобарбитал — индукторы системы печени
Микросомы, выделенные из печени крыс, получавших индукторы, образовывали линию преципитации с антителами к изоферментам группы 2В и не взаимодействовали с антителами к изоферментам группы 1А. Следовательно, в микросомах, индуцированных бензо-барбиталом и фторбензобарбиталом, образуются формы цитохрома Р-450, иммунологически идентичные индуцируемым фенобарбиталом изоферментам 2В1, 2В2 и 2В6. В микросомах отсутствуют индуцируемые метил-холантреном изоферменты 1А1 и 1А2.
При определении содержания в печени цитохрома Р-450, иммунологически идентичного индуцируемым фенобарбиталом формам, учитывали, что изофермен-ту 2В6 иммунологически идентичен изофермент 2В2. Оба изофермента имеют близкую молекулярную массу, высокую степень гомологии в первичной структуре и различаются лишь субстратной специфичностью и каталитической активностью, поэтому идентифицировали суммарное количество цитохромов 2В2 и 2В6. В микросомах печени крыс, получавших бензобарбитал, фторбензобарбитал и фенобарбитал, абсолютное и относительное содержание изоферментов 2В оказалось сходным, при этом индуцированные фенобарбиталом формы составляли около 50% от суммарного содержания цитохрома Р-450, определенного по количеству комплекса с СО (см. таблицу). Молекулярная масса изоферментов 2В составляла 52 кДа, что указывает на фенобарбиталовый тип индукции [1, 10].
Все барбитураты существенно повышали активность ферментов окислительного метаболизма — ¡-деметилазы амидопирина (субстрат 1-го типа), ассоциированной с изоферментом 2С9, и и-гидроксилазы анилина (субстрат 2-го типа), ассоциированной с изоферментом 2Е1 (см. таблицу). Метаболизм указанных субстратов не является строго специфичным для этих изоферментов цитохрома и характеризует ускорение индуктором фенобарбиталового типа метаболизма широкого класса субстратов [3, 6, 12]. Для оценки субстратной специфичности индуцированных бензобарбиталом и фторбензобарбиталом изофермен-тов цитохрома Р-450 были использованы субстраты, метаболизм которых строго связан с определенными изоферментами. 7-Этоксирезоруфин метаболизиру-ется только О-деэтилазой этоксирезоруфина и является субстратом изофермента 1А2, индуцируемого 3-метилхолантреном [13, 14]. В данных экспериментах под влиянием всех трех барбитуратов каталитическая
активность изофермента 1А2 не изменялась, что подтверждает данные, полученные при иммунохимическом анализе. О-деалкилирование 7-пентоксирезоруфина — субстрата, специфичного для изофермента 2В6, ускорялось, что согласуется с данными «ракетного» имму-нофореза.
Метаболизм еще одного модельного субстрата монооксигеназ — андростендиона позволяет оценить активность сразу четырех изоферментов цитохрома Р-450 [1, 8, 15]. Бензобарбитал и фторбензобарбитал стимулировали катализируемое изоферментом 2В6 ги-дроксилирование андростендиона в положении 16Р-ОН и не влияли на гидроксилирование в положениях 7а-ОН и 16а-ОН. В отличие от фенобарбитала бензобарбитал и фторбензобарбитал стимулировали окисление андро-стендиона в позиции 6р-ОН при участии индуцированного изофермента 3А4 (тип индукции монооксигеназ РСМ) [7, 9, 12, 13]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что бензобарбитал и фторбензобарбитал по влиянию на МОС печени можно отнести к индукторам фенобарбиталового типа.
Таким образом, экспериментально доказано индуцирующее влияние бензоильных производных барбитуровой кислоты бензобарбитала и фторбензобарбитала на МОС печени по фенобарбиталовому типу. В тонком кишечнике они подвергаются щелочному гидролизу с образованием фенобарбитала и бензойной кислоты, в крови присутствуют только в виде основного метаболита — фенобарбитала [7, 9]. Логично предположить, что ферментиндуцирующая активность бензобарбитала и фторбензобарбитала обусловлена действием фенобарбитала. С этим предположением согласуются полученные данные о сходном влиянии всех препаратов на уровень цитохрома Р-450 и изоферментов 2В6, а также на скорость метаболизма модельных субстратов (см. таблицу). Нельзя исключить также индуцирующую активность нативных молекул бензобарбитала и фтор-бензобарбитала, связывающихся с цитохромом Р-450 по I типу, так как при индукции фенобарбиталом значительно возрастает их сродство к цитохрому. В этих экспериментах бензобарбитал и фторбензобарбитал добавляли к суспензии микросом непосредственно перед измерением оптической плотности, поэтому метаболизм исключался [8]. При парентеральном введении бензобарбитала и фторбензобарбитала в эквимолярных дозах развивалась более выраженная индукция МОС печени, чем при инъекции фенобарбитала [5].
Заключение
В экспериментах на крысах доказано индуцирующее влияние оригинальных барбитуратов бензобарбита-ла и фторбензобарбитала на МОС печени по фенобар-биталовому типу. Эти вещества повышали содержание в печени цитохрома Р-450 и его изофермента 2В6, ускоряли метаболизм модельных субстратов. Фермент-индуцирующая активность бензобарбитала и фторбен-зобарбитала обусловлена как действием их основного метаболита — фенобарбитала, так и нативных молекул.
Литература
1. Арчаков А.И., Лисица A.B., Петушкова H.A. и др. Цито-хромы Р-450, лекарственная болезнь и персонифицированная медицина // Клинич. медицина. 2008. Т. 86, № 2. С. 4—8.
2. Венгеровский А.И. Первая кафедра фармакологии Сибири // Эксперим. и клинич. фармакология. 2008. Т. 71, № 2. С. 60—64.
3. Кукес В., Сычев Д., Ших Е. Изучение биотрансформации лекарственных средств — путь к повышению эффективности и безопасности фармакотерапии // Врач. 2007. № 1. С. 68—75.
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств / под ред. Р.У. Хабриева М.: Медицина, 2005. 832 с.
5. Саратиков A.C., Новожеева Т.П. Антиконвульсанты и монооксигеназная система // Журн. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 1991. Т. 91, № 6. С. 104—108.
6. Саратиков A.C., Новожеева Т.П. Индукторы монооксиге-назной системы печени и перспективы их клинического
использования // Эксперим. и клинич. фармакология. 1993. Т. 56, № 3. С. 69-71.
7. Саратиков А.С., Новожеева Т.П., Ахмеджанов P.P. Гало-нал — индуктор монооксигеназной системы фенобарбита-лового типа // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2002. Т. 134, № 9. С. 308—310.
8. Саратиков А.С., Новожеева Т.П., Бакибаев А.А., Ахмеджанов P.P. Индукторы фенобарбиталового типа // Хим.-фарм. журн. 1995. Т. 29, № 3. С. 3—13.
9. Саратиков А.С., Новожеева Т.П., Гришанова А.Ю. и др. Бензонал — индуктор монооксигеназной системы фено-барбиталового типа // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1991. Т. 111, № 2. С. 163—165.
10. Филимонова А.А., Зиганшин А.У., Зиганшина А.Е. Особенности метаболизма разных лекарственных средств с участием изоферментов цитохрома Р-450 // Эксперим. и клинич. фармакология. 2007. Т. 70, № 3. С. 69—77.
11. Хафизьянова P.X., Бурыкин И.М., Алеева Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной фармакологии. Казань: Медицина, 2006. 374 с.
12. Danielson P. The cytochrome P450 superfamily: biochemistry, evolution and metabolism in humans // Curr. Drug Metab. 2002. V. 3, № 6. P. 561—597.
13. Nelson D. The cytochrome P450 // Human Genom. 2009. V. 4. № 1. P. 59—65.
14. Yoshinari K., Sueyoshi Т., Moore R, Negishi M. Nuclear receptor CAR as a regulatory factor induction of CYP2B1 gene by phenobarbital in rat livers // Mol. Pharmacol. 2001. V. 59, № 2. P. 278—284.
15. Zelko I., Negishi M. Phenobarbital-elicited activation of nuclear receptor CAR in induction of cytochrome P-450 genes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 277, № 1. P. 1—6.
Поступила в редакцию 30.04.2011 г. Утверждена к печати 01.06.2011 г.
Сведения об авторах
Т.П. Новожеева — д-р биол. наук, ст. науч. сотрудник лаборатории нейробиологии НИИ псхического здоровья СО РАМН (г. Томск). М.И. Смагина — канд. биол. наук, ст. преподаватель кафедры фармакологии СибГМУ (г. Томск). Н.А. Черевко — канд. мед. наук, доцент кафедры иммунологии и аллергологии СибГМУ (г. Томск).
С.Н. Фатеева — канд. мед. наук, доцент кафедры госпитальной терапии с курсом спортивной медицины и физической реабилитации СибГМУ (г. Томск).
Для корреспонденции
Новожеева Татьяна Петровна, e-mail: rgtom@mail.tomsknet.ru
