CC BY
28
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11. 2009. Вып. 2
УДК 616.33-002. + 571.27 + 575.224.22
О. Б. Огарков1-2, К. Ю. Костюнин1 4 М. Ю. Гутникова1, В. А. Цинзерлингi, 4
ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА -2518 A/G ГЕНА МОНОЦИТАРНОГО ХЕМОТАКСИЧЕСКОГО БЕЛКА 1 ТИПА (MCP-1)
НА МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГАСТРИТА
1Иркутский областной клинический консультативно-диагностический центр 2Иркутский государственный университет
'Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования 4Санкт-Петербургский государственный университет, Медицинский факультет
Цитокины — провоспалительные пептиды, стимулирующие миграцию иммуноком-петентных клеток в сторону повышенного градиента данного вещества. Различают четыре семейства цитокинов, классифицируемых по наличию остатков цистеина в активном центре, — CXC, CC, C и СХ3С, где X — любой другой аминокислотный остаток. Инфекционная патология в подавляющем большинстве случаев сопровождается резким изменением цитокинового профиля организма, по Th1 или Th2 пути, т. е. развитию преимущественно клеточного или гуморального иммунного ответа.
Helicobacter pylori — микроаэрофильная грамотрицательная бактерия, колонизирующая слизистую желудка [1]. H. pylori является инфекционным агентом, ответственным за развитие хронического гастрита, в том числе и протекающего без выраженных клинических симптомов [2]. Инфицирование H. pylori приводит к инфильтрации слизистой оболочки желудка (СОЖ) клетками воспаления, включая нейтрофилы, моноциты и лимфоциты [3]. Наряду с другими цитокинами, H. pylori стимулирует секрецию моноцитарного хемотаксического протеина 1-го типа (MCP-1) эпителиальными клетками желудка, относящегося к CC семейству цитокинов [4]. MCP-1 подобно IL-8 усиленно экспрессируется in vivo в СОЖ в ответ на инфекцию H. pylori [4-6].
В регуляторной области гена моноцитарного хемотаксического белка 1-го типа (синоним — ген CCL2) в позиции -2518 обнаружена функционально значимая однону-клеотидная A/G замена. Для гомозиготных носителей аллеля A характерна менее активная транскрипция гена MCP-1 и соответственно меньшая продукция кодируемого белка мононуклеарами периферической крови [7]. Проводился ряд исследований по влиянию -2518A/G MCP-1 полиморфизма на некоторые инфекционные заболевания. Обнаружено преобладание GG генотипа у HIV-инфицированных испанцев по сравнению со здоровыми [8]. Аналогично, исследование данного локуса у больных туберкулезом мексиканцев выявило достоверное увеличение встречаемости аллеля G по сравнению с этим показателем в контрольной группе [9]. Для воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта, связанных с H. руЬп, такого рода работ не проводилось.
Задачей настоящего исследования являлось сравнение морфологической картины хронического гастрита у пациентов, инфицированных H. pylori и являющихся носителями аллеля -2518A по сравнению с носителями аллеля -2518G гена MCP-1 (CCL2).
© О. Б. Огарков, К. Ю. Костюнин, М. Ю. Гутникова, В. А. Цинзерлинг, 2009
Материалы и методы исследования. Сбор материалов. В настоящей работе использовались гастробиоптаты, полученные в процессе рутинных клинико-эндоскопических исследований в Иркутском диагностическом центре. Информация о пациентах и проведенных клинических и лабораторных исследованиях была получена с помощью информационных систем МИС и ЛИС ДЦ (http://www.dc.baikal.ru/company/teh/mis/).
Гистологическое исследование. Фиксация биоптатов для гистологического исследования из антрального и фундального отделов СОЖ проводилась в забуференном нейтральном 10 %-ном растворе формалина с последующей заливкой в парафин. Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим. Результаты морфологических исследований биоптатов СОЖ оценивались по модифицированной Сиднейской классификации [10].
Молекулярно-биологические исследования. ДНК из биоптатов СОЖ выделялась набором «ДНК-сорб А» производства ЦНИИ эпидемиологии, Россия, по протоколу производителя. На одну ПЦР использовалось 50-100 мкг тотальной ДНК.
Полиморфизм промотора гена МСР-1 в позиции -2518 (номер SNP—ге1024611) исследовали методом ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и LNA-зондов [11], разработанных и синтезированных НПФ «Синтол», Россия. При дизайне праймеров и зондов был учтен опыт предшествующих исследователей [12]. ПЦР выполняли на амплификаторе iQ-Cycler (БиоРад, США) в 20 мкл реакционой смеси следующего состава: 1х ПЦР буфер (Интерлаб-сервис, Россия); 3 мМ MgSO4 (Интерлабсервис, Россия); смесь олигонуклеотидов, состоящая из 2-х фланкирующих праймеров и 2-х зондов в концентрациях, приведенных в табл. 1; 4^ЫТР (Интерлабсервис, Россия) в конечной концентрации 176 мкМ каждого нуклеотида; модифицированная TaqF полимеразы (Интерлабсервис, Россия) по 1 ед. на реакцию и ДНК образца. ПЦР инициировалась 15-минутным прогревом реакционной смеси при 95 оС (для активации TaqF полимеразы) с последующей амплификацией в течение 45 циклов, состоящей из этапов: плавление при 95 оС — 30 с; отжиг при 62 оС — 30 с; элонгация при 72 °С — 20 с.
Таблица 1
Структуры использованных праймеров и зондов
Название Структура Конечная концентрация в ПЦР, мкМ
-2518For 5'-GGG AGG GCA TCT TTT CTT GAC-3' 0,3
-2518Rev 5'-GGT GAA GGG TAT GAA TCA GAA AAG A-3 0,3
Probe A 5'-R6G-GACAG (C-LNA) T (A-LNA) T (LNA-C) A (C-LNA) TTTC-BHQ1- 3' 0,1
Probe G 5'-FAM-GACAG (C-LNA) T (G-LNA) T (LNA-C) A (C-LNA) TTTC-BHQ1- 3' 0,2
Генотипирование генов CagA, VacA и iceAl проводилось наборами для ПЦР «Хели-копол СА», «Хеликопол VA» и «Хеликопол IA» производства НПФ «Литех», Россия, согласно протоколам производителя. Результаты генотипирования H. pylori формализовались в бинарной системе, где за «1» принималась положительная ПЦР, за «0» принималось отсутствие положительной ПЦР на вышеупомянутые гены. К типу I H. pylori («Токсотип I», см. табл. 2), считающемуся наиболее вирулентным, относили образцы ДНК, давшие положительный сигнал на ген CagA и s1 аллельный вариант гена VacA, все остальные образцы были отнесены к не-I типу [13, 14].
Частоты генотипов и соответствие наблюдаемых частот ожидаемому равновесию по Харди-Вейнбергу определяли с помощью программы Arlequin 3.0 (http://cmpg. unibe.ch/software/arlequin3). Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0. Половозрастные различия между группами сравнивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Сравнение частот аллелей и генотипов между различными группами проводили с помощью критерия х2 Пирсона или х2 с коррекцией Йетса на непрерывность в случае присутствия абсолютных значений меньше 10 [15].
Результаты исследования. Был исследован 91 биоптат СОЖ от 31 мужчины и 60 женщин, преимущественно европеоидной расы, с морфологическим диагнозом «хронический гастрит». Во всех образцах наличие H. pylori подтверждено гистобакте-риоскопически и с помощью ПЦР. Средний возраст мужчин составил 44,6 ± 16,1 года, женщин — 43,4 ± 16,2 года; между выборками мужчин и женщин не наблюдалось значимых различий по возрасту и полу в соответствии с критерием Манна-Уитни (p > 0,05). Частоты генотипов в локусе -2518 A/G были следующими: AA — 41/91 (0,45), AG — 42/91 (0,46), GG — 8/91 (0,09). Полученное распределение генотипов значимо не отличается по вариабельности от того же локуса у европеоидов (пациентов с нефропатией и когорты здоровых в Германии [16]). При планировании данного исследования мы пришли к заключению о нецелесообразности подбора контрольной группы в силу убиквитарности хеликобак-терной инфекции и экстремально широкой распространенности гастрита.
В табл. 2 представлено попарное сравнение распределения аллелей A и G локуса -2518 гена MCP-1 с генами вирулентности H. pylori. В данной работе не приводится оценка влияния токсигенности штаммов H. pylori на морфологические проявления гастрита, поскольку для изучаемой популяции такое исследование проведено ранее (К. Ю. Костю-нин с соавт., 2008 г.).
Таблица 2
Сравнение полиморфизма гена MCP-1 по локусу -2518A/G c наличием генов вирулентности у H. pylori
Генотип H. pylori / аллели MCP-1 A аллель G аллель x2; P
Ice A1 «0» 48 (39 %) 26 (45 %) ns
Ice A1 «1» 76 (61 %) 32 (55 %)
Vac As1 «0» 25 (20 %) 9 (16 %) ns*
Vac As1 «1» 99 (80 %) 49 (84 %)
Cag A «0» 34 (27 %) 10 (17 %) Ns
Cag A «1» 90 (73 %) 48 (83 %)
Токсотип I «0» 22 (18 %) 8 (14 %) ns*
Токсотип I «1» 102 (82 %) 50 (86 %)
Примечание. * х2 с коррекцией по Йетсу, ns — недостоверные различия.
Проводилось сравнение полиморфизма гена MCP-1 по локусу -2518 A/G с наличием морфологических признаков воспалительных изменений СОЖ в соответствии с модифицированной Сиднейской классификацией [10], в частности, с выраженностью хронического воспаления, активностью воспаления, степенью атрофических изменений,
наличием, степенью и видом кишечной метаплазии эпителия, степенью обсемененности H. pylori, наличием и количеством лимфатических агрегатов, наличием гиперплазии покровно-ямочного эпителия. Проведенный скрининг позволил выявить только один морфологический признак, на который оказывает достоверное влияние присутствие того или другого изучаемого аллеля. Было обнаружено, что у носителей —2518G аллеля наблюдается достоверное увеличение случаев выраженной гиперплазии покровно-ямочного эпителия СОЖ (х2 = 6,56; р = 0,01).
В отличие от ранее проведенных исследований по гену человека DC-SIGN (К. Ю. Костюнин с соавт., 2008 г.), никакой зависимости в распределении генов токсигенно-сти H. pylori среди носителей того или иного аллеля гена MCP-1 обнаружено не было.
В табл. 3 приведено распределение морфологических признаков гастрита — активность воспаления СОЖ и выраженность воспаления СОЖ в оригинальных баллах модифицированной Сиднейской классификации у носителей аллелей -2518A/G. Обращает на себя внимание достоверное увеличение числа высокоактивных гастритов, оцененных в 3 балла (х2 = 6,76; р = 0,01), у носителей аллеля G (генотипы AG и GG) — 69 % по сравнению с 48 % у носителей аллеля A (генотип AA). В то же время выраженность инфильтрации мононуклеарными клетками у носителей -2518A и -2518G аллелей достоверно не различалась.
Таблица 3
Распределение морфологических признаков «активность воспаления СОЖ» и «выраженность воспаления СОЖ» по модифицированной Сиднейской классификации у носителей аллелей
-2518 A/G гена MCP-1
Активность, баллы A аллель G аллель Выраженность, баллы A аллель G аллель
0 8 (6 %) 2 (3 %) 0 0 (0 %) 0 (0 %)
1 18 (15 %) 4 (7 %) 1 7 (6 %) 1 (2 %)
2 38 (31 %) 12 (21 %) 2 80 (65 %) 38 (66 %)
3 60 (48 %) 40 (69 %) 3 37 (30 %) 19 (33 %)
Всего 124 (100 %) 58 (100 %) Всего 124 (100 %) 58 (100 %)
Результаты, приведенные в табл. 3, свидетельствуют о том, что для носителей аллеля G (генотипы AG и GG) гена МСР-1 характерно более частое проявление гастрита в виде высокоактивных форм (3 балла по модифицированной Сиднейской классификации).
Для более полной характеристики влияния исследуемых аллелей на воспалительные процессы в СОЖ результаты оценки выраженности и активности гастрита в баллах модифицированной Сиднейской классификации были объединены в морфотипы, где первая цифра соответствовала выраженности воспаления СОЖ, а вторая — активности. Таким образом, морфотип 10 соответствовал диагнозу «хронический легкий неактивный гастрит», 11 — «хронический легкий малоактивный гастрит», 20 — «хронический умеренно выраженный неактивный гастрит», 21 — «хронический умеренно выраженный малоактивный гастрит», 22 — «хронический умеренно выраженный умеренно активный гастрит», 23 — «хронический умеренно выраженный активный гастрит», 32 — «хронический выраженный умеренно активный гастрит», а 33 — «хронический выраженный активный гастрит» (рисунок).
10
11
20
2 1
22
23
32
33
Морфотипы
Распределение аллелей А и G исследуемого гена среди пациентов с различными морфотипами гастрита (выраженность + активность) В числовом выражении морфотипа первая цифра соответствует выраженности в баллах, вторая цифра — активности в баллах по модифицированной Сиднейской классификации. Объяснение в тексте
Рисунок иллюстрирует распределение исследуемых аллелей по вышеуказанным морфотипам. Среди морфотипов воспаления СОЖ, характеризующих активный гастрит (выраженность + активность, морфотипы 23 и 33) аллель G встречался в 40 из 58 случаев (частота 0,69), в то время как среди всех остальных случаев малоактивного или умеренно активного гастрита (морфотипы 10, 11, 20, 21, 22, 32) данный аллель встречался только в 18 случаях из 58 (частота 0,31). Другими словами, носителям аллеля G достоверно чаще (х2 = 16,7; р = 0,00) ставился диагноз активного гастрита в форме «умеренно выраженный активный гастрит» или «выраженный активный гастрит».
Обсуждение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что встречающаяся более редко функционально-значимая нуклеотидная замена —2518G в промоторе гена человека MCP-1 увеличивает вероятность развития активного гастрита и гиперплазии покровно-ямочного эпителия СОЖ. Другими словами, наличие AG или GG генотипов в —2518 позиции промотора MCP-1 гена человека может являться потенциальным фактором риска для развития более активных форм гастрита с возможной гиперплазией эпителия СОЖ, чем у носителей AA генотипа. Остается открытым вопрос, почему полиморфизм гена, кодирующего цитокин, который влияет непосредственно на моноциты, не связан непосредственно с таким морфологическим проявление гастрита, как «выраженность» (инфильтрация СОЖ мононуклеарами) и «наличие лимфоидных агрегатов»; вместо этого распределение аллелей исследуемого гена демонстрирует достоверную связь с морфологическим признаком «активность гастрита» (инфильтрация СОЖ нейтрофилами).
Аналогичные результаты (для этой же популяции больных гастритом) были получены нами при исследовании влияния полиморфизма гена одного из мажорных рецепторов дендритных клеток CD 209 (К. Ю. Костюнин с соавт., 2008 г.). По всей видимости, соотнесение генетического полиморфизма генов человека с используемыми нами критериями морфологической оценки, базирующимися на модифицированной Сиднейской классификации,
позволяет зафиксировать зависимость только наиболее динамичного морфологического показателя, которым является «активность гастрита» (инфильтрация СОЖ нейтрофилами). Поскольку для появления/исчезновения такого морфологического показателя, как «выраженность» гастрита, требуется гораздо большее время, данный признак не дает значимой корреляции с полиморфизмом генов иммунного ответа у человека.
Литература
1. Шкитин В. А., Шпирина А. И., Старовойтов Г. Н. Роль Helicobacter pylori в патологии человека // Клинич. микробиол. и антимикробн. химиотерапия. 2002. Т. 2. № 2. С. 128-145.
2. Аруин Л. И., Капулер Л. Л., Исаков В. А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. М., 1998. 496 с.
3. Dixon M. F. Histological responses to Helicobacter pylori infection: gastritis, atrophy and preneoplasia // Baillieres Clin. Gastroenterol. 1995. Vol. 9. N 3. P. 467-486.
4. Mori N., Ueda A., Geleziunas R. e. a. Induction of monocyte chemoattractant protein 1 by Helicobacter pylori involves NF-kappaB // Infect. Immun. 2001. Vol. 69. N 3. P. 1280-1286.
5. Shimoyama T., EverettS. M., DixonM. F. e. a. Chemokine mRNA expression in gastric mucosa is associated with Helicobacter pylori cagA positivity and severity of gastritis // J. Clin. Pathol. 1998. Vol. 51. P. 765-770.
6. Watanabe N., Shimada T., Ohtsuka e. a. Proinflammatory cytokines and Helicobacter pylori stimulate CC-chemokine expression in gastric epithelial cells // J. Physiol. Pharmacol. 1997. Vol. 48. P. 405-413.
7. Rovin B., Lu L., Saxena R. A novel polymorphism in the MCP-1 gene regulatory region that influences MCP-1 expression // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol. 259. P. 344-348.
8. Vilades C., BrochM., PlanaM. e. a. Effect of genetic variants of CCR2 and CCL2 on the natural history of HIV-1 infection: CCL2-2518GG is overrepresented in a cohort of Spanish HIV-1-infected subjects // J. Acquir. Immun. Defic. Syndr. 2007. Vol. 44. P. 132-138.
9. Flores-Villanueva P. O., Ruiz-Morales J. A., Song C. H. e. a. A functional promoter polymorphism in monocyte chemoattractant protein-1 is associated with increased susceptibility to pulmonary tuberculosis // J. Exp. Med. 2005. Vol. 202. P. 1649-1658.
10. DixonM., GentaR., Yardley J. e. a. Classification and grading of gastritis // Amer. J. Surg. Pathol. 1996. Vol. 20. P. 1161-1181.
11. Latorra D., Campbell K., Wolter A., Hurley J. Enhanced allele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3' locked nucleic acid (LNA) primers // Human Mutation. 2003. Vol. 22. P. 79-85.
12. Landi S., Gemignani F., Bottari F. e. a. Polymorphisms within inflammatory genes and colorectal cancer // J. Negat. Results Biomed. 2006. Vol. 24. P. 1-15.
13. Atherton J. C., Cao P., Peek R. M. e. a. Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 17771-17777.
14. Yamaoka Y., KitaM., Kodama T. e. a. Expression of cytokine mRNA in gastric mucosa with Helicobacter pylori infection // Scand. J. Gastroenterol. 1995. Vol. 30. P. 1153-1159.
15. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных: Применение пакета прикладных программ Statistica. М., 2003. 312 с.
16. Steinmetz O. M., Panzer U., Harendza S. e. a. No association of the -2518 MCP-1 A/G promoter polymorphism with incidence and clinical course of IgA nephropathy // Nephrol. Dial. Transplant. 2004. Vol. 19. P. 596-601.
Статья принята к печати 18 февраля 2009 г.
