CC BY
69
УДК 616.3-5.1
Е.С. Агеева, О.В. Штыгашева, А.С. Пуликов, Н.Н. Буторин
РОЛЬ IL-1 И IL-8 В ПАТОМОРФОЗЕ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА ПРИ HELICOBACTER PYLORI--АССОЦИИРОВАННОМ ГАСТРИТЕ
Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова (Абакан)
В работе проводилась оценка взаимосвязи полиморфизма генов (IL-1fi, IL-1Ra, IL-8) с морфологическими изменениями, слизистой оболочки желудка при H. pylori-ассоциированном гастрите. Обследовано 66 больных атрофическим, и неатрофическим, хроническим, гастритом, коренных жителей Республики Хакасия, (хакасы). При неатрофическом, хроническом, гастрите выраженность воспаления, уменьшалась на фоне снижения обсеменения. H. pylori слизистой оболочки желудка. Наиболее распространенными генотипами являлись: при. атрофическом, гастрите ТТ +3953 IL-ip, R2R2 IL-1Ra и. AA —251 IL-8; при неатрофическом гастрите СТ+3953 IL-lfi, R3R4 IL-1Ra и ТТ —251IL-8. Наличие генотипов R2R2 IL-iRa; AA —251 IL-8 и. аллеля. Т +3953 IL-lfi ассоциировано с признаками развития, атрофии и. детерминирует ее степень.
Ключевые слова: полиморфизм генов, атрофический гастрит, Helicobacter pylori
THE ROLE OF IL-1 AND IL-8 IN PATHOMORPHOSIS OF THE MUCOUS COAT OF STOMACH AT THE HELICOBACTER PYLOR/-ASSOCIATED GASTRITIS
E.S. Ageeva, O.V. Shtygasheva, A.S. Pulikov, N.N. Butorin
Khakas State University named after N.F. Katanov, Abakan
The article is devoted, to the evaluation of interaction of polymorphism, of the genes (IL-1p, IL-1Ra, IL-8) with morphological changes of the mucous coat of stomach at the H. pylori-associated gastritis. We examined. 66 natives of Khakas Republic with atrophic and non-atrophic chronic gastritis (CG). At the non-atrophic chronic gastritis intensity of inflammation, decreased, on the background, of decrease of semination, by H. Pylori of the mucous coat of stomach. The most widespread genotypes were: at the atrophic gastritis — ТТ +3953 IL-1p, R2R2 IL-1Ra and AA —251 IL-8; at the non-atrophic gastritis — СТ+3953IL-1P, R3R4 IL-1Ra and ТТ —251 IL-8. Presence of genotypes R2R2 IL-1Ra; AA —251 IL-8 and. allele Т +3953 IL-1fi is associated, with, the features of development of atrophy and determinates its degree Key words: polymorphism of genes, atrophic gastritis, Helicobacter pylori
Современные эпидемиологические и фундаментальные молекулярно-генетические исследования показали этиологическую роль Helicobacter pylori (H. pylori) и генетических факторов макроорганизма в развитии атрофического гастрита и рака желудка. Установлена связь между риском развития рака желудка и степенью выраженности, распространенностью и длительностью течения атрофического гастрита [3, 6].
В настоящее время большой интерес вызывает концепция, согласно которой исход НР-инфицирования определяется генетически-детерминированными особенностями макроорганизма. Иммунный ответ при персистенции H. pylori имеет специфические (в том числе и этнические) особенности, связанные с эволюционно-сформировавшимися механизмами длительного существования организма человека и инфекта в условиях взаимоадаптации. В указанном аспекте определенный интерес представляет изучение популяционных закономерностей функционирования иммунной системы у разных популяций (монголоидов и европеоидов), проживающих на одной территории.
Цель работы: оценить взаимосвязь полиморфизма генов интерлейкинов с морфологическими изменениями слизистой оболочки желудка у хакасов при H. pylori-ассоциированном гастрите.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследовано 66 больных хроническим гастритом, являющихся коренными жителями Республики Хакасия (хакасы), в возрасте от 18 до 65 лет. Группу контроля составили 123 практически здоровых донора-добровольца, сопоставимых по полу и возрасту, также коренных жителей Республики Хакасии. Специфические IgG к H. pylori «Хелико-IgG-антитела» в сыворотке крови выявляли методом иммуноферментного анализа (ИФА) на спектрофотометре Immunochem 2100 (Финляндия). H. pylori определяли в биоптатах слизистой антрального отдела желудка с помощью мазков-отпечатков и световой микроскопии после окрашивания по Романовскому — Гимзе.
Биопсийный материал готовили по общепринятой методике. Оценку морфологических изменений слизистой оболочки желудка проводили методом световой микроскопии после окраски гематоксилин-эозином с использованием окулярной линейки и точечной сетки Г.Г. Автандилова [1]. Воспаление оценивали по Сиднейской системе [2].
ДНК выделяли из венозной крови методом фенол-хлороформной экстракции. Исследование полиморфизма генов IL-1 р С + 3953Т, IL-1Ra VNTR, IL-8 Т —251А осуществляли методом рестрикционного анализа продуктов амплификации («Терцик»
ЗАО НПФ ДНК-технология, Москва) специфических участков генома.
Детекцию продуктов (рис. 1) проводили в 4% агарозном геле с содержанием 0,1% водного раствора бромистого этидия («Sigma», USA). В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («Си-бэнзим», г. Новосибирск).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
По результатам исследования все больные были разделены на 2 группы: больные хроническим гастритом (ХГ) с признаками атрофии — атрофический хронический гастрит и без атрофии — неатрофический хронический гастрит. Инфекция H. pylori была верифицирована у 100 % больных атрофическим хроническим гастритом и у 94,5 % неатрофическим хроническим гастритом. У пациентов с атрофическим хроническим гастритом преобладала слабая (до 20 микробных тел в поле зрения), а в группе с неатрофическим гастритом — высокая (более 50 микробных тел) степень обсемененности (рис. 2). Снижение обсемененности при атрофическом по сравнению с неатрофическим хроническим гастритом, вероятно, связано с нарушением оптимальных условий для колонизации H. pylori. В результате бактерии мигрируют в тело желудка, вызывая развитие пангастрита (атрофического гастрита).
Рис. 1. Распределение полиморфных вариантов -251 Т > А гена 1Ь-8 у хакасов пациентов с хроническим гастритом: 2, 4, 5 - генотипы ^-8 -251 АА (79 и 212 п.н.); 8, 9, 10 - генотипы 1Ь-8 -251 ТТ (291 п.н.); 1, 3, 6, 7, 11, 12, 13 - генотипы ^-8 -251 ТА (79, 212 и 291 п.н.).
Результаты измерений представлены в виде М ± m, где М — среднее арифметическое; m
— среднеквадратичное отклонение среднего; n — величина выборки. Для проверки статистической значимости различий показателей в сравниваемых группах использовали t-критерий Стьюдента. Значимость различий считали при р < 0,05. Сравнение частот аллелей проводили с помощью критерия х2 с поправкой Йейтса на непрерывность, анализ ассоциации полиморфизмов с хроническим гастритом и язвенной болезнью — с помощью критерия отношения шансов (OR — odd ratio). Для корреляционного анализа использовали критерии Спирмена.
Рис. 2. Отпечаток биоптата слизистой оболочки антрального отдела желудка больного неатрофическим хроническим гастритом (42 года). Световая микроскопия, окраска по Романовскому - Гимзе, ув. х 700.
Таблица 1
Показатели морфологических изменений большой кривизны слизистой оболочки желудка у хакасов
при персистенции H. pylori
Показатель Ед. изм. Норма Группа больных
Больные с неатрофическии хроническим гастритом (n = 34) Больные с атрофическим хроническим гастритом (n = 23)
Высота поверхностного эпителия (ВПЭ) мкм 31 ± 4,7 23,6 ± 1,4 21,3 ± 0,9
Высота железистого эпителия (ВЖЭ) мкм 11,8-13,2 18,1 ± 0,7 15,3 ± 1,1
Ширина ямки (ШЯ) мкм 53,6-57,7 22,3 ± 1,8 28,1 ± 1,3*
Глубина ямки (ГЯ) мкм 181 ± 17,3 122,6 ± 6,1 152,8 ± 7,5*
Относительное количество главных клеток (ОКГК) % 54,4 ± 1,2 35,8 ± 1,8 32,2 ± 1,9
Относительное количество обкладочных клеток (ОКОК) % 29,2 ± 0,6 39,3 ± 2,4 37,5 ± 2,2
Относительное количество добавочных клеток (ОКДК) % 13,7 ± 0,5 24,8 ± 1,7 32,1 ± 1,4
Плотность желез (ПЖ) мм2 298,9 ± 16,4 321,6 ± 9,1 227,4 ± 8,6*
Примечание: * - р < 0,05 - достоверность значимых различий при сравнении показателей в группе неатрофическим и атрофическим хроническим гастритом.
У больных с атрофическим хроническим гастритом было выявлено снижение высоты поверхностного эпителия желудка (ВПЭ) и высоты железистого эпителия (ВЖЭ) по сравнению с группой пациентов с неатрофическим хроническим гастритом (табл. 1). При измерении ширины и глубины желудочных ямок (ШЯ и ГЯ соответственно) обнаружено достоверное увеличение показателя в группе пациентов атрофическим хроническим гастритом (р < 0,05). Выявленное уменьшение доли железистого эпителия в группе атрофического хронического гастрита следует рассматривать как вероятность развития атрофических процессов (рис. 3).
Рис. 3. Гистологическая картина слизистой оболочки антрального отдела желудка больного хроническим гастритом (42 года). Световая микроскопия, окраска по Романовскому - Гимзе, ув. х 700.
При исследовании активности воспаления было выявлено, что в группе атрофического хронического гастрита характерна слабая инфильтрация (отсутствие признака), для неатрофического хронического гастрита — умеренная (первая стадия) выраженность воспаления.
Увеличение интенсивности воздействия медиаторов воспаления в очаге [11, 12] приводит к генерации активных кислородных метаболитов, повреждению тканей, возникновению однонитевых разрывов ДНК, активации программируемой гибели клеток, возрастанию уровня компенсаторной пролиферации эпители-оцитов слизистой оболочки желудка. Выраженность эффектов интерлейкинов напрямую зависит от уровня их экспрессии, особо важна роль полиморфных вариантов генов интерлейкинов [9, 10, 13, 14].
Анализ распространенности полиморфизма генов показал, что наиболее распространенным среди обследованных групп являлся низкопродуци-рующий генотип СС +3953 1Ь-1 р (табл. 2), доля которого в группах пациентов атрофическим хроническим гастритом и неатрофическим хроническим гастритом снижалась в сравнении с контролем. Одновременно с этим в группе с неатрофическим хроническим гастритом увеличивалась доля гетерозигот СТ, а в группе с атрофическим хроническим гастритом — доля гомозигот ТТ, характеризующегося высоким уровнем продукции (табл. 2).
Известно, что особенности кислотопродукции также могут быть связаны с характером экспрес-
сии IL-1P, одного из ингибиторов кислотной продукции. IL-1 р инициирует мощный воспалительный ответ, в результате которого вместо ограничения роста патогена происходит выраженное повреждение собственного эпителия, разрушение желез.
В результате корреляционного анализа у больных атрофическим хроническим гастритом была выявлена прямо пропорциональная зависимость между частотой встречаемости генотипа ТТ +3953 гена IL-1P и глубиной ямок (r = 0,72; р < 0,05) и обратно пропорциональная — с плотностью желез (r = —0,78; р < 0,05). Между уровнем генотипа СТ +3953 IL-1P и внутренним диаметром желез (r = —0,81; р < 0,05) и высотой железистого эпителия (r = —0,76; р < 0,05) была выявлена отрицательная зависимость.
Развитие атрофии слизистой оболочки желудка приводит к выраженной гипохлоргидрии, облегчая колонизацию H. pylori в желудке, тем самым потенцируя воспалительные изменения [3]. Таким образом, уровень IL-1 р существенным образом влияет на рН содержимого желудка, что приводит к миграции
H. pylori из антрального отдела в тело желудка.
При анализе распределения полиморфизма гена антагониста рецептора интерлейкина IL-1P установлен доминирующий генотип — R4R4 IL-Ша VNTR (табл. 2). Его частота резко увеличивалась у больных неатрофическим хроническим гастритом по сравнению с контролем. Вторым по частоте встречаемости был генотип R3R4, доля которого была наибольшей у пациентов с атрофическим хроническим гастритом. Высокопродуцирующий генотип R2/R2 IL-Ша был редким у хакасов (табл. 2). Полученные нами данные о распространении полиморфизмов генов у хакасов не противоречат данным, представленным в литературе — среди монголоидов генотип R2/R2 IL-Ша встречается не более чем в 6 % случаев [5].
Корреляционный анализ показал, что у пациентов атрофическим хроническим гастритом выявлена взаимосвязь между R2R2 гена IL-1Ra VNTR, доля которого увеличивалась в группе больных с атрофическим хроническим гастритом, и количественными показателями атрофии: обратно пропорциональная количеству добавочных клеток (r = —0,83; p < 0,05) и высоте железистого эпителия (r= -0,86; p < 0,05).
Провоспалительное действие IL-1P зависит от комбинации IL-1P / IL-Ша. Регулятором эффектов IL-1P является антагонист IL-Ша, который, связываясь с рецептором, подавляет потенциально повреждающий провоспалительный эффект IL-1 р. Высокая продукция IL-1Ra, характерная для R2/R2-генотипа, подавляет эффекты IL-1 р, но одновременно с этим по принципу отрицательной обратной связи увеличивается продукция IL-1 р, развивается хроническое персистирующее воспаление [15]. При этом продукция IL-1Ra тоже увеличивается. Наиболее распространенными комбинациями генотипов среди хакасов являются СС IL-1 р и R4/R4 IL-1Ra, ассоциированные с низким уровнем экспрессии соответствующих белковых
Таблица 2
Распределение частот генотипов С +3953 Т 1р, ^-1Яа VNTR, Т -251А ^-8 (в %) у коренного населения
Хакасии
Группа больных
Полиморфизм гена Контроль (П = 123) Больные неатрофическим хроническим гастритом (п = 34) Больные атрофическим хроническим гастритом (п = 23)
% п % п % п
Генотип
СС 73,2 90 57* 19 68,8 22
СТ 25,2 31 43* 15 21,8 7
С +3953 Т ІІ.-1Р ТТ 1,6 2 0 0 9,4* 3
Аллель
С 85,2 121 78,5 34 79,7 29
Т 14,2 33 21,5 15 20,3 10
Генотип
К2К2 3,3 4 0 0 3,1 1
К2К4 0 0 0 0 3,2 1
К3К3 6,5 8 2,9 1 9,4** 3
И-Шэ УЫТК К3К4 10,6 13 10,0 4 15,6 5
К4К4 79,6 98 85,3* 29 68,7 22
Аллель
К2 3,3 4 0 0 4,7 2
К3 11,8 21 8,8 5 17,2 8
К4 84,9 111 91,2 33 78,1 28
Генотип
ТТ 42,3 52 35,3 12 37,5 12
ТА 43,9 54 61,8* 21 40,7 13
Т -251А ІІ.-8 АА 13,8 17 2,9* 1 21,8*, ** 7
Аллель
Т 64,3 106 66,2 33 57,9 25
А 35,7 71 33,8 22 42,1 20
Примечание: * - р < 0,05 - достоверность значимых различий по сравнению с контролем; ** - р < 0,05 - достоверность значимых различий при сравнении показателей в группах неатрофическим и атрофическим хроническим гастритом.
молекул, а следовательно, с как можно более мягким провоспалительным эффектом.
В целом при сравнении наших результатов с данными литературы показано, что ассоциации полиморфных форм ^-Ша VNTR и 1Ь-1 р с хроническим гастритом С + 3953Т среди хакасов имеют распределение, характерное и для других этнических групп коренного населения, проживающего на территории Сибири [4].
^-8 является ключевым медиатором Т^-пути иммунного ответа. Точечная замена А промо-торного региона —251 гена 1Ь-8 ассоциирована с высоким уровнем продукции цитокина, выраженной воспалительной реакцией [8]. Вместе с тем роль аллельных вариантов гена 1Ь-8 в патогенезе
Н. ру7ол'-ассоциированных заболеваний не является однозначной [7, 9, 12, 13, 14].
Мы провели анализ встречаемости аллелей и генотипов —251 Т > А ^-8 (табл. 2). У хакасов с
неатрофическим хроническим гастритом и атрофическим хроническим гастритом самым частым генотипом являлся ТА —251 ^-8. При неатрофическом хроническом гастрите доля данного генотипа по сравнению с контролем увеличивалась в наибольшей степени. Доля генотипа ТТ —251 ^-8 у пациентов обеих групп в сравнении с контролем существенно снижалась. Проведенная нами оценка не выявила статистически значимых различий между сравниваемыми группами больных и контролем (табл. 2). В группе больных атрофическим хроническим гастритом увеличивалась доля АА
— 251 ^-8 по сравнению с контролем (р < 0,05). Корреляционный анализ показал наличие обратнопропорциональной зависимости между гомозиготным генотипом (полиморфной формой) АА гена 1Ь-8 полиморфизма Т-251А и наружным диаметром желез (г = —0,77; р < 0,05), относительным количеством главных клеток (г = —0,76; р < 0,05) и плотностью
желез (r = -0,82; р < 0,05). Таким образом, полученные нами результаты позволяют рассматривать увеличение доли генотипа АА -251 IL-8 у больных по сравнению с контролем в качестве риска развития атрофического хронического гастрита, наличие гетерозиготного генотипа ТА -251 IL-8 увеличивает риск развития H. pylori-ассоциированного неатрофического хронического гастрита.
ВЫВОДЫ
1. У хакасов с неатрофическим хроническим гастритом активность воспаления соответствует степени колонизации H. pylori слизистой оболочки желудка, выраженность воспаления уменьшается на фоне снижения обсеменения.
2. У хакасов наиболее распространенными генотипами являются: при атрофическом гастрите - ТТ IL-1 р С + 3953Т, R2R2 гена IL-1Ra VNTR и AA гена Т-251А IL-8; при неатрофическом гастрите - СТ IL-1Р С + 3953Т, R3R4 гена IL-1Ra VNTR и ТТ гена IL-8 полиморфизма Т-251А. Этот факт свидетельствует о разном вкладе полиморфизма генов в развитие клинических форм H. pylori-ассоциированной патологии.
3. У хакасов наличие высокопродуцирующих генотипов - R2R2 гена IL-1Ra VNTR; AA гена IL-8 полиморфизма Т-251А и аллеля - Т гена IL-1 р С + 3953Т - ассоциировано с признаками развития атрофии и детерминирует ее степень.
Работа поддержана грантом РФФИ (№ 09-0498011 р_сибирь_а).
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия: Руководство. - М. : Медицина, 1990. - 382 с.
2. Аруин Л.И., Исаков В.А. Оценка обсеменен-ности слизистой оболочки желудка Helicobacter Pylori и активности хронического гастрита // Арх. патологии. - 1995. - № 3. - С. 75-76.
3. Кононов А.В. Генетическая регуляция и фенотип воспаления при Helicobacter pylori-инфекции // Архив патологии. - 2009. - Т. 71, № 5. - С. 57-63.
4. Шабалдин А.В., Остапцева А.В., Ахматьянова В.Р. и др. Полиморфизм гена рецепторного антагониста интерлейкина-1 у пришлого и коренного населения Кемеровской области // Иммунология. - 2007. - № 2. - С. 72-74.
5. Chen A., Li C.N., Hsu P.I. et al. Risks of interleukin-1 genetic polymorphisms and Helicobacter
pylori infection in the development of gastric cancer // Aliment. Pharmacol. Ther. — 2004. — Vol. 20. — P. 203-211.
6. Correa P. Helicobacter Pylori as a pathogen and carcinogen // J. Physiol. Pharmacol. — 1997. — Vol. 48, Suppl. 4. — P. 19 — 24.
7. Gyulai Z., Klausz G., Tiszai A. et al. Genetic polymorphism of interleukin-8 (IL-8) is associated with Helicobacter pylori-induced duodenal ulcer // European Cytokine Network. — 2004. — Vol. 15 (4). — P. 353 — 358.
8. Himajima N., Katsuda N., Matsuo K. et al. High anti-Helicobacter pylori antibody seropositivity associated with the combination of IL-8-251TT and IL-10-819TT genotypes // Helicobacter. — 2003. — Vol. 8. — P. 105.
9. Kamali-Sarvestani E., Bazargani A., Masoudian M. et al. Association of H. pylori cagA and vacA genotypes and IL-8 polymorphism with clinical outcome of infection in Iranian patients with gastrointestinal diseases // World J. Gastroenterol. — 2006. — Vol. 12 (32). — P. 5205 — 5210.
10. Kountrek P.C., Kountrek S.J., Brzozowski T. Helicobacter pylori infection in gastric cancerogeneis // J. Physiol. Pharmacol. — 2009. — Vol. 60 (3). — P. 3 — 21.
11. Landi S., Moreno V., Gioia-Patricola L. et al. Association of common polymorphisms in inflammatory genes interleukin (IL)6, IL8, tumor necrosis factor-a, NF-kB1 and peroxisome proliferator-activated receptor y with colorectal cancer // Cancer Res. — 2003. — Vol. 63. — P. 3560 — 3566.
12. Lu W., Pan K., Zhang L. et al. Genetic polymorphisms of interleukin (IL)-1B, IL-1RN, IL-8, IL-10 and tumor necrosis factor (alpha) and risk of genetic cancer in a Chinese population // Carcinogenesis. — 2005. — Vol. 26. — P. 631 —636.
13. Ohyauchi M., Imatani A., Yonechi M. et al. The polymorphism interleukin 8 —251 A/T influences the susceptibility of Helicobacter pylori related gastric disease in the Japanese population // Gut. — 2005. — Vol. 54. — P. 330 — 335.
14. Taguchi A., Ohmia N., Shirai K. et al. Inter-keukin-8 promotor polymorphism increases the risk of atrophic gastritis and gastric // Cancer in Japan. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. — 2005. — Vol. 14. — P. 2487 — 2493.
15. Witkin S.S., Gerber S., Ledger W. Influence of interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism on disease // J. Clin. Infect. Dis. — 2002. — Vol. 34 (2). — P. 204 — 209.
Сведения об авторах
Агеева Елизавета Сергеевна - кандидат медицинских наук, заведующий кафедрой фундаментальной медицины и гигиены Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова (655004, Республика Хакасия, г. Абакан, ул. Пушкина, 178; тел.: 8 (3902) 34-27-20; факс: 8 (3902) 22-21-72; e-mail: [email protected])
Штыгашева Ольга Владимировна - доктор медицинских наук, ректор, заведующий кафедрой внутренних болезней Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова (655017, Республика Хакасия, г. Абакан, ул. Ленина, 90; тел.: 8 (3902) 24-30-18; факс: 8 (3902) 24-35-73; e-mail: [email protected])
Пуликов Анатолий Степанович - доктор медицинских наук, профессор кафедры морфологии, физиологии и патологии Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова (655004, Республика Хакасия, г. Абакан, ул. Пушкина, 178; тел.: 8 (3902) 34-27-20; факс: 8 (3902) 22-21-72)
Буторин Николай Николаевич - кандидат медицинских наук, старший преподаватель Медико-психолого-социального института Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова (655017, Республика Хакасия, г. Абакан, ул. Хакасская, 68; тел.: 8 (3902) 22-36-64; факс: 8 (3902) 22-21-72)
