CC BY
64
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 616.98:579.835.12
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ПРОГНОЗА ИНФИЦИРОВАНИЯ HELICOBACTER PYLORI
Елизавета Сергеевна АГЕЕВА1, Ольга Владимировна ШТЫГАШЕВА1,
Наталья Владимировна РЯЗАНЦЕВА2, Владимир Николаевич ХАРЬКОВ3,
Вадим Анатольевич СТЕПАНОВ3
1 Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова 665017, г. Абакан, пр. Ленина, 92
2 ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития РФ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2
3 НИИ медицинской генетики СО РАМН 634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, 10
Изучено распределение генотипов полиморфных локусов генов С +3953Т IL-ip, IL-1Ra VNTR, -174 G>C IL-6, -251 T>A IL-8 у коренных и пришлых жителей Республики Хакасия, больных язвенной болезнью и хроническим гастритом, ассоциированных с Helicobacter pylori. Установлена взаимосвязь между генотипом АА -251 IL-8 и риском развития язвенной болезни у хакасов. У европеоидов риск развития заболевания ассоциирован с генотипом СС +3953 IL-1P и R2R3 IL-1Ra.
Ключевые слова: полиморфизм генов, иммунный ответ, Helicobacter pylori, язвенная болезнь, хакасы.
На сегодняшний день имеется достаточно фактов, свидетельствующих о значении генетических факторов макроорганизма в определении особенностей иммунного ответа и, следовательно, восприимчивости/резистентности организма к заболеваниям. Определенный интерес представляют данные о роли полиморфных вариантов генов интерлейкинов в патогенезе гастродуоденальной патологии (злокачественные новообразования, хронические воспалительные заболевания, в том числе инфекционной природы). При этом особое значение придается популяционным особенностям.
В настоящее время накоплены данные о роли аллельных вариантов ряда генов в патогенезе заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori (НР). Так, показано, что аллельные варианты кластера генов IL-1 (IL-1P -511Т, IL-1Ra R2R2) связаны с высоким риском развития рака желудка у представителей корейской популяции, инфицированных НР. В японской
популяции не было выявлено достоверной связи между аллельным вариантом 1Ь-1р -511Т и риском развития НР-ассоциированного рака желудка [1, 2]. В то же время было установлено, что у японцев аллель А -251 1Ь-8 ассоциирован с прогрессией атрофических изменений в слизистой оболочке желудка у пациентов с НР и увеличивает риск развития язвенной болезни и рака желудка [3, 4]. В китайской популяции риск развития рака желудка связывают с наличием генотипа ТА -251 1Ь-8 [5]. 2. Оуи1а1 е! а1. показали существование зависимости между носительством генотипа ТТ -251 1Ь-8 и риском развития дуоденальной язвы [6]. Возможным объяснением этому является наличие популяционно-зависимых ассоциаций между аллелями генов и клиническими особенностями инфекционного процесса [2, 7].
При проведении эпидемиологического исследования распространенности язвенной болезни у коренных и пришлых жителей Рес-
Агеева Е.С. - к.м.н., зав. кафедрой фундаментальной медицины и гигиены, е-mail: Ageevaeliz@rambler.ru Штыгашева О.В. - д.м.н., проф., зав. кафедрой внутренних болезней, e-mail: olgashtygasheva@rambler.ru Рязанцева Н.В. - д.м.н., проф., зав. кафедрой фундаментальных основ медицины, e-mail: nv_ryazan@mail.ru Харьков В.Н. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории эволюционной генетики, e-mail: vladimir.kharkov@medgenetics.ru
Степанов В.А. - д.б.н., проф., руководитель лаборатории эволюционной генетики, e-mail: vadim.stepanov@medgenetics.ru
публики Хакасия выявлено, что при высокой инфицированности НР (95,4 % среди европеоидов и 95,2 % среди хакасов) заболеваемость язвенной болезнью в двух популяциях, проживающих на территории Хакасии, различалась (8,1 % у европеоидов и 4,5 % у хакасов) [8]. Установленная взаимосвязь между распространенностью НР и ассоциированностью бактерии с язвенной болезнью у коренных и пришлых индивидов свидетельствует о наличии популя-ционно-наследуемых особенностей, оказывающих, по всей видимости, влияние на характер взаимодействия микроорганизма и организма хозяина. В связи с этим интересным является ис следование молекулярно-генетических механизмов, реализация которых влияет на течение инфекционного процесса.
Целью работы послужило выявление им-муногенетических особенностей, детерминирующих исход инфицирования НР у коренных и пришлых жителей Хакасии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объект исследования - больные язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (21 европеоид и 25 хакасов), хроническим гастритом (59 европеоидов и 63 хакаса). Контрольную группу составили здоровые доноры (60 европеоидов и 63 хакаса). Все обследованные - коренные (хакасы или монголоиды) и пришлые жители Республики Хакасия (русские или европеоиды). В исследовании приняло участие сопоставимое количество мужчин и женщин, средний возраст европеоидов был 43,6 года, хакасов - 42,9 года.
Наличие у пациентов НР диагностировали с использованием четырех методов: морфологического, быстрого уреазного, серологического (определение уровня специфических к НР в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа) и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Для исследования аллельных полиморфизмов генов ДНК выделяли из венозной крови методом фенол-хлороформной экстракции. Амплификацию осуществляли методом ПЦР, используя структуру следующих праймеров: F: gttgtcatcagactttgacc и Я: ttcagttcatatggaccaga (С+3953Т 1Ь-1Р), F: ctcagcaacactcctat и Я: tcct-ggtctgcaggtaa (ТЬЛИл УОТЯ), F: tgacttcagctt-tactctttgt и Я: ctgattggaaaccttattaag (-174 О>С 1Ь-6), F: tgttctaacacctgccactctagta и Я: ttatgcaccct-catcttttcattat (-251 Т>А 1Ь-8) («Сибэнзим», Новосибирск). Наличие полиморфных вариантов аллелей формирует сайты для распознавания
соответствующей рестриктазой. К амплифика-там добавляли смесь для рестрикции, содержащую один из ферментов (при генотипировании С+3953Т 1Ь-1р - Taq I, -174 О>С 1Ь-6 - SfaNI, -251 Т>А 1Ь-8 - Mfe I) и BSA-буфер. Температурный режим и время соответствовали приложенной инструкции фирмы-производителя («Сибэнзим»). Продукты рестрикции анализировали с помощью электрофореза в 4 % агарозном геле. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду риС19, расщепленную рестриктазой МБр1 («Сибэнзим»).
В работе с пациентами опирались на этические принципы, отраженные в Конституции РФ и Хельсинкской декларации всемирной медицинской ассоциации (2000). У всех пациентов было получено информированное согласие, подтверждающее их добровольное участие в исследовании.
Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью критерия х2, расчет проводили в пакете статистических программ GENDIST, разработанным д.б.н. В.А. Степановым. Сравнение частот аллелей и генотипов проводили с помощью критерия х2 с поправкой Йетса на непрерывность, анализ ассоциации полиморфизмов с хроническим гастритом и язвенной болезнью - с помощью критерия отношения шансов (ОШ).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Фактором, замыкающим на себе ключевые звенья патогенеза НР-персистенции в слизистой оболочке желудка (воспаление, апоптоз, ги-похлоргидрия), является !Ь-1р. Выраженность эффектов интерлейкина зависит от уровня экспрессии как самого продукта, так и антагониста рецептора интерлейкина ^ЛИл. В результате проведенного нами исследования установлено, что среди хакасов наиболее распространен низ-копродуцирующий генотип СС +3953 !Ь-1р (см. таблицу). У больных язвенной болезнью количество гомозигот СС было выше, чем у пациентов с хроническим гастритом и в группе контроля (р < 0,05). Гетерозиготы СТ встречались чаще у пациентов с хроническим гастритом по сравнению с больными язвенной болезнью и здоровыми донорами (р < 0,05). Гомозиготы ТТ (для которых характерен низкий уровень продукции !Ь-1р) в нашем исследовании являлись редким генотипом (см. таблицу).
У европеоидов доминирующим генотипом также являлся СС +3953 !Ь-1р, доля которого была выше у больных хроническим гастритом
Таблица
Распределение частот генотипов (%) у европеоидов и хакасов, носителей Helicobacter pylori, больных хроническим гастритом и язвенной болезнью
Хакасы Европеоиды
Полиморфизм генов Здоровые Больные Здоровые Больные
доноры ХГ ЯБ доноры ХГ ЯБ
СС 73,2 63,5 84,0 2 45,6 3 58,9 1 70,6 1 3
С +3953Т
IL-1P СТ 25,2 36,5 16,0 2 33,3 24,8 17,6 1
ТТ 1,6 0,0 0,0 21,1 3 16,3 11,8
x2, р 0,22, > 0,05 4 0,24, > 0,05 4 2,91, > 0,05 4 2,39, > 0,05 4 2,39, > 0,05 4 7,84, < 0,05
R2R2 2,9 1,7 0,0 5,1 9,5 3 12,4
R2R3 0,0 0,0 0,0 2,9 12,2 1 18,1 1
IL-1Ra R2R4 0,0 1,7 0,0 19,1 14,3 3 21,7
VNTR R3R3 6,8 7,0 4,0 11,6 9,7 17,4 3
R3R4 10,7 14,0 20,01 27,4 3 21,8 11,5 12
R4R4 79,6 75,4 76,0 33,9 3 32,5 3 18,9 1,2,3
x2, р 37,88, > 0,05 4 0,77, > 0,05 4 34,49, < 0,05 2,81, > 0,05 4 2,70, > 0,05 4 6,26, > 0,05 4
GG 70,0 75,0 73,9 38,8 3 36,2 3 28,9 3
-174 G>C
IL-6 GC 27,1 25,0 21,7 49,6 3 47,1 3 52,7 3
CC 2,9 0,0 4,4 11,6 3 16,7 18,4 3
x2, р 0,05, > 0,05 4 0,25, > 0,05 4 1,12, > 0,05 4 0,29, > 0,05 4 0,002, > 0,05 4 0,02, > 0,05 4
ТТ 42,8 45,4 44,8 36,1 34,4 26,1 3
-251 Т>А
IL-8 ТА 44,4 43,7 24,1 1,2 45,8 46,8 56,6 3
АА 12,8 10,9 31,0 1,2 18,1 18,8 17,3 3
x2, р 0,07, > 0,05 4 9,06, < 0,05 0,00, > 0,05 4 0,02, > 0,05 4 0,89, > 0,05 4 2,84, > 0,05 4
Примечание. Достоверное (р < 0,05) отличие от величины соответствующего показателя: 1 - здоровых доноров, 2 - пациентов с хроническим гастритом, 3 - хакасов; 4 - распределение частот генотипов, соответствующее закону Хар-ди-Вайнберга. ХГ - хронический гастрит, ЯБ - язвенная болезнь.
и язвенной болезнью по сравнению с контролем (см. таблицу). Анализ показал, что у европеоидов риск развития язвенной болезни ассоциирован с генотипом СС +3953 1Ь-1р (ОШ = 2,9, 95 % доверительный интервал ДИ 1,6-5,6). В отношении гетерозигот СТ +3953 1Ь-1р и гомозигот ТТ +3953 1Ь-1р у европеоидов отмечалось снижение показателей по сравнению с контролем (см. таблицу). У пациентов с язвенной болезнью генотипы СТ и ТТ +3953 1Ь-1р встречались реже, чем у пациентов с хроническим гастритом и в группе контроля (р < 0,05).
При межпопуляционном сравнении распространенности генотипов у здоровых коренных и пришлых жителей обнаружено, что гомозиготы СС +3953 1Ь-1р чаще встречаются у хакасов, чем у европеоидов, в то время как гомозиготы ТТ +3953 1Ь-1р - напротив, существенно реже.
При изучении полиморфизма гена 1Ь-1Яа установлено, что во всех обследованных группах доминирует генотип Я4Я4 1Ь-1Яа, при этом у хакасов его встречаемость в несколько раз выше, чем у европеоидов. Вторым по частоте
являлся генотип Я3Я4 1Ь-1Яа, доля которого была наибольшей у хакасов, больных язвенной болезнью (р < 0,05). Редкими генотипами у хакасов были гомозиготы Я3Я3 и Я2Я2, а также гетерозиготы Я2Я4 1Ь-1И.а (см. таблицу). У европеоидов, страдающих язвенной болезнью и хроническим гастритом, встречаемость Я2Я2 и Я2Я3 1Ь-1Яа была выше, чем в контроле и в аналогичных группах хакасов (см. таблицу). Следует отметить, что у европеоидов выявлена ассоциативная взаимосвязь между генотипом Я2Я3 1Ь-1Яа и риском развития язвенной болезни (ОШ = 7,1, 95% ДИ 1,9-31,4).
1Ь-6, ключевой медиатор ТИ2-пути, относится к цитокинам «первого уровня», которые секретируются в ответ на антигенную стимуляцию НР. 1Ь-6 способствует переключению синтеза ^М на ^О, являясь фактором диффе-ренцировки В-клеток. Распределение генотипов -174 О>С 1Ь-6 среди хакасов показало, что наиболее частыми были гомозиготы ОО -174 О>С (см. таблицу). Доля гетерозигот ОС 174 О>С 1Ь-6 у больных была ниже, чем в контро-
ле, но различия не являлись достоверными. Генотип СС у хакасов встречался наиболее редко; при хроническом гастрите в пределах нашего исследования он выявлен не был.
При сравнении частоты распределения полиморфных вариантов -174 О>С 1Ь-6 среди европеоидов - пациентов с хроническим гастритом и язвенной болезнью - достоверных различий по сравнению с контролем выявлено не было. При этом распределение между генотипами у коренных и пришлых жителей имело существенные различия (см. таблицу).
Известно, что для дифференцировки и рекрутирования клеток-эффекторов в очаг НР-ас-социированного воспаления необходим 1Ь-8 [9]. При оценке распределения полиморфизма Т - 251 А гена 1Ь-8 во всех обследованных группах пациентов также обнаружены различия встречаемости генотипов (см. таблицу).
Среди хакасов самым частым как в группе больных, так и в группе здоровых людей являлся ТТ -251 1Ь-8. Доля ТА -251 1Ь-8 оказалась существенно сниженной у больных язвенной болезнью, относящихся к хакасской популяции. Частота встречаемости генотипа АА -251 1Ь-8 была выше у больных язвенной болезнью, чем у пациентов с хроническим гастритом и в контрольной группе (р < 0,05). Между генотипом АА -251 1Ь-8 и риском развития язвенной болезни была выявлена взаимосвязь (ОШ = 3,1, 95 % ДИ 1,4-6,6). Необходимо отметить, что уровень интерлейкинов зависит не только от полиморфизма генов, но и от генотипа микроорганизма. В частности, известно, что наиболее высокое содержание 1Ь-8 определяется при инфицировании CagA-штаммами НР [10, 11]. В этой связи интересным, на наш взгляд, является обнаруженная взаимосвязь между CagA-генотипом НР и ассоциацией высокоэкспрессирую-щего генотипа АА -251 1Ь-8 с риском развития язвенной болезни у хакасов [8].
В группе европеоидов - пациентов с хроническим гастритом - не было выявлено статистически значимых различий в распределении гомозиготных и гетерозиготных генотипов по сравнению с контролем (см. таблицу). В то же время у пациентов с язвенной болезнью доля гетерозигот ТА -251 1Ь-8 была выше, а ТТ -251 1Ь-8 - ниже, чем в контрольной группе. Частота генотипа АА -251 1Ь-8 у больных язвенной болезнью - пришлых жителей - не имела достоверных различий с контролем (см. таблицу).
Интересно отметить, что при язвенной болезни у пациентов европеоидной популяции генотип ТТ -251 1Ь-8 встречался сравнительно реже, чем у хакасов (см. таблицу), в то время
как генотип ТА -251 IL-8 - напротив, достоверно чаще (р < 0,05). В отношении генотипа АА -251 IL-8 происходила инверсия признака: у хакасов чаще определялся генотип АА -251 IL-8 по сравнению с контролем, у европеоидов - реже.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное исследование позволило выявить, что у хакасов, инфицированных НР, гомозиготный генотип АА полиморфного локуса гена IL-8 в позиции -251 ассоциирован с риском развития язвенной болезни (OR = 3,1, 95 % ДИ 1,4-6,6). Среди хакасов наиболее распространены варианты СС +3953 IL-1P и R4R4 IL-1Ra, которые не характеризуются высоким уровнем экспрессии соответствующих интерлейкинов. Вероятно, именно эта особенность обеспечивает мягкий провоспалительный эффект у хакасов - носителей НР, отличающихся меньшим риском развития язвенной болезни. Следовательно, комбинация генотипов СС +3954 IL-1P и R4R4 IL-1Ra у хакасов может определять более высокий уровень защиты от НР-ассоциирован-ной патологии, чем у европеоидов. У европеоидов риск развития язвенной болезни ассоциирован с генотипом СС +3953 IL-1P (ОШ = 2,9, 95 % ДИ 1,6-5,6) и R2R3 IL-1Ra (OR = 7,1, 95 % CI 1,9-31,4).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hollegaard M. V., Bidwell J.L. Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line databases, suppl. 3 // Genes Immun. 2006. 7. (4). 269-276.
2. Matsukura N., Yamada S., Kato S. et al. Genetic differences in interleukin-1p polymorphisms among four Asian populations: an analysis of the Asian paradox between H. pylori infection and gastric cancer incidence // J. Exp. Clin. Cancer Res. 2003. 22. 47-55.
3. Ohyauchi M., Imatani A., Yonechi M. et al. The polymorphism interleukin 8 -251 A/T influences the susceptibility of Helicobacter pylori related gastric disease in the Japanese population // Gut. 2005. 54. 330-335.
4. Taguchi A., Ohmia N., Shirai K. et al. Inter-keukin-8 promoter polymorphism increases the risk of atrophic gastritis and gastric cancer in Japan // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2005. 14. 24872493.
5. Lu W., Pan K., Zhang L. et al. Genetic polymorphisms of interleukin (IL)-1B, IL-1RN, IL-8, IL-10 and tumor necrosis factor a and risk of genetic cancer in a Chinese population // Carcinogenesis. 2005. 26. 631-636.
6. Gyulai Z., Klausz G., Tiszai A. et al. Genetic polymorphism of interleukin-8 (IL-8) is associated with Helicobacter pylori-induced duodenal ulcer // Eur. Cytokine Netw. 2004. 15. (4). 353-358.
7. Chang Y.W., Jang Y., Kim N.H. et al. Interleukin-1B (IL-1B) polymorphisms and gastric mucosal levels of IL-1P cytokine in Korean patients with gastric cancer // Int. J. Cancer. 2005. 114. 465-471.
8. Штыгашева О.В., Цуканов В.В. Ассоциация саgA и vacA штаммов Helicobacter pylori и язвенной болезни в организованной популяции г. Абакана // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепа-тологии и колопроктологии. 2004. (2). 84-87.
Shtygasheva O.V., Tsukanov V.V. Association between саgA and vacA strains of Helicobacter pylori and ulcer disease in Abakan organized population //
Ros. zhurn. gastroenterologii, gepatologii i koloprok-tologii. 2004. (2). 84-87.
9. Кононов А.В. Воспаление как основа Helicobacter pylori-ассоциированных болезней // Архив патологии. 2006. 68. (5). 3-10.
Kononov A.V Inflammation as the basis of Helicobacter pylori associated diseases // Arkhiv patolo-gii. 2006. 68. (5). 3-10.
10. PeekR.M., Moss F., Tham K.T. et al. Helicobacter pylori cagA+ strains and dissociation of gastric epithelial cell proliferation from apoptosis // J. Natl. Cancer Inst. 1997. 89. (12). 863-868.
11. Rieder G., Einsiedl W., Hatz R.A. et al. Comparison of CXC chemokines ENA-78 and interleukin-8 expression in Helicobacter pylori-associated gastritis // Infect. Immunity. 2001. 69. 81-88.
GENETIC DETERMINANTS OF PROGNOSIS FOR HELICOBACTER PYLORI INFECTION
Elizaveta Sergeevna AGEEVA1, Olga Vladimirovna SHTYGASHEVA1,
Nathalia Vladimirovna RAYAZANTSEVA2, Vladimir Nikolaevich KHAR'KOV3,
Vadim Anatolyevich STEPANOV3
1 Khakas State University named after N.F. Katanov 665017, Abakan, Lenin av., 92
2 Siberian State Medical University 634050, Tomsk, Moskovsky tract, 2
3 Institute of Medical Genetics SB RAMS
634050, Tomsk, Embankment of the river Ushaika, 10
Distribution of genotypes of C +3953T IL-1p, IL-1Ra VNTR, -174 G>C IL-6, -251 T>A IL-8 has been studied in patients with ulcer disease and chronic gastritis associated with Helicobacter pylori at Mongoloids and Caucasians of Khakassia. The correlation between homozygous variant AA of the IL-8 gene in position -251 and risk of ulcer disease development in Khakas population has been established. The risk of the disease development was associated with CC +3953 IL-1p and R2R3 IL-1Ra at Caucasians.
Key words: gene polymorphisms, immune response, Helicobacter pylori, ulcer disease, Khakas.
Ageeva E.S. — candidate of medical sciences, head of the chair for fundamental medicine and hygiene, e-mail: Ageevaeliz@rambler.ru
Shtygasheva O.V. — doctor of medical sciences, professor, head of the chair for internal medicine, e-mail: olgashtygasheva@rambler.ru
Rayazantseva N.V. — doctor of medical sciences, professor, head of the chair for fundamental basis of medicine, e-mail: nv_ryazan@mail.ru
Kharkov V.N. — candidate of biological sciences, senior researcher of laboratory of evolutionary genetics, of e-mail: vladimir.kharkov@medgenetics.ru
Stepanov V.A. — doctor of biological sciences, professor, head of laboratory of evolutionary genetics, e-mail: vadim.stepanov@medgenetics.ru
