Полиморфизм генов ИЛ-1Ра и ФНО-альфа у пациентов с Helicobacter pylori-ассоциированным гастритом и язвой двенадцатиперстной кишки Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 уДК 579.835.12:579.252].083.3

О. О. Янович, Е. С. Носова, Л. П. Титов

полиморфизм ГЕНОВ ИЛ-1РА И ФНО-АЛьФА у пациентов С HELICOBACTER PFLORI-АССОЦИИРОВАННЫМ ГАСТРИТОМ И ЯЗВОЙ ДВЕНАДЦАТИИЕРСТНОЙ

кишки

Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии, Минск, Беларусь

Целью данного исследования было установление частоты основных типов полиморфизма генов антогониста рецептора ИЛ-1 (ИЛ-1РА) и ФНО-альфа у пациентов с Helicobacter pylori-ассоциированным гастритом и язвой двенадцатиперстной кишки и выявление их связи с характером клинического течения заболевания. Для исследования были отобраны 126 человек с различной гастродуоденальной патологией и наличием H. pylori в биопсийном материале. Полученные нами данные указывают на возможную связь риска развития язвы двенадцатиперстной кишки у носителей аллеля А гена ФНО-альфа в позиции -308. Анализ полиморфизма гена ИЛ-1РА показал статистически значимую разницу в наличии генотипа 2/L между изученными группами больных. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что для характеристики связи бактерия-хозяин желательно проведение параллельного типирования генов вирулентности H. pylori и определение полиморфизма генов цитокинов в образце биопсийного материала, взятого у пациента. Ключевые слова: Helicobacter pylori, полиморфизм генов

Helicobacter pylori (Н. pylori) представляется одним из широко распространенных микроорганизмов обладающих значительным потенциалом в инициации и развитии патологических процессов у человека. К хели-кобактерассоциированным болезням относятся хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки [5]. Высокая способность бактерии к колонизации слизистой оболочки желудка обусловлена "генетическим динамизмом" вследствие способности осуществлять рекомбинантные процессы с высокой частотой и производить продукты рекомбинантных генов обеспечивающих тропность к эпителию слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта и высокую адаптивность к факторам окружающей среды [12]. Прогрес-сирование и исход локальных иммуновоспалительных процессов при этих заболеваниях представляет собой результат комплексного взаимодействия между молекулами, продуцируемыми микроорганизмом, поверхностными структурами энтероцитов слизистой оболочки

Ген ИЛ-1РА -

Интрон 2 (86 п.о.)

желудочно-кишечного тракта хозяина, клетками и молекулами иммунной системы [1].

Имеются данные о роли точечных мутаций, сопровождающихся несинонимичными заменами ну-клеотидов в определенных позициях генов провоспа-лительных цитокинов хозяина, в предрасположенности и патогенезе вызываемых Н. pylori заболеваний. Высказываются также предположения, что низкая экспрессия гена цитокина или его рецептора сопровождается частичной недостаточностью их функции, что в свою очередь может оказать определенное влияние на фенотип заболевания.

Из множества полиморфных генов цитокинов в развитии воспаления важное значение имеют антагонист рецептора ИЛ-1 (ИЛ-1РА) и фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа).

ИЛ-1РА является противовоспалительным цитоки-ном, который связываясь с рецептором ИЛ-1, препятствует активации внутриклеточного сигнального каскада этого цитокина [9]. Ген, кодирующий ИЛ-1РА, расположен на хромосоме 2 и имеет полиморфный участок в интроне 2, включающем различное число тандемных повторов размером 86 п. о. [20]. Описаны 5 аллелей, аллель 2 из них ассоциируется с различными воспалительными заболеваниями [17, 18] (рис. 1).

Ген ФНО-альфа картирован на хромосоме 6p21.3 в регионе главного комплекса гистосовместимости. В 1992 г. A. G. Wilson и соавт. [21] идентифицировали транзицию G-A в положении -308 промотора этого гена (рис. 2). При этом было установлено, что аллель -308A ассоциирован с более высокой интенсивностью продукции цитокина. В дальнейшем было установлено, что наличие полиморфизма в позиции -308 (аллель А) реализуется на уровне транскрипционного фактора (AP-2), с усилением процесса транскрипции [2, 14].

По литературным данным, определенные аллели генов провоспалительных белков (интерлейкинов, ин-терферонов) существенно повышают риск развития агрессивного течения хронического гастрита (атро-

Ген ФНО-а

аллель А - 4 повтора-73,6% аллель В - 2 повтора-22,1% аллель D - 5 повторов-4,1% аллель Е - 3 повтора-0,2% аллель С - 6 повторов-0%

Промотор

V

-308 G - 82% А - 18%

Рис. 1. Схематическая локализация тандемных повторов в гене ИЛ-1РА и относительная частота встречаемости аллелей среди населения Восточной Европы [7].

Рис. 2. Схематическое изображение полиморфизма гена ФНО-альфа в позиции -308 и относительная частота встречаемости каждого аллеля среди населения Восточной Европы [11].

фический гастрит, язва двенадцатиперстной кишки, рак желудка) [9], однако в Беларуси ранее подобные исследования не проводились.

Целью данного исследования было установление частоты основных типов полиморфизма генов ИЛ-1РА и ФНО-альфа у пациентов с H. pylori-ассоциированным гастритом и язвой двенадцатиперстной кишки и выявление их ассоциации с характером клинического течения заболевания.

Материалы и методы

Для проведения исследования были отобраны 126 человек с различной гастродуоденальной патологией и наличием H. pylori в биопсийном материале (89 с диагнозом хронического гастрита и 37 с диагнозом язвы двенадцатиперстной кишки), из них 70 женщина и 56 мужчин, средний возраст 44,5 ± 1,5 года.

Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из биоптатов антрального отдела слизистой оболочки желудка, полученных во время гастродуоденофиброскопии. Материал для исследования был представлен эндоскопическими отделениями консультационно-диагностических центров Минска. Наличие H. pylori в биопсийном материале определяли методом ПЦР. Выделение ДНК из биопсийного материала проводили с помощью набора ДНК-сорбВ ("Амплисенс", Россия).

Определение вариантов ИЛ-1РА

Полиморфизм гена ИЛ-1РА представляет собой наличие в гене вариабельного числа тандемных повторов размером 86 п. о., классифицированных согласно E. El-Omar и соавт. [9] следующим образом: аллель А - 4 повтора (410 п. о.), аллель B - 2 повтора (240 п. о.), аллель D - 5 повторов (500 п. о.), аллель E - 3 повтора (325 п. о.) и аллель C - 6 повторов (595 п. о.). Для статистической оценки полученных данных аллели более чем с 2 повторами объединяют в группы: L - длинный генотип, 2 - короткий генотип (аллель 2 выделяют в отдельную группу).

Последовательности праймеров для определения числа повторов в гене ИЛ-1РА, использованные в работе: прямой - 5'

- CTCAGCAACACTCCTAT - 3', обратный - 5' - TCCTGGTCT-GCAGGTAA - 3'. Амплификацию проводили в автоматическом режиме по заданной программе: 94°С - 5 мин, 94°C - 30 с, 57°C

- 30 с и 72°C - 30 с (28 циклов), элонгация 72°C - 5 мин.

Анализ продуктов амплификации осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мг/мл) и детекцией в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (312 нм).

70 п 605040 3020100

АА Ав вв

Хронический гастрит Язва двенадцатиперстной кишки

Рис. 3. Генотипы ФНО-альфа в позиции -308 (АА, AG, GG) в группах больных хроническим гастритом и язвой двенадцатиперстной кишки. * - достоверно при сравнении с группой больных с хроническим гастритом, р < 0,05.

Аллельспецифическая ПЦР для определения полиморфизма гена ФНО-альфа в позиции -308

Праймеры, использованные для определения полиморфизма в гене ФНО-альфа в позиции -308, были следующими: прямой 1-5' - ATAGGTTTTGAGGGGCATCG - 3', прямой 2-5' - ATAGGTTTTGAGGGGCATCA - 3', обратный - 5' - AAGAATCATTCAACCAGCGG - 3'. Амплификацию выполняли в автоматическом режиме по заданной программе: 94°С 5 мин, 28 циклов 94°C - 25 с, 59°C - 25 с и 72°C - 25 с, элонгация 72°C - 8 мин.

Анализ продуктов амплификации осуществляли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мг/мл) и детекцией в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (312 нм). Статистическая обработка данных

Данные представлены в доле (%) от общего числа. Для сравнения долей применяли анализ таблиц сопряженности (с поправкой Йейтса) и точный критерий Фишера; ОШ - соотношение шансов, ДИ - доверительный интервал (Statistica 8.0). Разница считалась достоверной при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Исследование полиморфизма гена ФНО-альфа Анализ полиморфизма гена ФНО-альфа (-308) показал (рис. 3), что наиболее частым генотипом в группах больных хроническим гастритом и язвой двенадцатиперстной кишки является GG (63 и 33,3 соответственно). Генотип АА был выявлен у 4 больных с язвой двенадцатиперстной кишки, что составляет 11,1% и достоверно выше по сравнению с группой больных хроническим гастритом (p < 0,05).

Необходимо отметить, что частота встречаемости аллеля А была достоверно выше среди больных с язвой двенадцатиперстной кишки по сравнению с группой больных хроническим гастритом и составила 38,9% против 18,5% (p < 0,05, ОШ - 2,8, ДИ -1,4-5,4).

Исследование полиморфизма гена ИЛ-1РА Анализ полиморфизма гена ИЛ-1РА выявил (рис. 4), что у больных хроническим гастритом с наибольшей частотой выявлялся генотип L/L (62,5%). У больных с язвой двенадцатиперстной кишки частота данного генотипа составила 36,8%.

Установлено, что у лиц с язвой двенадцатиперстной кишки частота генотипа 2/L достоверно выше при сравнении с больными хроническим гастритом (64,5 и 33% соответственно, p < 0,05, ОШ - 3,2, ДИ - 1,3-2,7). При этом генотип 2/2 был выявлен только у больных хроническим гастритом (4,5%), что достоверно выше по сравнению с группой больных с язвой двенадцатиперстной кишки.

Воспалительные цитокины, такие как ИЛ-1, ФНО-альфа и ИЛ-8, являются активаторами воспаления при хронической Н. pylori инфекции [23] и играют центральную роль в воспалительных процессах в слизистой оболочке желудка.

ФНО-альфа - главный медиатор воспаления, он стимулирует иммунную систему во многих ее звеньях, изменяет экспрессию цитокинов, ростовых факторов и соответственно функцию клеток. На фоне H. pylori-инфекции происходит увеличение синтеза ФНО-альфа, что является важным патогенетическим фактором, сопровождается угнетением пролифератив-ной активности и вызывает повреждения эпителио-цитов [19]. Так как уровень экспрессии ФНО-альфа регулируется на транскрипционном уровне, многие

70-1 6050403020100 —

2/2 2/L L/L

^ Хронический гастрит

Язва двенадцатиперстной кишки

Рис. 4. Ассоциация аллельных вариантов гена, кодирующего ИЛ-1РА, с воспалительными заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки.

* - достоверно при сравнении с группой больных с хроническим гастритом, p < 0,05.

исследования посвящены полиморфизму промотор-ной области гена ФНО-альфа. Наиболее известной является транзиция G/A в положении -308 (от старта транскрипции гена ФНО), которая характеризуется локальным и системным увеличением концентрации ФНО-альфа [7], что ассоциируется с предрасположенностью к развитию различных осложнений [13].

Бразильскими исследователями показано увеличение частоты генотипа АА в позиции -308 среди больных с язвой двенадцатиперстной кишки (6%), однако отличия от группы практически здоровых лиц не были выявлены [3].

В работе индийских ученых также не была обнаружена ассоциация полиморфизма гена ФНО-альфа в позиции -308 у больных хеликобактериозом с язвой двенадцатиперстной кишки. Однако такая связь была обнаружена при оценке гаплотипа, включающего следующие аллельные замены в гене ФНО-альфа: G (-308), С (-857), А (-863) и Т (-1031) [6].

В других исследованиях показана связь гаплотипа генов ФНО-альфа (-308) и лимфотоксина-альфа (ин-трон 3) с развитием язвы двенадцатиперстной кишки. Установлено, что 27% пациентов с данным заболеванием имеют указанный гаплотип, тогда как среди пациентов с язвой желудка частота гаплотипа составляет 9%, а среди здоровых добровольцев 19% [15].

Полученные нами данные указывают на возможную связь риска развития язвы двенадцатиперстной кишки у носителей аллеля А гена ФНО-альфа в позиции -308.

По литературным данным, аллель 2* в интроне гена ИЛ-1РА ассоциирован с морфологическими проявлениями воспалительной реакции слизистой оболочки желудка у Н. pylori-инфицированных больных [17]. Наличие аллеля 2* ИЛ-1РА связано с высоким уровнем ИЛ-1Р в слизистой оболочке желудка и может вызывать более напряженный иммунный ответ, приводящий к деструкции желудочных желез и снижению секреции соляной кислоты париетальными клетками [22].

В проведенном нами исследовании не было выявлено достоверное различие в частоте аллелей 2* и L у

больных хроническим гастритом и язвой двенадцатиперстной кишки. T. Furuta и соавт. показали наличие ассоциации между аллелем 2 гена ИЛ-1РА и защитным эффектом против язвы двенадцатиперстной кишки [10]. Однако частота данного аллеля среди японцев (в Японии) низкая (6%) по сравнению с европейским населением: в Голландии - 24% [4], Португалии - 28% [16], Испании - 29% [11]. Таким образом, различия в относительной частоте указанных аллелей могут объясняться этническими различиями изученных популяций.

Генотип ИЛ-1РА 2/2, по данным E. El-Omar и соавт. [9] связан с увеличением риска развития рака. Мы выявили достоверное различие в частоте генотипа 2/2 между изученными группами пациентов: 4,3% среди больных хроническим гастритом и 0% среди больных с язвой двенадцатиперстной кишки.

В нашей работе анализ полиморфизма гена ИЛ-1РА показал статистически значимую разницу в наличии генотипа 2/L между изученными группами больных (ОШ - 3,2). Необходимо отметить, что в проводимых ранее исследованиях не выявлена разница данного генотипа между больными с язвой двенадцатиперстной кишки и контрольной группой. Однако в работе, проведенной M. García-González и соавт [11]. показано, что при оценке сочетания ИЛ-1Р-511*С/ИЛ-1Р-31*Т/ИЛ-1р+3954*С/ИЛ-1РА*2 обнаружено повышение риска развития язвы двенадцатиперстной кишки. Авторы предполагают, что пациенты с язвой двенадцатиперстной кишки при наличии сочетания ИЛ-1р -511*С/ИЛ-1р-31*Т/ИЛ-1р+3954*С теряют защитный эффект, оказываемый аллелем ИЛ-1РА 2*.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что для характеристики связи бактерия-хозяин желательно проведение параллельного типирования генов вирулентности Helicobacter pylori и определение полиморфизма генов цитокинов в образце биоп-сийного материала, взятого у пациента.

Сведения об авторах:

Янович Ольга Олеговна - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. клинической и экспериментальной микробиологии; email: [email protected]

Носова Е. С. - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. клинической и экспериментальной микробиологии;

Титов Л. П. - чл.-кор. НАНБ, д-р мед. наук, проф., зав. лаб. клинической и экспериментальной микробиологии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Конорев М. Р., Литвяков А. М., Титов Л. П. // Мед. новости. -

1998. - № 8. - С. 15-20.

2. AbrahamL. J., KroegerK. M. // J. Leukocyte Biol. - 1999. - Vol. 66,

№ 4. - P. 562-566.

3. BarbosaH., Martins L., Santos S. et al. // World J. Gastroenterol. -

2009. - Vol. 15, № 12. - P. 1465-1471.

4. Bioque G., Bouma G., Crusius J. B. et al. // Eur. J. Gastroenterol.

Hepatol. - 1996. - Vol. 8. - Р. 105-110.

5. BrownL. M. // Epidemiol. Rev. - 2000. - Vol. 22, № 2. - Р.283-297.

6. ChakravortyM., DattadeD., ChoudhuryA. et al. // Genetics. - 2008.

- Vol. 87, № 3. - Р.299-304.

7. D'Alfonso S., Richiardi P. M. // Immunogenetics. - 1994. - Vol. 39.

- P. 150-155.

8. Deja G., Jarosz-ChobotP., Polanska J. et al. // Mediators Inflamm. -

2006. - Vol. 2006, № 4. - Р.19724.

9. El-OmarE. M., CarringtonM., Chow W. H. et al. // Nature. - 2000.

- Vol. 404. - P. 398-402.

10. Furuta T., El-Omar E. M., Xiao F. et al. // Gastroenterology. - 2002.

- Vol. 123. - P. 92-105.

11. García-González M. A., Lanas A., Savelkoul P. H. et al. // Clin. Exp. Immunol. - 2003. - Vol. 134, № 3. - Р.525-531.

12. Israel D. A., Salama N., Krishna U. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - Vol. 98. - P. 14625-14630.

13. Jongeneel C. V., BeutlerB. // J. Inflamm. - 1995. - Vol. 96. - P. 46.

14. Kroeger K. M., Abraham L. J. // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1996. -Vol. 40. - P.43-51.

15. Lanas A., García-González M. A., Santolaria S. et al. // Genes Immun. - 2001. - Vol. 2, № 8. - Р.415-421.

16. Machado J. C., Pharoah P., Sousa S. et al. // Gastroenterology. -2001. - Vol. 121. - P. 823-829.

17. Mansfield J. C., Holden H., Tarlow J. K. et al. // Gastroenterology. -1994. - Vol. 106. - P.637-642.

18. RadR., Prinz C., Neu B. et al. // J. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 188. -P.272-281.

19. Strieter R. M., Kunkel S. L., Bone R. C. // Crit. Care Med. - 1993. -Vol. 21. - P. 447-463.

20. Tarlow J. K., Blakemore A. F., Lennard A. et al. // Hum. Genet. -1993. - Vol. 9. - P.403-404.

21. Wilson A. G., Di Giovine F. S., Blakemore A. I., Duff G. W. // Hum. Mol. Genet. - 1992. Vol. 1, N 5. - P. 353.

22. Wolfe M. M., Nompleggi D. J. // Gastroenterology. - 1992. - Vol. 102. - P. 2177-2178.

23. Yamaoka Y., Kita M., Kodama T. et al. // Gut. - 1997. - Vol. 41. -P. 442-451.

Поступила 04.04.12

POLYMORPHISM OF THE GENES IL-1RA AND TNF-ALPHA IN PATIENTS WITH GASTRITIS AND DUODENAL ULCER ASSOCIATED WITH HELICOBACTER PYLORI

O. O. Yanovich, E. S. Nosova, andL. P. Titov

Republican Scientific-Practical Center of Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus

The goal of this work was to determine the rate of the polymorphism of the genes-antagonists of receptor IL-1(IL-1RA) and TNF-alpha in patients with gastritis and duodenal ulcer associated with Helicobacter pylori. The receptors were tested for the clinical manifestation of the disease. A total of 126 patients with different gastroduodenal pathology and H. pylori in autopsy were tested. The results of this work demonstrated a correlation between the risk of duodenal ulcer and allele A of gene TNF-alpha in position 308 in the patients. The analysis of the gene-IL-IRA polymorphism demonstrated statistically significant difference between the patients in the frequency of the genotype 2/l. The results of this work showed that parallel typing of the genes of H. pylori in virulence was required for characterization of the bacteria-patient association. The correlation between the results of the typing with polymorphism of genes of cytokines in patient autopsy was also required.

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 уДК 616.151.5-073.537:577.2.08

М. А. Прасолова1'2, Е. Г. Щепотина2, Г. М. Дымшиц1'3

разработка высокопроизводительного флюоресцентного МЕТОДА определения полиморфизмов в генах гемостаза и фолатного цикла

для клинического использования

1Институт цитологии и генетики СО РАН; 2ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск; 3Новосибирский государственный университет

Понимание важности генетического вклада в развитие заболеваний приводит к необходимости выявления мутаций, повышающих риск патологий, для корректного назначения терапии. Внедрение в клиническую практику генетического анализа требует разработки быстрого и в то же время простого способа детекции генетических дефектов. Нами была разработана система выявления мутаций генов системы свертывания крови и фолатного цикла G20210A FII, G1691A FV, G10976A FVII, G103T FXIII, C807T ITGA2, T1565C ITGB3, G(-455)A FGB, 5G(-675)4G PAI, С677Т и A1298C MTHFR, A2756G MTR, A66G MTRR. Принцип анализа основан на полимеразной цепной реакции с последующей детекцией температурного плавления комплексов амплико-нов со специфичным зондом. Метод позволяет выявлять по три однонуклеотидных полиморфизма в одной пробирке, что повышает производительность анализа в условиях клинического применения. Разработанная система детекции пригодна для тестирования образцов ДНК, выделенных из буккального эпителия, из слюны, из плазмы и сыворотки крови и из урогенитальных соскобов.

Ключевые слова: однонуклеотидные полиморфизмы, анализ кривых плавления, гемостаз, фолатный цикл

На сегодняшний день в молекулярной биологии существует спектр базирующихся на ПЦР методов, позволяющих определять однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) в геноме человека, - ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов)-анализ, аллельспецифичная ПЦР, технологии Taqman, "молекулярные маячки", HRM и др. [6, 9]. Тем не менее, несмотря на высокую точность и широкую распростра-

ненность этих методов в научных исследованиях, их применение в медицинской практике для массового скрининга пациентов остается ограниченным. Часть методик (ПДРФ-анализ, аллельспецифичная ПЦР) не вполне подходит для рутинного клиническогоприме-нения в силу время- и трудозатратности, повышенной вероятности возникновения ошибок вследствие многостадийности анализа. Для правильной интерпретации "сырых" данных, получаемых методами, включающими стадию электрофореза, от исполнителя требуется высокая квалификация, автоматический учет результатов затруднен, высок риск контаминации. Флюоресцентные методы детекции лишены этих недостатков, но тоже имеют свои ограничения. Применение аллельспецифичных зондов (технологии Taqman, "молекулярные маячки", "скорпионы") позволяет проводить анализ одного локуса в одной пробирке, но при этом задействуется 2 флюоресцентных канала, что ограничивает количество полиморфизмов, выявляемых в одной пробирке, до 1-2. Кроме того, часто не удается добиться полной специфичности: сигнал появляется для зонда как соответствующего, так и не соответствующего аллелю, что усложняет интерпретацию результатов (рис. 1).

Существует ряд методов, описанных в литературе, которые для выявления SNPs предусматривают ана-