CC BY
204
© МАКАРЕНКО Е.В., ВОРОПАЕВА А.В., 2004
ГЕНЫ vacA, cagA И babA HELICOBACTER PYLORI У БОЛЬНЫХ ДУОДЕНАЛЬНОЙ ЯЗВОЙ И ХРОНИЧЕСКИМ ГАСТРИТОМ
МАКАРЕНКО Е.В.*, ВОРОПАЕВА А.В.**
Витебский государственный медицинский университет, кафедра терапии №2 факультета повышения квалификации специалистов*
Клиника Витебского государственного медицинского университета**
Резюме. Проведено исследование генов H.pylori cagA, vacAml, vacAm2, vacAsl, vacAs2 и babA у больных дуоденальной язвой и у пациентов с бессимптомным гастритом. Достоверных различий по большинству изученных генотипов между пациентами с дуоденальной язвой и гастритом не выявлено, что свидетельствует о близком генном составе H.pylori в указанных группах. При гастрите по сравнению с больными дуоденальной язвой достоверно чаще встречаются менее патогенные штаммы vacAs2 (%2 = 5,07, p<0,025) и vacAs2m2 (%2 = 6,79, p<0,01). Сходный генный состав штаммов H.pylori при дуоденальной язве и гастрите может быть связан с определенными региональными особенностями субтипов хеликобактерной инфекции в Республике Беларусь, что соответствует аналогичным характеристикам микроорганизма в Западной Европе.
Ключевые слова: физические нагрузки, адаптация, фармакология.
Abstract. Genes cagA, vacAml, vacAm2, vacAsl, vacAs2 and babA of H.pylori were investigated in patients with duodenal ulcer and asymptomatic chronic gastritis. There were no reliable differences between these two groups of patients. But patients with chronic gastritis had vacAs2 (%2 = 5,07, p<0,025) and vacAs2m2 (%2 = 6,79, p<0,01) genes more often than those with duodenal ulcer.
Similar genes of H.pylori in patients with duodenal ulcer and chronic gastritis may result from regional peculiarities of subtypes of the microorganism in the Republic of Belarus and this corresponds to the same microorganism characteristics in Western Europe.
Helicobacter pylori (H.pylori) - грамм-отри-цательная палочка, ассоциированная с различными формами гастродуоденальной патологии, такими, как хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, аденокарцинома желудка и MALT-лимфома.
Клинические исходы хеликобактерной инфекции в значительной степени зависят от генотипа микроорганизма, который имеет видовые различия в разных регионах мира [3, 8].
В геноме H.pylori имеются гены vacA, cagA и babA, которые связывают с повышенной патогенностью микроорганизма. Во всех штаммах H.pylori выявляется ген vacA, кодирующий образование белка VacA, вакуолизирующего цитотоксина, массой 87-95 kD, который вызывает обра-
Адрес для корреспонденции: 210023, г.Витебск, пр.Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра терапии №2 ФПКС - Макаренко Е.В.
зование вакуолей в эпителиоцитах и их гибель. Ген vacA имеет 2 региона: сигнальный - s (signal) и срединный - m (middle). В сигнальном s-регионе гена выделяют два аллельных варианта - sl и s2. Срединный m-регион имеет также два аллельных типа - ml или m2. Количество образующегося цитотоксина VacA зависит от генотипа штамма. Штаммы H.pylori vacAslml продуцируют наибольшее количество цитотоксина VacA и чаще ассоциируются с пептическими язвами. Вариант H.pylori vacAs2m2 не обладает существенной VacA цитотоксической активностью. Штаммы H.pylori vacA s1m2 занимают промежуточное положение [8]. Кроме вакуолизации клеток желудочного эпителия, VacA ингибирует секрецию кислоты в желудке, увеличивает секрецию пеп-синогена, ингибирует клеточную пролиферацию, повреждает митохондрии, дезорганизует цитоскелет клеток желудочного эпителия, обес-
печивает поступление нутриентов к бактерии. H.pylori может питаться экссудатом ткани хозяина, при этом определенное значение имеет воспалительный процесс в слизистой оболочке желудка, который вызывает бактерия. Повреждению слизистой оболочки желудка способствует образование провоспалительных цитокинов: IL-1 в, IL-6, IL-8 и фактора некроза опухоли (TNF-a) [14].
Ген cagA, или цитотоксин-ассоциирован-ный ген (cytotoxin associated gene), идентифицируется не во всех штаммах H.pylori и является маркером островка патогенности PAI (pathogenicity island). Этот островок кодирует образование протеина СagА (120 kD). Отдельные гены cag PAI индуцируют выработку провоспалительных цитокинов в слизистой оболочке желудка. Деле-ция cag PAI блокирует индукцию синтеза провос-палительного цитокина IL-8 в клетках эпителия слизистой желудка. Степень нейтрофильной инфильтрации слизистой оболочки тела и антральной части желудка меньше у пациентов, инфицированных штаммами H.pylori с частично или полностью утраченными PAI в сравнении с больными, инфицированными H.pylori с интактными PAI. Таким образом, штаммы с частично или полностью утраченными PAI обладают меньшей способностью вызывать прогрессию болезни, чем штаммы с интактными PAI [1].
Ген babA (blood group associated binding gene) кодирует образование белка BabA (the blood group antigen binding adhesin) 75-kDa, который является посредником сцепления между Lewis антигенами группы крови человека на клетках желудочного эпителия и H.pylori. BabA индуцирует продукцию интерлейкина IL-8, и его наличие связано с плотностью колонизации. Идентифицировано три аллеля гена bab: babAl, babA2 и babB. Функционально активным является babA2 ген, который в ряде стран ассоциирован с язвенной болезнью и раком желудка [10].
Исследования, которые проводятся в настоящее время многими гастроэнтерологами мира, направлены на изучение связи генетических особенностей H.pylori с тяжестью течения гастродуоденальной патологии. В Республике Беларусь до настоящего времени подобных исследований не проводилось. В связи с вышеизложенным нам представлялось небезынтересным провести исследование генов H.pylori cagA, vacA и babA у пациентов, страдающих язвенной
болезнью двенадцатиперстной кишки, и сопоставить полученные результаты с таковыми у пациентов с хроническим гастритом, что и явилось целью нашей работы.
Методы
Обследованы 68 больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе обострения и ремиссии с длительностью язвенного анамнеза от 3 до 15 лет и 13 пациентов с хроническим гастритом. Возраст обследованных лиц составлял от 20 до 60 лет. При отборе больных дуоденальной язвой соблюдались следующие условия: отсутствие предварительной эрадикационной терапии, приема антибиотиков и/или висмутсодержащих препаратов в течение последнего месяца и антисекреторных препаратов в течение двух недель до исследования. У пациентов группы гастрита отсутствовал язвенный анамнез и жалобы диспептического характера, а по данным морфологического исследования имел место гастрит легкой степени. Все обследованные подвергались процедуре фиброэзофагогастродуоденоскопии с прицельной гастробиопсией. Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) брались биопсийные образцы из антрального отдела желудка. ПЦР производилась с использованием наборов фирмы «Литех» (Россия) и «Амплисенс» (Россия). У всех обследованных лиц в биопсийных образцах определяли генотип H.pylori cagA, vacAml, vacAm2, vacAsl, vacAs2 и babA.
Образцы биопсии были помещены в 0,1 % HCl и хранились при температуре -20°C. Затем их помещали в лизирующий буфер при температуре +56°C на два часа в твёрдофазном термостате ТЕРМО-48, фирмы БИОКОМ (Россия). Концентрация биоматериала составляла 100-200 мг/ мл. Далее проводили сорбционное выделение ДНК с использованием в качестве сорбента се-ликогеля по стандартной методике, разработанной Центральным НИИ эпидемиологии МЗ РФ. Амплификация подготовленных образцов выполнялась в амплификаторе ТЕРЦИК МС-2, фирмы «ДНК-технологии» (Россия) со следующими шагами инкубации: предварительный нагрев, денатурация, отжиг праймеров, достраивание цепи ДНК и окончательное достраивание цепи ДНК [13]. Для сравнения показетелей применялся критерий х2 Пирсона для таблиц сопряженности.
Результаты и обсуждение
У пациентов обеих групп методом ПЦР в биопсийных образцах были идентифицированы все исследовавшиеся генотипы H.pylori: cagA, vacAml, vacAm2, vacAsl, vacAs2 и babA (табл. 1).
По большинству изученных генотипов статистически значимых различий между группами больных дуоденальной язвой и гастритом (критерий X2) не выявлено (р>0,1),что свидетельствует о близком генном составе H.pylori у больных язвенной болезнью и гастритом. Тем не менее, у пациентов с гастритом по сравнению с больными дуоденальной язвой достоверно чаще встречаются штаммы vacAs2 (x2 = 5,07, p<0,025) и vacAs2m2 (%2 = 6,79, p<0,01). Прослеживается тенденция к более высокой частоте штаммов с генетическими субтипами vacAm2 и штаммов-микстов с субтипами vacAml + vacAm2 и vacAsl + vacAs2 и меньшей частоте генотипа H.pylori cagA при гастритах. Однако эти различия по сравнению с больными дуоденальной язвой недостоверны. Отсутствовали отличия по частоте выявления гена babA.
Проведенное нами исследование продемонстрировало наличие близких генотипов микроорганизма H.pylori у больных язвенной болезнью и гастритом в Республике Беларусь. Вместе с тем, как и в большинстве европейских стран, в нашей стране частота генотипов vacAs2 и vacA s2m2 среди больных дуоденальной язвой ниже, чем у пациентов с бессимптомным гастритом, что, веро-
ятно, может оказывать влияние на характер течения и прогноз гастродуоденальной патологии.
Результаты проведенных в различных странах мира исследований, в которых изучались генотипы H.pylori при гастродуоденальной язве, существенно отличаются. В странах Западной Европы штамм vacAsl чаще ассоциируется с пептической язвой, чем vacAs2. Имеются данные о важной роли в гастродуоденальной патологии генотипа vacAsl/cagA+. Во многих странах мира этот генотип был достоверно чаще ассоциирован с гастродуоденальной язвой, чем с другой патологией [8]. В Индии генотип vacA sl/ml и cagA имели 80-90% штаммов H.pylori у пациентов с язвенной болезнью [5]. В Бангладеш генотип cagA присутствовал у 75% больных с пептической язвой и у 55% пациентов с функциональной диспепсией, 80% изоля-тов от пациентов с язвой имели потенциально ток-сигенный аллель гена vacA - vacAsl. У пациентов с диспепсией данный генотип выявлен в 60% случаев [7]. В Эстонии в 87% биопсийных образцов, взятых от пациентов язвенной болезнью и гастритом, был обнаружен cagA ген. Присутствие cagA гена коррелировало с субтипом vacA sla [2].
Высокая частота выявляемости антигена babA2 у пациентов с язвенной болезнью отмечена в Германии, Португалии и Финляндии и более низкая в Швеции [3]. На Тайване у всех больных с гастродуоденальной язвой и хроническим гастритом в биопсийном материале обнаружен штамм
H.pylori с генотипом babA2 [ll].
Таблица l
Распределение генотипов H.pylori в группах обследованных
Больные дуоденальной язвой Гастрит
Субтипы H.pylori N =68 N= 13
n % n %
cagA 46 67,6 7 53,8
babA 30 44,1 5 38,5
vacAml 46 67,6 ll 84,6
vacAm2 51 75 12 92,3
vacAsl 50 73,5 ll 84,6
vacAs2 37* 54,4 12 92,3
vacAml+ vacAm2 35 51,5 9 81,8
vacAsl+ vacA s2 35 51,5 8 72,7
vacAmlsl+ vacAm2s2 22 32,4 8 72,7
vacA mlsl 33 48,5 l0 76,9
vacA m2s2 33* 48,5 l2 92,3
Примечание: N - количество обследованных в группе; п - количество обследованных с положительным признаком (субтипом); * - наличие достоверных отличий (р<0,05) по признаку от контрольной группы.
Штаммы H.pylori vac A si+cagA+babA 2+ были в значительной мере ассоциированы с язвенной болезнью в Германии и Португалии, очень тесно коррелировали с язвенной болезнью в Финляндии, однако такая зависимость не отмечена в Швеции. Указанное сочетание генов имеет более высокую специфичность для выявления язвенной болезни в указанных странах, чем cagA+ штаммы [3 ].
В то же время исследования, проведенные в США, не подтвердили ассоциации vacA и cagA генов H.pylori с дуоденальной язвой [9]. В Шри-Ланке также не было найдено связи между vacAsl ami и cagA генами H.pylori и гастродуоденальными заболеваниями [12]. В Гон-Конге ни cagA, ни vacA не были ассоциированы с язвенной болезнью [6].
В ряде азиатских стран обнаружена высокая частота присутствия гена babA2 у пациентов с дуоденальной язвой, тем не менее ни babA2, ни комбинация babA2/cagA/vacAsi не расцениваются как факторы риска язвенной болезни [4]. На Тайване все штаммы H.pylori имеют ген babA и подавляющее большинство - ген cagA, поэтому обнаружение указанных генотипов не может считаться предвестником заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки [10, 11].
Приведенные данные соответствуют точке зрения о зависимости генного состава микроорганизма H.pylori от популяционно-регионарных характеристик [14]. Полученные нами результаты в основном согласуются с таковыми, описанными европейскими исследователями [1, 2, 8].
Выводы
1. У пациентов с хроническим гастритом по сравнению с больными дуоденальной язвой достоверно чаще встречаются менее агрессивные штаммы H.pylori vacAs2 и vacAs2m2.
2. У больных дуоденальной язвой и хроническим гастритом отсутствуют статистически значимые различия по большинству изученных генотипов H.pylori: cagA, vacAm1, vacAs1 и babA. Это свидетельствует о близком генном составе H.pylori при указанных формах гастродуоденальной патологии.
3. Полученные генетические характеристики белорусских регионарных вариантов H.pylori в целом соответствуют таковым, характерным для европейской популяции.
Литература
1. Association of cagA and vacA Genotypes of Helicobacter pylori with Gastric Diseases in Estonia / H Andreson, K.Loivukene, T. Sillakivi et al. // J. Clin. Microbiol. - 2002.
- Vol.40, № 1. - P. 298-300.
2. Correlation of the Helicobacter pylori virulence and adherence factors vacA, cagA and babA with ulcer disease in four different European Countries / S.Buelau, M.Oleastro, R.Karttunen et al. // J. Gastroenterol. Hepat. -2002. - Vol. 17, suppl. - P. 818.
3. Determination of Helicobacter pylori Virulence by Simple Gene Analysis of the cag Pathogenicity Island / T.Ikenoue, S.Maeda, K.Ogura et al // Clinical diagnostic laboratory immunology. - 2001. - Vol.8, №1. - Р 181-186.
4. Discrimination between Cases of Duodenal Ulcer and Gastritis on the Basis of Putative Virulence Factor of Helicobacter pylori/Y.Yamaoka, J.Souchek, S.Odenbreit et al. // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol.40, №6. - P. 22442246.
5. Distinctivenes of genotypes of Helicobacter pylori in Calcutta / A.K. Mukhopadhay, D.Kersulyte, J.Y. Jeong et al. // Indua J. Bacteriol. - 2000. - Vol.182. - P. 3219-3227.
6. Distribution of Distinct vacA. cagA and iceA Alleles in Helicobacter pylori in Hong Kong / B.C.Y Wong, Y. Yin,
D.E. Berg et al. // Helicobacter. - 2001. - Vol.6, №4. - P. 317-324.
7. DNA-Level Characterization of Helicobacter pylori Strains
from Patient with Overt Disease and with Infection in Bangladesh / M.Rahman, A.K.Mukhopadhyay, S.Nahar et al. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol.41, №5. - P. 20082014.
8. Geographic distribution of vacA allelic types of Helicobacter
pylori / L.J.van Doorn, C.Figueiredo, F.Mйgraud et al. // Gastroenterology. - 1999. - Vol.116, №4. - P.823-830.
9. Helicobacter pylori cagA status and s and m alleles of vacA in isolates from individuals with a variety of H. pylori-associated gastric diseases / D.G.Evans, D.M. Queiroz,
E.N.Mendes, D.J. Evans // J. Clin. Microbiol. - 1998. -Vol.36. - P. 3435-3437.
10. High Prevalence of cagA- and babA2-Positive Helicobacter
pylori Clinical Isolates in Taiwan / C.-H. Lai, C.-H. Kuo, Y.-C. Chen et al.// J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol.40, №10. - P.3860-3862.
11. Host gastric Lewis expression determines the bacterial density of Helicobacter pylori in babA2 genopositive infection / B.-S. Sheu, S.-M. Sheu, H.-B. Yang et al. // Gut.
- 2003. - Vol.52. - P. 927-932.
12. Prevalence of Helicobacter pylori in Sri Lanka as Determined by PCR / N. Fernando, J. Holton, D. Vaira et al. // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol.40, №7. - P. 26752676.
13. Rapic and Simple method for purification of nucleic acids /
R. Boom, C.J.A. Sol, M.M.M. Salimans et al. // J. Clinical Microb. - 1990. - Vol.28, №3. - P. 495-503.
14. Ricci V, Zarrilli R., Romano M. Voyage of Helicobacter pylori in human stomach: odyssey of a bacterium // Digest. Liver Dis. - 2002. - Vol.34, №1. - P. 2-8.
Поступила 06.01.2004 г. Принята в печать 26.03.2004 г.
