CC BY
46
УДК 616.361-002.2
М.А. КАЗАКОВА, Р.А.ФАЙЗУЛЛИНА, И.И. АХМЕТОВ, Е.В. ВАЛЕЕВА, Э.С. ЕГОРОВА
Казанский государственный медицинский университет, 420012, Россия, Казань, ул. Бутлерова, д. 49
Значимость полиморфизма гена 174 G/C ILS у детей с сочетанной гастродуоденальной и билиарной патологией, ассоциированной с HeiicobacterPyiori
Контактная информация:
Казакова Мария Анатольевна — ассистент кафедры пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета, тел. (843) 236-71-72, е-mail: marijaku4umova@gmail.com
Файзуллина Резеда Абдулахатовна — доктор медицинских наук, заведующая кафедрой пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета, тел. (843)236-71-72, е-mail: r868@mail.ru
Ахметов Ильдус Ильясович — доктор медицинских наук, заведующий отделом молекулярной генетики ЦНИЛ, тел. (843)236-71-72, е-mail: genoterra@mail.ru
Валеева Елена Валерьевна — младший научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории, тел. (843)236-71-72, е-mail: vevaleeva@ya.ru
Егорова Эмилия Сергеевна — младший научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории, тел (843)236-71-72, е-mail: jastspring@yandex.ru
Статья поступила: 19.03.2018, принята в печать: 28.03.2018
Проведено изучение полиморфизма гена IL6 из биоптатов СО двенадцатиперстной кишки (ДПК) у детей школьного возраста. ДНК выделяли из биоптатов СО ДПК сорбентным методом, генотипирование осуществляли с помощью ПЦР.В результате проведенного исследования установлено, что частота генотипа GG у больных с хроническим гастродуоденитом в сочетании с хроническим холециститом в 1,5 раза превышает данный показатель у пациентов с сочетанной патологией гастродуоденальной зоны и функциональными нарушениями билиарного тракта. Частота генотипа СС у больных изолированным хроническим гастродуоденитом составила 43% (p<0,05); в группе пациентов с патологией гастродуоденальной зоны в сочетании с органическими поражениями билиарного тракта данный генотип не встречался. В исследовании чаще встречался генотип GG у пациентов с органической патологией билиарного тракта, ассоциированных с H. pylori. Таким образом, выявлено преобладание генотипа GG полиморфизма гена IL6 — 174 у пациентов с сочетанной органической патологией гастродуоденальной и билиарной зоны у детей. Гзнотип GG чаще встречается у пациентов сочетанной органической патологией гастродуоденальной и билиарной зоны у детей, ассоциированных с H. pylori.
Ключевые слова: полиморфизм гена IL6 — 174 G/C, Helicobacterpylori, хронический гастродуоденит, хронический холецистит, дисфункция желчевыводящих путей, дети.
(Для цитирования: Казакова М.А., Файзуллина Р.А., Ахметов И.И., Валеева Е.В., Егорова Э.С. Значимость полиморфизма гена 174G/C IL6 у детей с сочетанной гастродуоденальной и билиарной патологией, ассоциированной с Нelicobacterpylori. Практическая медицина. 2018, №2 (113) С. 47-51)
M.A. KAZAKOVA, R.A. FAYZULLINA, I.I. AKHMETOV, E.V. VALEEVA, E.S. EGOROVA
Kazan State Medical University, 49 Butlerov Str., 420012 Kazan, Russian Federation
Polymorphism of the 174 G / C ILS gene in children with combined gastroduodenal and biliary pathology associated with Helicobacter Pylori
Contact details:
Kazakova MA — Assistant Lecturer of the Department of Propedeutics of Children's Diseases and Faculty Pediatrics with a course in children's diseases of Therapy Faculty, tel. (843) 236-71-72, е-mail: marijaku4umova@gmail.com
Fayzullina R.A. — Doc. Med. Sc., Head of the Department of Propedeutics of Children's Diseases and Faculty Pediatrics with a course in children's diseases of Therapy Faculty, tel. (843)236-71-72, е-mail: r868@mail.ru
Akhmetov I.I.— Doc. Med. Sc., Head of the Department of Molecular Genetics of the Central scientific-research laboratory, tel. (843)236-71-72, е-mail: genoterra@mail.ru
Valeeva E.V. — Junior Researcher of the Central scientific-research laboratory, tel. (843)236-71-72, е-mail: vevaleeva@ya.ru Egorova E.S. — Junior Researcher of the Central scientific-research laboratory, tel. (843)236-71-72,e-mail: jastspring@yandex.ru The article was submitted on: 19 February 2018, accepted for publication on: 28 March 2018
The study of the polymorphism of the IL6 gene from biopsy specimens of duodenal in schoolchildren was carried out. DNA genes were isolated from biopsy samples of duodenal with sorbent method, genetic typing was carried out with PCR method. As a result of our study, it was found that the frequency of occurrence of the GG genotype in patients with chronic gastroduodenitis combined with chronic cholecystitis is 1.5 times higher than that in patients with combined pathology of the gastroduodenal zone and functional disorders of the gallbladder. The frequency of occurrence of the CC genotype in patients with isolated chronic gastroduodenitis was 43%, in the group of patients with pathology of the gastroduodenal zone in combination with organic lesions of the biliary tract, this genotype was not found. In our study, the GG genotype was more common in patients with organic pathology of the biliary tract associated with H. pylori. Thus, we have found the prevalence of the GG polymorphism in the IL6-174 gene in patients with combined organic pathology of the gastroduodenal and biliary zone in children associated with H. pylori.
Keywords. Polymorphism of IL6 174 G/C gene, Helicobacter pylori, chronic gastroduodenitis, chronic cholecystitis, bile duct dysfunction, children.
(For citation: M.A. Kazakova, R.A. Fayzullina, I.I. Akhmetov, E.V. Valeeva, E.S. Egorova. Polymorphism of the 174 g/c il6 gene in children with combined gastroduodenal and biliary pathology associated with Helicobacter Pylori. Practical Medicine. 2018, №2 (113) a 47-51)
Н. ру/ог/'-индуцированное воспаление слизистой оболочки (СО) желудка опосредуется выбросом про- и противовоспалительных цитокинов. Интенсивность и продолжительность воспалительного процесса у разных лиц различается. Это зависит от количества вырабатываемых в слизистой оболочке интерлейкинов. У одних пациентов воспаление может протекать агрессивно, с яркими клиническими проявлениями,у других, напротив, хронически, не сопровождаясь системными изменениями. При адгезии данного микроорганизма на эпителиоци-ты слизистой макроорганизма происходит синтез провоспалительных цитокинов ИЛ-8,ФнО-а,ИЛ-1виИЛ-6[1].
Интерлейкин-6 является цитокином, который функционирует как воспалительный медиатор и эндокринный регулятор. Кроме того, он играет важную роль в механизмах защиты хозяев в качестве посланника между врожденными и адаптивными системами. Цитокин имеет большое значение в инициации опухолевого роста: доказано, что большинство опухолевых клеток экспрессируют рецепторы для ИЛ-6 [2-4]. Интерлейкин-6 относят к интегральным медиаторам, но длительное и чрезмерное повышение его уровня коррелирует с продолжительностью и тяжестью имеющегося заболевания [5]. Повышение концентрации ИЛ-6отмечается при многих гастроэнтерологических патологиях в фазе обострения [6]. Максимальная секреция ИЛ — 6 эпителиоцитами желудка достигается через 12 ч в ответ на стимуляцию присутствующего Н.ру/ог/ [7]. По данным гистологических исследований, у больных, в СО гастродуоденальной зоны которых преобладали признаки атрофии, наблюдается повышенный уровень ИЛ-6 [8].
Исследования последних лет доказывают, что восприимчивость к инфекционным агентам является генетически детерминированной. Подверженность заболеванию обусловлена сочетанием в гено-
типе индивида определенных аллельных вариантов генов, формирующих неблагоприятный наследственный фон. Ген 1L6 расположен в 7-й хромосоме в области р21. Полиморфизм G>C в нуклеотидной позиции — 174 промоторной зоны (rs1800795) гена 1L6 предположительно влияет на уровень экспрессии данного гена [9]. Полиморфизм данного гена может приводить к межиндивидуальным изменениям транскрипции и экспрессии гена 1L6 и, следовательно, влиять на восприимчивость индивидуума к разнообразным заболеваниям, которые включают инфекцию H. pylori и лежащий в основе патогенез. В целом исследования показывают, что это воспаление усугубляется у пациентов с высоким образованием аллелей провоспалительных цито-кинов и низким образованием аллелей противовоспалительных цитокинов, которые приводят к более высокому риску язвенной болезни желудка. Уровни 1L6 в слизистой оболочке желудка повышаются при H. ру1ог/'-ассоциированном гастрите и уменьшаются после ликвидации инфекции. Кроме того, уровни содержания IL6 в желудке, как сообщается, увеличиваются у H. pylor/'-положительных лиц с карциномой желудка [1, 8].
Ген 1L6 включает пять экзонов. Наличие аллельных вариантов в промоторной области гена 1L6 приводит к различным уровням транскрипции данного гена. Так, гиперпродукция иЛ-6чаще сочетается с носительством Gаллеля полиморфизма гена IL 6, чем Саллеля, указывая на наличие генетической предрасположенности к повышению продукции ИЛ-6 [10]. На сегодняшний день не существует однозначных данных о влиянии полиморфизма в про-моторной области гена 1L6 -174 G>C на патогенез течения сочетанной патологии гастродуоденальной и билиарной систем и развитие осложнений.
Учитывая наличие патогенетической взаимосвязи течения сочетанной гастродуоденальной патологии с особенностями функционирования про-
воспалительного цитокина ИЛ-6, целью нашего исследования явилась оценка роли полиморфизма гена IL6 в зависимости от наличия и выраженности сочетанной патологии гастродуоденальной и билиарной систем, ассоциированной с H. pylori у детей.
Материал и методы
Проведено исследование биоптатов СО двенадцатиперстной кишки (ДПК) у пациентов с сочетанной патологией гастродуоденальной и билиарной систем. В исследовании приняло участие сопоставимое количество детей (30 мальчиков и 39 девочек), средний возраст составил 12,73 ±1,4 лет у мальчиков и 13,41±1,5 лет у девочек.
Наличие у пациентов H. pylori диагностировали с использованием трех методов: быстрого уреазного Хелик-теста, бактериологического метода (определением идентификации, изучения морфологических, биохимических и биологических свойств ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Определение частоты инфицирования H. pylori проводили комплексным методом с использованием скринингового дыхательного Хелик-теста (ООО «АМА», г. Санкт-Петербург) с последующим проведением бактериологического и молекулярно-гене-тического метода исследования биоптатов СО ДПК.
Молекулярно-генетический метод применялся для диагностики H. pylori в биоптатах и трех порциях желчи, полученных путем фракционного дуоденального зондирования. Обнаружение ДНК H. pylori проводили методом, предложенным НПФ «Ли-тех». Экстракцию и очистку ДНКН. pylori биоптатов и образцов желчи проводили сорбентным методом согласно прилагаемой инструкции, с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК коммерческим набором «АмплиПрайм ДНК-сорб-АМ» ООО «НекстБио» (г. Москва).
Для исследования аллельных полиморфизмов генов ДНК выделяли из биоптатов СО ДПК сорбент-ным методом. На данной стадии проведения анализа биопсийный материал подвергался специальной обработке, в результате которой происходил лизис клеточного материала, удалениебелковыхиполиса харидныхфракций,иполучение раствора ДНК, свободного от ингибиторов и готового для дальнейшей амплификации.
Для исследования аллельных полиморфизмов генов ДНК выделяли из биоптатов СО ДПК сорбентным методом в соответствии с прилагаемой инструкцией с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК «АмплиПраймДНК-сорб-АМ» ООО «НекстБио» (г. Москва).
ПЦР проводилась на амплификаторе «Терцик» производства компании ДНК-технология (Россия) с использованием ДНК-полимеразы и олигонукле-отидных праймеров, синтезированных фирмой НПФ «Литех» (Россия).
Нуклеотидные замены определяли после гидролиза амплифицированных фрагментов ДНК с
использованием соответствующих ферментов рестрикции производства «СибЭнзим» (г. Новосибирск) (табл. 1.)
Разделение фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции проводилиэлектрофорезомв8% полиакриламидномгеле. Визуализацию продуктов амплификации и рестрикции проводили путем подкрашивания геля бромистым этидием и фиксированием с помощью трансилюминатора в ультрафиолетовом свете. Фрагмент размером 198 п.н. соответствовал аллелю C, два рестриктных фрагмента размером 140 и 58 п.н.— аллелю G [7].
Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проводили на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью критерия X2, расчет проводили в пакете статистических программ. Сравнение частот аллелей и генотипов проводили с помощью критерия х2с поправкой Йетса на непрерывность, анализ ассоциации полиморфизмов с хроническим гастритом и билиарной патологией с помощью критерия отношения шансов (ОШ).
Результаты исследования и их обсуждение
После оценки жалоб, анамнеза и результатов клинико-инструментальных данных все пациенты были условно разделены на три группы. В первую вошли дети с изолированными формами поражения желудка и ДПК (n=21). Вторую группу составили дети с хроническим гастродуоденитом в сочетании с функциональными нарушениями желчного пузыря (n=24). Третья группа состояла из 24 детей, с диагнозом хронический гастродуоденит в сочетании с хроническим холециститом. Затем проанализировали частоту встречаемости всех генотипов и аллелей в выборке больных и сравнили их с данными для европеоидных популяций (из базы 1000 Genomes) [www. http://www.internationalgenome. org/].
В результате проведенного исследования установлено, что частота встречаемости генотипа GG у больных 3 группы составляла 67 %, что в 1,5 раза превышает данный показатель у пациентов с со-четанной патологией гастродуоденальной зоны и функциональными нарушениями билиарного тракта (табл. 2). В группе пациентов с изолированными формами гастродуоденита данный генотип не встречался. Частота встречаемости генотипа СС у больных изолированным хроническим гастроду-оденитом составила 43 %, в группе пациентов с патологией гастродуоденальной зоны в сочетании с органическими поражениями билиарного тракта данный генотип не встречался. Данные различия в исследованных группах были достоверны (p<0,05).
Персистенция H. pylori в СО способствует мобилизации воспалительных клеток с высвобождением значительного количества цитокинов, в частности ИЛ-6. Выраженность эффектов интерлейкина зависит от уровня его экспрессии. В нашем исследовании чаще встречался генотип GG у пациентов с
Таблица 1
Структура праймеров и ферменты рестрикции, использованные для генотипирования ДНК-маркеров методом ПЦР
Ген Полиморфизм Структура праймера Ферментрестрикции
IL6 - 174 G/C HIGACI ICAGCI IIACICIIIG R:CTGATTGGAAACCTTATTAA SfaNI
Рисунок 1
Электрофореграмма результатов определения полиморфизма гена ^6 — 174 G/CПриведены размеры фрагментов ПЦР и двух ДНК маркеров (100Ьр, риС19/^о9 1).Генотипу GG соответствовали рестрикционные фрагменты длиной 58 и 140пароснований(п.о.)(лунки1,3,5,6,9,12,15), генотипу СG - трифрагмента длиной58,140и198п.о.(лунки2,7,10,11), агенотипу СС- фрагмент длиной 198п.о. (лунка4, 8).
Таблица 2.
Распределение частот аллелей и генотипов гена ^6 среди здоровых и больных сочетанной га-стродуоденальной и билиарной патологией
Аллели Частота встречаемости генотипа
1 группа n=21 2 группа n=24 3 группа n=24 Контроль rs1800795 европеоидной популяции (База 1000 Genomes)
GG 0 0,42 0,67 0,36
GC 0,33 0,25 0,33 0,449
CC 0,67 0,33 0 0,191
Х2 (P — value) 5,117, p<0,05 3,462, p>0,05 14,569, p<0,01
Частота встречаемости аллелей
G 0,17 0,54 0,83 0,584
C 0,83 0,46 0,17 0,416
OR 0,217 1,285 5,435
органической патологией билиарного тракта, ассоциированных с H. pylori, что составило 29 %.
Анатомическая близость гастродуоденальной и билиарной зон способствует попаданию небольшого количества микроорганизмов, в частности H. pylori из кишечника постоянно в желчь в результате дуоденобилиарного рефлюкса, либо энтерогепа-тобилиарным путем. В физиологических условиях их избыточное размножение сдерживают бактерицидные свойства жёлчных кислот. Однако, как показало наше исследование, у лиц с органическими нарушениями в желчевыводящей системе нарушен отток жёлчи, а также встречался генотип GG, все это могло способствовать развитию у данных пациентов воспалительного процесса.
Основные жалобы при обращении у исследуемых пациентов были на болевой абдоминальный и диспепсический синдромы. Диспепсические явления чаще встречались у пациентов с генотипом
GG. Особенно это выражено у детей из 3-й группы с генотипом GG, по сравнению с пациентами по генотипу СС. Основными проявления диспепсии были в виде отрыжки, тошноты, изжоги, рвоты, вздутия живота, запора или неустойчивого стула (табл. 3).
Проявления болевого абдоминального синдрома у пациентов по локализации не в зависимости от полиморфизма гена Ив не имела статистически значимых различий. Отмечено, что пациенты 3-й группы с генотипом GG гена чаще жаловались на проявления астеновегетативного синдрома в виде головной боли, слабости, вялости, что составило 85 % исследуемых.
Заключение
Полученные нами данные свидетельствуют о взаимосвязи течения изолированной гастродуоде-нальной и сочетанной гастродуоденальной и били-арной патологии с особенностями функционирова-
Рисунок 2
Частота полиморфных генотипов IL6 в зависимости от инфицированности пациентов H. Pylori исследуемых групп, (%)
Таблица 3
Распределение генотипов ^6 в зависимости от проявлений диспепсического синдрома, (абс.)
Генотип
GG C/G СС X2(P — value)
Отрыжка горьким 10 2 1 5,710 p<0,05
Отрыжка воздухом 30 16 8 12,570 р<0,01
Тошнота 23 5 1 23,682 p<0,01
Изжога 14 7 7 0,430 p>0,05
Рвота 6 0 0 6,210 p<0,05
Неустойчивый стул 1 0 0 0,018 p>0,05
Запор 1 0 0 0,018 p>0,05
ния провоспалительного цитокина ИЛ-6. Показаны особенности ассоциации аллельных вариантов гена Ив с сочетанной патологией гастродуоденальной и билиарной зон, ассоциированных с Н. Ру1оп, в особенности в том числе в позициях 174 G/C(C^G). Носители аллельного варианта-174 G гена IL6 имеют повышенный риск к распространению инфекции в желчный пузырь и углублению морфологических изменений слизистой.
Выводы
Частота встречаемости генотипа GG у больных сочетанным поражением хронического гастро-дуоденита с холециститом составила 67 %, что в 1,5 раза превышает данный показатель у пациентов с патологией гастродуоденальной зоны в сочетании с функциональными нарушениями били-арного тракта.
Генотип GG чаще встречается у пациентов с органической патологией билиарного тракта, ассоциированных с Н. ру1оп, что составило 29 % против больных из 1 группы (0 %) с изолированным поражением желудка и двенадцатиперстной кишки иинфицированных Н. ру1оп.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, финансовой поддержки, о которых необходимо сообщить.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ivy BastosRamis, Ju'liaSilveiraVianna, Carla VitolaGoncalves , Andrea von Groll, Odir Antonio Dellagostin, Pedro Eduardo Almeida da Silva. Polymorphisms of the IL-6, IL-8 and IL-10 genes and the risk of gastric pathology in patients infected with Helicobacter pylori Journal of Microbiology, Immunology and Infection (2017) 50, 153e159;
2. Ana Maria Sampaio, Sandra CaramujoBalseiro, Maria Reis Silva, Ana Alarcao Maria Joaod'Aguiar, Teresa Ferreira, LinaCarvalho. Association between IL-4 and IL-6 Expression Variants and Gastric Cancer among Portuguese Population GE Port J Gastroenterol. 2015;22(4):143---152;
3. Sugimoto M, Yamaoka Y, Furuta T. Influence of interleukin polymorphisms on development of gastric cancer and peptic ulcer. World J Gastroenterol 2010;16:1188e200;
4. Leja M, Wex T, Malfertheiner P. Markers for gastric cancer pre-malignant lesions: where do we go? Dig Dis 2012;30: 268e76;
5. Terry CF, Loukaci V, Green FR. Cooperative influence of genetic polymorphisms on interleukin 6 transcriptional regulation. J BiolChem 2000;275:18138e44;
6. Щербак В.А. Коррекция иммунных нарушений у детей с хроническим гастродуоденитом // Материалы XIII конгресса детских гастроэнтерологов России — с. 196-198);
7. Симбирцев, А.С. Роль цитокинов в регуляции физиологических функций иммунной системы [Текст] / А.С.Симбирцев // Физиология и патология иммунной системы-2004.- №10.-С.3-9;
8. Kolho KL., Jusufovic J., Miettinen A. et al. Parietal cell antibodies and Helicobacter pylori in children//J PediatrGastroenterolNutr 2000 Mar;30(3):265-8;
9. Виноградова С.В. Роль полиморфизма генов цитокинов в развитии заболеваний печени// Сучаснагастроентеролопя. 2004. Т. 5, №19. С. 15—20
10. Fishman D., Faulds G., Jeffery R., Mohamed-Ali V., Yudkin J.S., Humphries S., et al. The effect of novel polymorphisms in the inter-leukin-6 (IL-6) gene on IL-6 transcription and plasma IL-6 levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis // J. Clin Invest. 1998. V.102. P.1369-1376.
