CC BY
24
они лишь фенотипически подобны тем или иным клеткам печени крыс? Для того, чтобы ответить на этот вопрос мы провели окрашивание антителами к HSA — специфическому антигену гепатоцитов человека и АФП человека — маркеру гепатобластов человека и показателю их секреторной активности. И обнаружили экспрессию обоих маркеров клетками печени крыс на всех исследованных сроках, что свидетельствует не только об их происхождении из трансплантированных клеток пуповинной крови, но и говорит о зрелости этих клеток и их функциональной активности.
Заключение. Трансфекция не изменяет биологических свойств стволовых клеток и их способности дифференцироваться в основные клеточные типы печени. Трансплантированные клетки пуповинной крови, трансфицированные геном GFP, мигрируют из селезенки в печень, сохраняют способность к экспрессии клонированного гена и участвуют в регенерации печени.
Таким образом, полученные результаты позволяют на основе разработанных нами методических подходов выработать принципиально новую схему клеточной и генотерапии наследственных заболеваний (таких как болезнь Вильсона — Коновалова, дефицит —1 -антитрипсина, гемохроматоз, гликогенозы и т.д.), связанных с нарушением экспрессии генов в печени, когда в качестве материала для трансплантации будут использованы аутогенные генетически «вылеченные» стволовые клетки пуповинной крови.
Л.А. Бабийчук, В.И. Грищенко, П.М. Зубов,
О.Л. Зубова, В.В. Рязанцев, Л.В. Бабийчук,
О.В. Кудокоцева, С.А. Любчич Структурно-функциональное состояние и жизнеспособность ядросодержащих клеток пуповинной крови после криоконсервирования*
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, Украина
L.A. Babyichuk, V.l. Grishchenko, P.M. Zubov, Ü.L. Zubova,
V.V. Ryazantsev, L.V. Babyichuk, Ü.V. Kudokovtseva,
S.A. Lyubchich
The structure, fonctions and viability
of the umbilical cord blood nuclear cells after
cryoconservation
Разработаны новые эффективные методы выделения и криоконсервирования ядросодержащих клеток из пуповинной крови, которые позволяют сохранять количественный и качественный состав ядросодержащих клеток (в том числе и стволовых гемопоэтических) после выделения, и демонстрируют достаточно высокий уровень сохранности структурно-функциональных свойств и жизнеспособности CD45+ и CD34+ клеток после криоконсервирования.
* Статья опубликована полностью в рубрике «Оригинальные исследования».
Н.Л. Блатт1, М.Э. Ялвач2, А.К. Шафигуллина3,
И.И. Салафутдинов1, А.П. Киясов3, А.А. Ризванов1 2 3 Влияние Плуроника Р85 на экспрессию мРНК гена остеонектина при остеогенной дифференцировке мезенхимных стволовых клеток человека in vitro
1 ФГДОУВПО «Казанский [Приволжский} федеральный университет», Казань, Россия
2 Департамент генетики и биоинженерии.
Университет Едитепе, г. Стамбул, Турция
3 ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия nblatt@mail.ru
N.L. Blatt1, М.Е. Yalvac2, А.К. Shafigullina3, l.l. Salafutdinov1,
А.Р. Kiyasov3, A.A. Rizvanov123 Effect of Piuronic P85 on osteonectin mRNA expression level during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in vitro
Полимерные наноносители привлекают внимание исследователей в качестве векторов для доставки лекарственных средств. Один из перспективных классов полимеров — неионные полиэфирные блок-сополимеры (Плуроники). Достигнут значительный прогресс в области применения Плуроников для доставки лекарственных средств. Известно, что Плуроники обладают широким спектром биологического действия. Один из перспективных полимерных наноносителей — Плуро-ник Р85, триблок-сополимер этилен оксида CEO) и пропилен оксида (PO) Е026-Р040-Е026. Показано, что Плуроник Р85 ингибируют механизмы множественной лекарственной резистентности (MDR), повышая эффективность противораковой терапии. Кроме того, недавно было показано, что внутримышечное введение мышам Плуроника Р85 совместно с плазмидной ДНК существенно повышало эффективность прямой генной терапии.
Несмотря на достигнутый прогресс, влияние Плуроников на биологические свойства стволовых клеток человека остается малоизученным. Взаимодействие Плуроников в составе разрабатываемых лекарственных препаратов со стволовыми клетками организма может оказывать опосредованное влияние на регенерационный потенциал организма.
Цель работы: исследовать влияние неионного блок-сополимера (Плуроника) Р85 на экспрессию мРНК гена остеонектина при остеогенной дифференцировке муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) человека in vitro.
Материал и методы. ММСК выделили из третьего моляра человека (зуб мудрости). Непрорезавшиеся третьи моляры человека (3 шт.) удалили хирургическим методом у здоровой пациентки (20 лет) в профилактических целях. Пульпу зуба извлекли в асептических условиях, разрезали на мелкие кусочки стерильным скальпелем и поместили в культуральную среду —МЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров, пенициллина-стрептомицина. После 10 сут. инкубации при +37°С во влажной атмосфере с содержанием 5% С02, клетки образовывали монослой. Культуральную среду меняли каждые 2 сут. В экспериментах использовали клетки 4^5 пассажа.
Для остеогенной дифференцировки клетки высевали на 6-луночные плашки в концентрации 3000 клеток/см2. На следующий день к клеткам добавляли Плуроник Р85 (Basf) в конечной концентрации 0,01% (вес/ объём). После инкубации в течение 24 ч культуральную
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 3, 2010
среду заменили на дифференцировочную среду. Через 7 сут. дифференцировки выделяли общую РНК из клеток, синтезировали кДНК и проводили количественный анализ экспрессии мРНК гена остеонектина с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).
Результаты и обсуждение. Известно, что остеонек-тин — гликопротеин, секретируемый остеобластами и участвующий в минерализации костной ткани. Таким образом, повышение экспрессии мРНК гена остеонектина свидетельствует о повышении дифференцировки ММСК в остеогенном направлении. ММСК — мульти-потентные клетки, способные к дифференцировке в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях. Нами показано, что обработка ММСК Плуроником Р85 статистически значимо повышала уровень экспрессии мРНК гена остеонектина. Полученные данные могут быть применены в тканевой инженерии при экспансии ММСК in vitro с последующей дифференци-ровкой в остеогенном направлении.
В.Г. Богдан 1, М.М. Зафранская а, Ю.М. Гаин а,
Ю.Е. Демидчика
Композиционные биоматрицы с желатиновым матриксом и мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани
1 Военно-медицинский факультет в УО «Белорусский государственный медицинский университет»
2 ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования»,
Минск, Беларусь bogdan-5@mail.ru
V.G. Bogdan, М.М. ZafranskayA, Y.M. Gain, Y.E. Demidchik Comparative descriptoin of composition biomatrises with three-dimensional gelatinous matrix and adipose derived multipotent mesenchymal stromal cells (adMMSC)
Цель исследования: провести сравнительный анализ эффективности культивирования мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани (ММСК ЖТ) крысы в трёхмерном желатиновом матриксе на различных вариантах опорных матриц, которые представлены хирургическими сетками «Prolene», «Vypro», «Ultrapro», «Vicryl» и «Proceed», ориентированными на их дальнейшее использование в качестве пластического материала для восстановления каркасной функции брюшной стенки.
Материал и методы. В планшет с сетками, покрытыми желатиновым матриксом и без него, засевали ММСКЖТ крысы второго пассажа в количестве 2x104 клеток/см2 в 1 мл питательной среды. Инкубировали 3-е сут. По окончании проводили окраску флюоресцентными красителями, после чего микроскопирова-ли в режиме эпифлуоресценции, с последующей трип-синизацией и подсчётом количества прикрепленных к сетке клеток в камере Горяева.
Результаты. При проведении люминесцентной микроскопии на сетках «Vicryl», «Vypro», «Ultrapro», «Prolene», покрытых желатином, а также на образцах сеток «Vicryl», не покрытых желатином, были обнаружены многочисленные группы распластанных живых клеток. При этом на хирургических сетках «Vypro», «Ultrapro», «Prolene» без желатинового матрикса выявлено большое количество одиночно расположенных живых клеток. В лунках со всеми образцами многослойной неадгезивной сетки «Proceed» реакция среды
была кислой, все клетки погибли, и не прикрепились к матричной основе. Распределение клеток на синтетических материалах было неоднородным, со скоплениями их в участках переплетения нитей и узлах.
Результаты подсчёта числа клеток на 1 см2 различных вариантов хирургических сеток, проведенного после трипсинизации, показали достоверное преобладание количества ММСК ЖТ на сетчатом эндопротезе «Vicryl» как с желатиновым матриксом, так и без него (р=0,0023 и р=0,0001, соответственно). При парном сравнении достоверно установлено, что среди исследованных образцов сеток без желатинового матрикса наибольшей способностью обеспечивать адгезию и рост клеток обладает полностью рассасывающаяся сетка «Vicryl», как по отношению к частично рассасывающимся облегченным композиционным сетчатым имплантатам «Vypro» (р=0,008) и «Ultrapro» (р=0,004), так и в сравнении с нерассасывающимся материалом «Prolene» (р = 0,0008). Интактные образцы хирургических сеток «Vypro» и «Ultrapro» в качестве опорной матрицы для МСК ЖТ имеют схожие показатели (р=0,337), превосходя «Prolene» (р=0,002 и р=0,028, соответственно).
Обработка желатином повышает способность сеток обеспечивать адгезию ММСК ЖТ. Выявлено достоверное увеличение количества прикрепленных к сетке жизнеспособных ММСК ЖТ при исследовании всех изучаемых вариантов хирургических имплантатов: «Vicryl» (р = 0,03), «Vypro» (р = 0,04), «Ultrapro» (р = 0,04) и «Prolene» (р = 0,03). Проведенное парное сравнение образцов сеток, содержащих нерассасыва-ющиеся мононити, покрытых желатином, не выявило достоверных различий между ними («Vypro»^ «Ultrapro» р = 0,631; «Vypro» — «Prolene» р=0,128 и «Ultrapro» — «Prolene» р = 0,262, соответственно) и позволило сделать предположение о том, что желатиновое покрытие в определённой степени нивелирует значение состава опорной матрицы для адгезии и роста ММСК ЖТ, при сохраняющемся достоверно более высоком количестве клеток на сетке «Vicryl» без полипропилена (р = 0,004). При покрытии этой сетки желатином вместе с ней можно трансплантировать порядка 10 тысяч ММСК ЖТ/см2.
Выводы:
1. В условиях эксперимента in vitro впервые выполнено сравнительное исследование эффективности культивирования ММСК ЖТ крысы в трёхмерном желатиновом матриксе на различных вариантах опорных матриц, которые представлены хирургическими сетками «Prolene», «Vypro», «Ultrapro», «Vicryl» и «Proceed». Доказано, что трёхмерный желатиновый матрикс достоверно повышает способность композиционных биоматриц на основе хирургических сеток обеспечивать адгезию и рост ММСК ЖТ.
2. Установлено, что желатиновое покрытие нивелирует значение состава опорной матрицы для адгезии ММСК ЖТ среди образцов хирургических сеток, содержащих нерассасывающиеся мононити: «Prolene», «Vypro» и «Ultrapro». При этом сохраняется достоверно большее количество клеток на хирургической сетке «Vicryl», в состав которой не включён полипропилен.
3. Для повышения эффективности трансплантации ММСК ЖТ на хирургических сетках необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на поиск новых дополнительных компонентов биотранс-пантатов.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010
