CC BY
36
среду заменили на дифференцировочную среду. Через 7 сут. дифференцировки выделяли общую РНК из клеток, синтезировали кДНК и проводили количественный анализ экспрессии мРНК гена остеонектина с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).
Результаты и обсуждение. Известно, что остеонек-тин — гликопротеин, секретируемый остеобластами и участвующий в минерализации костной ткани. Таким образом, повышение экспрессии мРНК гена остеонектина свидетельствует о повышении дифференцировки ММСК в остеогенном направлении. ММСК — мульти-потентные клетки, способные к дифференцировке в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях. Нами показано, что обработка ММСК Плуроником Р85 статистически значимо повышала уровень экспрессии мРНК гена остеонектина. Полученные данные могут быть применены в тканевой инженерии при экспансии ММСК in vitro с последующей дифференци-ровкой в остеогенном направлении.
В.Г. Богдан 1, М.М. Зафранская а, Ю.М. Гаин а,
Ю.Е. Демидчика
Композиционные биоматрицы с желатиновым матриксом и мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани
1 Военно-медицинский факультет в УО «Белорусский государственный медицинский университет»
2 ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования»,
Минск, Беларусь [email protected]
V.G. Bogdan, М.М. ZafranskayA, Y.M. Gain, Y.E. Demidchik Comparative descriptoin of composition biomatrises with three-dimensional gelatinous matrix and adipose derived multipotent mesenchymal stromal cells (adMMSC)
Цель исследования: провести сравнительный анализ эффективности культивирования мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани (ММСК ЖТ) крысы в трёхмерном желатиновом матриксе на различных вариантах опорных матриц, которые представлены хирургическими сетками «Prolene», «Vypro», «Ultrapro», «Vicryl» и «Proceed», ориентированными на их дальнейшее использование в качестве пластического материала для восстановления каркасной функции брюшной стенки.
Материал и методы. В планшет с сетками, покрытыми желатиновым матриксом и без него, засевали ММСКЖТ крысы второго пассажа в количестве 2x104 клеток/см2 в 1 мл питательной среды. Инкубировали 3-е сут. По окончании проводили окраску флюоресцентными красителями, после чего микроскопирова-ли в режиме эпифлуоресценции, с последующей трип-синизацией и подсчётом количества прикрепленных к сетке клеток в камере Горяева.
Результаты. При проведении люминесцентной микроскопии на сетках «Vicryl», «Vypro», «Ultrapro», «Prolene», покрытых желатином, а также на образцах сеток «Vicryl», не покрытых желатином, были обнаружены многочисленные группы распластанных живых клеток. При этом на хирургических сетках «Vypro», «Ultrapro», «Prolene» без желатинового матрикса выявлено большое количество одиночно расположенных живых клеток. В лунках со всеми образцами многослойной неадгезивной сетки «Proceed» реакция среды
была кислой, все клетки погибли, и не прикрепились к матричной основе. Распределение клеток на синтетических материалах было неоднородным, со скоплениями их в участках переплетения нитей и узлах.
Результаты подсчёта числа клеток на 1 см2 различных вариантов хирургических сеток, проведенного после трипсинизации, показали достоверное преобладание количества ММСК ЖТ на сетчатом эндопротезе «Vicryl» как с желатиновым матриксом, так и без него (р=0,0023 и р=0,0001, соответственно). При парном сравнении достоверно установлено, что среди исследованных образцов сеток без желатинового матрикса наибольшей способностью обеспечивать адгезию и рост клеток обладает полностью рассасывающаяся сетка «Vicryl», как по отношению к частично рассасывающимся облегченным композиционным сетчатым имплантатам «Vypro» (р=0,008) и «Ultrapro» (р=0,004), так и в сравнении с нерассасывающимся материалом «Prolene» (р = 0,0008). Интактные образцы хирургических сеток «Vypro» и «Ultrapro» в качестве опорной матрицы для МСК ЖТ имеют схожие показатели (р=0,337), превосходя «Prolene» Ср=0,002 и р=0,028, соответственно).
Обработка желатином повышает способность сеток обеспечивать адгезию ММСК ЖТ. Выявлено достоверное увеличение количества прикрепленных к сетке жизнеспособных ММСК ЖТ при исследовании всех изучаемых вариантов хирургических имплантатов: «Vicryl» [р = 0,03), «Vypro» (р = 0,04), «Ultrapro» (р = 0,04) и «Prolene» Ср = 0,03). Проведенное парное сравнение образцов сеток, содержащих нерассасыва-ющиеся мононити, покрытых желатином, не выявило достоверных различий между ними («Vypro»^ «Ultrapro» р = 0,631; «Vypro» — «Prolene» р=0,128 и «Ultrapro» — «Prolene» р = 0,262, соответственно) и позволило сделать предположение о том, что желатиновое покрытие в определённой степени нивелирует значение состава опорной матрицы для адгезии и роста ММСК ЖТ, при сохраняющемся достоверно более высоком количестве клеток на сетке «Vicryl» без полипропилена (р = 0,004). При покрытии этой сетки желатином вместе с ней можно трансплантировать порядка 10 тысяч ММСК ЖТ/см2.
Выводы:
1. В условиях эксперимента in vitro впервые выполнено сравнительное исследование эффективности культивирования ММСК ЖТ крысы в трёхмерном желатиновом матриксе на различных вариантах опорных матриц, которые представлены хирургическими сетками «Prolene», «Vypro», «Ultrapro», «Vicryl» и «Proceed». Доказано, что трёхмерный желатиновый матрикс достоверно повышает способность композиционных биоматриц на основе хирургических сеток обеспечивать адгезию и рост ММСК ЖТ.
2. Установлено, что желатиновое покрытие нивелирует значение состава опорной матрицы для адгезии ММСК ЖТ среди образцов хирургических сеток, содержащих нерассасывающиеся мононити: «Prolene», «Vypro» и «Ultrapro». При этом сохраняется достоверно большее количество клеток на хирургической сетке «Vicryl», в состав которой не включён полипропилен.
3. Для повышения эффективности трансплантации ММСК ЖТ на хирургических сетках необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на поиск новых дополнительных компонентов биотранс-пантатов.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010
