CC BY
33
□АО «Институт стволовых клеток человека» Гемабанк □00 «Гемафонд» (Украина]
ThermoFisher Scientific
Материалы III Международного Симпозиума «Актуальные вопросы клеточных технологий»
Москва, 27 сентября 2010 г.
Д.И. Андреева, И.М. Газизов,
М.С. Калигин, А.П. Киясов
Участие трансфицированных мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерации печени крыс
ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский
университет», Казань, Россия
goober@mail.ru
□.I. Andreeva, I.M. Gazizov, M.S. Kaligin, A.P. Kiyasov The role of transfected human umbilical cord blood cells in liver regeneration after partial hepatectomy in rats
Цирроз печени занимает первое место среди причин смертности от болезней органов пищеварения. Единственным эффективным методом лечения цирроза на сегодняшний день является трансплантация печени. Однако ее применение весьма ограничено проблемой нехватки донорских органов, а также возможностью отторжения трансплантированного органа и необходимостью пожизненного приема иммуносуп-рессивных препаратов. В качестве альтернативы трансплантации печени могут быть разработаны и внедрены методы регенеративной медицины и, в частности, трансплантация стволовых/прогениторных клеток. В клеточной медицине возможно применение как ал-логенных, так и аутогенных клеток для лечения ряда заболеваний печени. Однако существуют болезни печени, например наследственные метаболические нарушения, в отношении которых применение аутогенных стволовых клеток очень ограничено. В таком случае весьма перспективным направлением станет разработка методов генетической модификации стволовых и прогениторных клеток и трансплантация готовых «генетически вылеченных» клеток таким больным.
Цель исследования: изучить участие генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии.
Материал и методы. Исследование проведено на 15 беспородных крысах-самцах, которым производили операцию частичной гепатэктомии (ЧГ) по методике Хиггенса и Андерсона и интраоперационно внутри-селезеночно вводили 1x108 ядросодержащих клеток пуповинной крови человека, трансфицированных
геном зеленого флуоресцирующего белка. Трансфекцию мононуклеарной фракции пуповинной крови человека проводили методом электропорации при вольтаже 300, ёмкости 1500 мкф. Животных забивали под эфирным наркозом через 2, 5, 7 сут. после операции, затем органы фиксировали и заливали в парафин по стандартной гистологической методике.
Парафиновые срезы окрашивали иммуногистохимически с моноклональными антителами к зеленому флуоресцентному белку CGFP, разведение 1:800, SIGMA, USA), человеческому лейкоцитарному антигену (HLA-ABC, разведение 1:10, DAKO, Denmark), специфическому антигену гепатоцитов человека (HSA, разведение 1:50, DAKO, Denmark), маркеру гепато-бластов и показателю их секреторной активности (—-фетопротеину, разведение 1:200, DAKO, Denmark). Также клетки выявляли на флуоресцентном микроскопе по свечению зеленого флуоресцирующего протеина.
Результаты. Установлено, что трансплантированные генетически модифицированные клетки пуповинной крови человека довольно быстро попадают в печень: на всех исследованных сроках по результатам флуоресцентной микроскопии было выявлено свечение зеленого флуоресцирующего протеина в этом органе. Для определения морфологии этих клеток провели дополнительное окрашивание срезов печени антителами к GFP и выявили присутствие зеленого флуоресцентного белка в гепатоцитах, синусоидных клетках и холан-гиоцитах уже на ранних экспериментальных сроках. В это же время мы наблюдали в печени экспрессию HLA-ABC — антигена главного комплекса гистосовместимости, широко представленного всеми ядросодержащими клетками человека. Уже на 2 сут. данный маркер клеток человека присутствовал в синусоидных клетках и гепатоцитах. На 5 сут. были выявлены также небольшие HLA-ABC позитивные клетки, находящиеся в структуре портальных трактов, вблизи желчных протоков. Более того, на 7 сут. HLA-ABC позитивные холан-гиоциты появлялись в структуре мелких новообразую-щихся протоков.
Полученные нами экспериментальные данные не оставляют сомнений, что генетически модифицированные стволовые клетки пуповинной крови человека мигрируют в печень и дифференцируются в паренхиматозные и непаренхиматозные клетки печени. Но являются ли эти клетки функционально активными или
они лишь фенотипически подобны тем или иным клеткам печени крыс? Для того, чтобы ответить на этот вопрос мы провели окрашивание антителами к HSA — специфическому антигену гепатоцитов человека и АФП человека — маркеру гепатобластов человека и показателю их секреторной активности. И обнаружили экспрессию обоих маркеров клетками печени крыс на всех исследованных сроках, что свидетельствует не только об их происхождении из трансплантированных клеток пуповинной крови, но и говорит о зрелости этих клеток и их функциональной активности.
Заключение. Трансфекция не изменяет биологических свойств стволовых клеток и их способности дифференцироваться в основные клеточные типы печени. Трансплантированные клетки пуповинной крови, трансфицированные геном GFP, мигрируют из селезенки в печень, сохраняют способность к экспрессии клонированного гена и участвуют в регенерации печени.
Таким образом, полученные результаты позволяют на основе разработанных нами методических подходов выработать принципиально новую схему клеточной и генотерапии наследственных заболеваний (таких как болезнь Вильсона — Коновалова, дефицит —1 -антитрипсина, гемохроматоз, гликогенозы и т.д.), связанных с нарушением экспрессии генов в печени, когда в качестве материала для трансплантации будут использованы аутогенные генетически «вылеченные» стволовые клетки пуповинной крови.
Л.А. Бабийчук, В.И. Грищенко, П.М. Зубов,
О.Л. Зубова, В.В. Рязанцев, Л.В. Бабийчук,
О.В. Кудокоцева, С.А. Любчич Структурно-функциональное состояние и жизнеспособность ядросодержащих клеток пуповинной крови после криоконсервирования*
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, Украина
L.A. Babyichuk, V.l. Grishchenko, P.M. Zubov, O.L. Zubova,
V.V. Ryazantsev, L.V. Babyichuk, O.V. Kudokovtseva,
S.A. Lyubchich
The structure, functions and viability
of the umbilical cord blood nuclear cells after
cryoconservation
Разработаны новые эффективные методы выделения и криоконсервирования ядросодержащих клеток из пуповинной крови, которые позволяют сохранять количественный и качественный состав ядросодержащих клеток (в том числе и стволовых гемопоэтических) после выделения, и демонстрируют достаточно высокий уровень сохранности структурно-функциональных свойств и жизнеспособности CD45+ и CD34+ клеток после криоконсервирования.
* Статья опубликована полностью в рубрике «Оригинальные исследования».
Н.Л. Блатт1, М.Э. Ялвач2, А.К. Шафигуллина3,
И.И. Салафутдинов1, А.П. Киясов3, А.А. Ризванов1 2 3 Влияние Плуроника Р85 на экспрессию мРНК гена остеонектина при остеогенной дифференцировке мезенхимных стволовых клеток человека in vitro
1 ФГАОУВПО «Казанский [Приволжский} федеральный университет», Казань, Россия
2 Департамент генетики и биоинженерии.
Университет Едитепе, г. Стамбул, Турция
3 ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия nblatt@mail.ru
N.L. Blatt1, М.Е. Yalvac2, А.К. Shafigullina3, l.l. Salafutdinov1,
А.Р. Kiyasov3, А.А. Rizvanov123 Effect of Pluronic P85 on osteonectin mRNA expression level during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in vitro
Полимерные наноносители привлекают внимание исследователей в качестве векторов для доставки лекарственных средств. Один из перспективных классов полимеров — неионные полиэфирные блок-сополимеры (Плуроники). Достигнут значительный прогресс в области применения Плуроников для доставки лекарственных средств. Известно, что Плуроники обладают широким спектром биологического действия. Один из перспективных полимерных наноносителей — Плуро-ник Р85, триблок-сополимер этилен оксида (ЕО) и пропилен оксида (РО) Е026-Р040-Е026. Показано, что Плуроник Р85 ингибируют механизмы множественной лекарственной резистентности (MDR), повышая эффективность противораковой терапии. Кроме того, недавно было показано, что внутримышечное введение мышам Плуроника Р85 совместно с плазмидной ДНК существенно повышало эффективность прямой генной терапии.
Несмотря на достигнутый прогресс, влияние Плуроников на биологические свойства стволовых клеток человека остается малоизученным. Взаимодействие Плуроников в составе разрабатываемых лекарственных препаратов со стволовыми клетками организма может оказывать опосредованное влияние на регенерационный потенциал организма.
Цель работы: исследовать влияние неионного блок-сополимера (Плуроника) Р85 на экспрессию мРНК гена остеонектина при остеогенной дифференцировке муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток (MMCK) человека in vitro.
Материал и методы. MMCK выделили из третьего моляра человека (зуб мудрости). Непрорезавшиеся третьи моляры человека (3 шт.) удалили хирургическим методом у здоровой пациентки (20 лет) в профилактических целях. Пульпу зуба извлекли в асептических условиях, разрезали на мелкие кусочки стерильным скальпелем и поместили в культуральную среду —МЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров, пенициллина-стрептомицина. После 10 сут. инкубации при +37°С во влажной атмосфере с содержанием 5% С02, клетки образовывали монослой. Культуральную среду меняли каждые 2 сут. В экспериментах использовали клетки 4^5 пассажа.
Для остеогенной дифференцировки клетки высевали на 6-луночные плашки в концентрации 3000 клеток/см2. На следующий день к клеткам добавляли Плуроник Р85 (Basf) в конечной концентрации 0,01% (вес/ объём). После инкубации в течение 24 ч культуральную
