Влияние Плуроника Р85 на пролиферацию и остеогенную дифференциацию мезенхимных стволовых клеток человека in vitro Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние Плуроника Р85 на пролиферацию и остеогенную дифференциацию мезенхимных стволовых клеток человека in vitro

HJ1. Блатт 1, М.Э. Ялвач 2, АК. Шафигуллина 3, И.И. Салафутдинов 1, АП. Киясов 3, Р.Ф. Масгутов 1-3, ЮГ. Штырлин 1, А.В. Кабанов 4-5, АА. Ризванов 1-2-3

1 Казанский [Приволжский) федеральный университет, Казань

2 Университет Едитепе, Стамбул, Турция

3 Казанский государственный медицинский университет, Казань

4 Медицинский центр университета Небраски, Омаха, США

5 Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Москва

Effect of Pluronic Р85 on proliferation and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in vitro

N.L. Blatt1, ME. Yalvac 2 AK. Shafigullina 3, l.l. Salafutdinov 1, AP. Kiyasov 3, R.F. Masgutov ьз,

Y.G. Shtirlin 1,A.V. Kabanov4 5, A.A. Rizvanov 12 3

1 Kazan Federal University, Kazan

2 Yeditepe University, Istanbul, Turkey

3 Kazan State Medical University, Kazan

4 Medical Center of University of Nebraska, Omaha, USA

5 Lomonosov Moscow State University, Moscow

Исследовано влияние неионного блок-сополимера (Плуроника) Р85 на пролиферацию и остеогенную дифференциацию мезенхимных стволовых клеток (МСК) человека in vitro.

Показано, что в концентрациях 0,1—1% Плуроник Р85 оказывает цитотоксический эффект на МСК. При концентрациях Плуроника Р85 0,001—0,01% происходило повышение пролиферации МСК. Инкубация МСК с Плуроником Р85 повышала эффективность дифференциации клеток в остеогенном направлении.

Ключевые слова: Плуроники, мезенхимные стволовые клетки, пролиферация, остеогенез, дифференциация.

We investigated affect of non-ionic block copolymer (Pluronic) P85 on in vitro proliferation and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (MSCs). We demonstrated that Pluronic P85 at final concentration 0,1—1% was cytotoxic to MSCs. Addition of Pluronic P85 at final concentration 0,001— 0,01% increased proliferation of MSCs. Pre-incubation of MSCs with Pluronic P85 increased osteogenic differentiation efficiency of cells.

Keywords: Pluronic, mesenchymal stem cells, proliferation, osteogenesis, differentiation.

Полимерные наноносители привлекают внимание исследователей в качестве векторов для доставки лекарственных средств. Один из перспективных классов полимеров — неионные полиэфирные блок-сополимеры (Плуроники). Достигнут значительный прогресс в области применения Плуроников для доставки лекарственных средств [1]. Известно, что Плуроники обладают широким спектром биологических активностей. Один из перспективных полимерных наноносителей — Плуроник Р85, триблок-сополимер этилен оксида (ЕО) и пропилен оксида (РО) Е02В-Р040-Е028. Показано, что Плуроник Р85 ингибируют механизмы множественной лекарственной резистентности (МОР), повышая эффективность противораковой терапии [2, 3]. Кроме того, недавно было показано, что внутримышечное введение мышам Плуроника Р85 совместно с плаз-мидной ДНК существенно повышало эффективность прямой генной терапии [4].

e-mail: [email protected]

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010

Несмотря на достигнутый прогресс, влияние Плуроников на биологические свойства стволовых клеток человека остается малоизученным. Взаимодействие Плуроников в составе разрабатываемых лекарственных препаратов со стволовыми клетками организма может оказывать опосредованное влияние на регенерационный потенциал. В связи с этим целью нашей работы стало исследование влияния Плуроника Р85 на пролиферацию и дифференциацию МСК человека.

Материалы и методы

МСК выделили из третьего моляра человека (зуб мудрости) как описано ранее [5]. Непрорезавшиеся три третьих моляра человека удалили хирургическим методом у здоровой пациентки (20 лет) в профилактических целях. Пульпу зуба извлекли в асептических условиях, разрезали на мелкие кусочки стерильным

А

скальпелем и поместили в культуральную среду Alpha modified Minimum Essential Medium (—MEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), пенициллина-стрептомицина (все реагенты для культур клеток фирмы ПанЭко, Москва). После 10 дней инкубации при 37°С в влажной атмосфере с содержанием 5% С02 клетки образовывали монослой. Культуральную среду меняли каждые 2 дня. В экспериментах использовали клетки 4—5 пассажа.

Неионный блок-сополимер Плуроник Р85 (Basf) добавляли в культуральную среду в конечной концентрации от 0,0001% до 1% (вес/объём). Пролиферацию клеток определяли колориметрически с помощью реагента MTS (Promega) на планшетном анализаторе CERES 900HDi (Bio-Tek Instruments, Inc.) через 24 и 72 ч после добавления Плуроника Р85.

Для остеогенной дифференциации клетки высевали на 96- или 6-луночные плашки в концентрации 3000 клеток/см2. На следующий день к клеткам добавляли Плуроник Р85 в конечной концентрации 0,01%. После инкубации в течение 24 ч культуральную среду заменили на среду Dulbecco’s modified essential medium (DMEM, ПанЗко, Москва) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), пенициллина-стрептомицина, 0,1 мМ дексаметазона (Sigma-Aldrich Co.), 10 мМ в-глицерол-фосфата (Sigma-Aldrich Co.), 50 мМ аскорбата (Sigma-Aldrich Co.). Культуральную среду меняли каждые 2 дня. Кальцифицированные костные образования окрашивали методом von Kossa. Активность щелочной фосфатазы определяли колориметрически с помощью субстрата ALK Phosphatase opt. Substrate АР542 (RANDOX) в соответствии с инструкциями производителя на планшетном анализаторе CERES 900HDi (Bio-Tek Instruments, Inc.).

Общую РНК из клеток выделяли с помощью набора High Pure RNA Isolation Kit (Roche), синтез кДНК осуществляли с использованием набора Omniscript

Reverse Transcriptase Kit (Qiagen) согласно инструкциям фирм-производителей. Для количественной оценки экспрессии генов-мишеней в работе применяли ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием набора реагентов SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) на приборе iCycler RT-PCR detection system (Bio-Rad). Праймеры для ПЦР-РВ: GAPDH (прямой: TAT CGT GGA AGG ACT CA, обратный: GCA GGG ATG ATG TTC TGG A) [6]; остео-нектин (прямой: 5'ATG AGG GCC TGG АТС TTC TT 3', обратный: 5' CTGCTTCTCAGTCAGAAGGT 3') [7].

Все эксперименты проводились в трипликатах. Статистический анализ проводили методом t-критерия Стьюдента в программе Excel 2007.

Результаты и обсуждение

Ранее нами было показано, что клетки, полученные из пульпы третьих моляров человека, обладают всеми характеристиками МСК: способны к дифференциации в остеогенном, хондрогенном и адипоген-ном направлении, экспрессируют характерные для МСК поверхностные антигены (CD29 + , CD73 + , CD90 + , CD105 + , CD14-, CD34-, CD44-, CD45-, CD133~, CD166") и высокий уровень факторов транскрипции, играющих ключевую роль в поддержании клеток в дедифференцированном состоянии isox2, c-myc, klf4) [8, 9].

Культуру клеток МСК инкубировали с Плурони-ком Р85 в течение 24 и 72 ч. Морфологический анализ МСК через 24 часа показал, что в концентрации 1 % Плуроник Р85 оказывает выраженное цитотокси-ческое действие, в концентрации 0,1% существенно влияет на морфологию клеток и не оказывает значительного влияния на морфологию МСК в концентрации 0,01% (рис. 1). Анализ жизнеспособности клеточных культур с помощью MTS-теста подтвердил цитотоксическое действие Плуроника Р85 в концентрациях 0,1—1% (рис. 2).

Рис. 1.

Влияние Плуроника Р85 на морфологию мезенхимных стволовых клеток [МСК) in vitro. Плуроник Р85 добавляли в культуральную среду в конечной концентрации 0,01-1% [вес/объём] и клетки инкубировали в течение 24 ч.:

А - культура клеток МСК без добавления Плуроника Р85 [контроль);

Б - МСК с добавлением 0,01% Плуроника Р85;

В - МСК с добавлением 0,1 % Плуроника Р85;

Г - МСК с добавлением 1 % Плуроника Р85. Фазово-контрастная световая микроскопия.

У в. х40

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010

160

140

120

* 100

-О

I—

о

g 80 ю

о 60

40

20

0

1 0,1 0,01 0,001 0,0001 Контроль

Концентрация Плутоника Р85, %

Рис. 2. Влияние Плуроника Р85 на пролиферацию мезенхимных стволовых клеток [МСК) in vitro. Жизнеспособность МСК определяли с помощью MTS-теста 24 и 72 ч после добавления в культуральную среду Плуроника Р85 в конечной концентрации 0,0001-1% [вес/объём).

Жизнеспособность культуры клеток без добавления Плуроника Р85 принята за 100%

Концентрации Плуроника Р85 0,0001^0,01% не приводили к гибели клеток. Интересно, что в концентрациях Плуроника Р85 0,001^0,01% мы наблюдали значительное увеличение жизнеспособности клеточных культур (42^50% соответственно) через 72 ч инкубации, что, по-видимому, связано с повышением пролиферации стволовых клеток.

Далее мы исследовали влияние Плуроника Р85 на остеогенную дифференциацию МСК. Для этого мы инкубировали клетки с Плуроником Р85 в конечной концентрации 0,01%, показавшей наивысший стимулирующий эффект на пролиферацию МСК. Через 24 ч инкубации, среду заменили на остеогенную. Через 7 дней дифференциации мы наблюдали формирование кальцифицированных структур, окрашиваемых методом von Kossa (рис. 3).

Экспрессия щелочной фосфатазы — один из маркеров клеточной дифференцировки в остеогенном направлении [10]. Определение активности фермента с помощью колориметрического метода показало, что активность щелочной фосфатазы в клетках, предварительно обработанных Плуроником Р85 в концентрации 0,01% в течение 24 ч с последующим инкубированием в дифференцировочной среде в течение 7 дней, статистически выше, чем в контрольной клеточной культуре (рис. 4А). Также наблюдалось значительной увеличение уровня экспрессии мРНК гена остеонектина (рис. 4Б). Остеонектин — гликопротеин, секретируемый остеобластами и участвующий в минерализации костной ткани [11].

Таким образом, впервые показано, что добавление Плуроника Р85 оказывает стимулирующий эффект на пролиферацию мезенхимных стволовых клеток человека. Кроме того, впервые показано, что предварительная инкубация Плуроника Р85 повышает эффективность остеогенной дифференциации МСК. Полученные данные могут быть применены в тканевой инженерии при экспансии МСК ex vivo с последующей дифференци-ровкой в остеогенном направлении.

и.і V • • .'ТТЯ

■ ■ - ТІ». * ■ Ч*

ШШЫШж

mmm

Рис. 3. Образование кальцифицированных структур in vitro при дифференциации мезенхимных стволовых клеток [МСК) в остеогенном направлении.

Окраска методом von Kossa:

А - культура клеток МСК без добавления Плуроника Р85 [контроль);

Б - клетки МСК культивировали с Плуроником Р85 в концентрации 0,01 % в течение 24 ч, после чего культуральную среду меняли на дифференцировочную среду и клетки инкубировали в течение 7 дней

120

1OO

140

а

-&

о

о

-&

Контроль

P85

Контроль P85

Рис. 4. Влияние Плуроника Р85 на дифференциацию мезенхимных стволовых клеток [МСК) in vitro в остеогенном направлении. Клетки МСК культивировали с Плуроником Р85 в концентрации 0,01 % в течение 24 ч, после чего культуральную среду меняли на дифференцировочную среду и клетки инкубировали в течение 7 дней:

А - колориметрическое определение активности щелочной фосфатазы; Б - Анализ с помощью ПЦР в реальном времени уровня экспрессии мРНК гена остеонектина

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010

ЛИТЕРАТУРА:

1. Batrakova E.V., Kabanov A.V. Pluronic block copolymers: evolution of drug delivery concept from inert nanocarriers to biological response modifiers. J. Control. Release. 2008; 130C2): 98—106.

2. Batrakova E.V., Li S., Alakhov V.Y. et al. Sensitization of cells overexpressing multidrug-resistant proteins by pluronic P85. Pharm Res. 2003; 20(101: 1581-90.

3. Batrakova E.V., Li S., Brynskikh A.M. et al. Effects of pluronic and doxorubicin on drug uptake, cellular metabolism, apoptosis and tumor inhibition in animal models of MDR cancers. J Control Release 2010; 143 [31: 290-301.

4. Gaymalov Z.Z., Yang Z., V.M. Pisarev, et al., The effect of the nonionic block copolymer pluronic P85 on gene expression in mouse muscle and antigen-presenting cells. Biomaterials 2009; 30Ш]: 1232-45.

5. Yalvac M.E., Ramazanoglu М., Rizvanov A.A. et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo- and neurogenesis. Pharmacogenomics J. 2009; 10C2): 105—13.

6. Lisignoli G., Cristino S., Piacentini A. et al. Cellular and molecular

events during chondrogenesis of human mesenchymal stromal cells grown in a three-dimensional hyaluronan based scaffold. Biomaterials 2005; 26C28): 5677-86.

7. Alliot-Licht B., Bluteau G., Magne D. et al. Dexamethasone stimulates differentiation of odontoblast-like cells in human dental pulp cultures. Cell Tissue Res. 2005; 321(31: 391—400.

8. Yalvac M.E., Ramazanoglu M., Gumru O.Z. et al. Comparison and optimisation of transfection of human dental follicle cells, a novel source of stem cells, with different chemical methods and electro-poration. Neurochem Res. 2009; 34C7): 1272—7.

9. Yalvac M.E., Ramazanoglu M., Rizvanov A.A. et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo- and neurogenesis. Pharmacogenomics J. 2010; 10C2): 105—13.

10. Hoemann C.D., El-Gabalawy H., McKee M.D. In vitro osteogenesis assays: influence of the primary cell source on alkaline phosphatase activity and mineralization. Pathol Biol [Paris], 2009; 57[41: 318—23.

11. Jundt G., Berghauser K.H., Termine J.D. et al. Osteonectin — a differentiation marker of bone cells. Cell Tissue Res. 1987; 248(21: 409-15.

Поступила 30.04,2010

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010

А

■ INI

■ ■

Ш

НПО «ПОЛИСТОМ» ' российский лидер в разработке и производстве материалов для регенерации костной ткани предлагает материалы для создания клеточно-тканевых инженерных конструкций, которые:

2.1 -|

л

к-

(J Z.0 -

о

Z 1

н i.9~

о

с:

ІГ

к 1,0 -

ЛЗ

LL

U ',7 -

(И

X

»- 1,6 ь

с;

О 1,= -

Не цитотоксичны МТТ-тест водной вытяжки

Способствуют адгезии ММСК

контроль

ОБРАЗЦЫ

Способствуют пролиферации ИСК

Способствуют остеогенной д и ф ф е р е н ц и р о в к е ММСК

Серия ПАРОДОНКОЛ

Серия ИНДОСТ

Серия КОЛАПОЛ

I JSC ф

PAKODOMKOL lSNjijlfl.il ? пігЯІІЧШІп

■Jrrtlc - |

pi iwutif пчкпічт

Москва, 107023, ул. Б. Семёновская, д. 40, стр. 4, офис 304-305 Тел/факс (495) 737-68-92, 967-99-38, E-mail: [email protected]