Влияние пластидных мутаций и эритромицина на активность в-гликозидаз у подсолнечника Helianthus annuus L Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 581.174.1:577.2

ВЛИЯНИЕ ПЛАСТИДНЫХ МУТАЦИЙ И ЭРИТРОМИЦИНА НА АКТИВНОСТЬ Р-ГЛИКОЗИДАЗ У ПОДСОЛНЕЧНИКА HELIANTHUS ANNUUS L.

© 2003 г. А.В. Усатое, P.M. Кесслер, Н.С. Колоколова, Е.В. Машкина

The activity of P-glucosidase was studied in mutant tissues of various genetic lines of sunflower and in plants processed by an antibiotic erytro-micin. A level of p-glucosidase activity is considerably increased in mutant tissues in comparison with a green plants.

Введение

Гликозидазы растений относятся к ферментам, которые находя 1ся на перекрестке метаболических превращений практически всех важнейших соединений -стероидов, алкалоидов, фенолов, фитогормонов, оли-го- и полисахаридов. Гликозидазы представляют собой обширную и разнообразную группу гидролитических ферментов, катализирующих гидролиз глико-зидных связей в различных углеводсодержащих биополимерах. Широкому распространению углеводсодержащих соединений в растениях соответствует столь же значительное представительство гликозидаз, участвующих в их катаболизме. Поскольку глюкоза и галактоза являются основными моносахарами большинства гликозидов, олиго- и полисахаридов, такие ферменты, как (3-глюкозидаза и Р-галактозидаза, занимают особое место среди гликозидаз и локализованы практически во всех органах и тканях различных видов растений.

К настоящему времени накоплено немало фактов, свидетельствующих о том, что регулятором активности р-гликозидаз у высших растений могут выступать различные факторы внешней среды. Так, например, при дефиците бора в питательной среде у некоторых растений, в том числе и у подсолнечника, возрастает Р-глюкозидазная активность [1, 2]. У люпина рост активности отмечен после обработки растений антизлаковыми гербицидами [3]. Воздействие повреждающих низких температур приводит к значительному повышению активности р-глюкозидаз в листьях райграсса [4]. Если действие этих внешних факторов на растение не столь сильно и ответное изменение биохимических процессов остается в пределах нормы реакции организма, то после прекращения воздействия нормальное течение метаболических реакций обычно восстанавливается. Напротив, мутации могут вызывать изменения в метаболизме по сравнению с нормой на протяжении всего онтогенеза. В определенном смысле некоторые мутации можно рассматривать как внутренний «экстремальный» фактор, приводящий к аналогичному изменению биохимических реакций.

В настоящее время в НИИ биологии РГУ на генетической основе одной инбредной линии подсолнечника создана коллекция пластомных мутантов с различной степенью хлорофильной недостаточности. Различная степень выраженности мутантного признака у разных генетических линий делает ее удобной

характеристикой для ранжирования этих форм по уровню физиологических отклонений от нормы и в свою очередь позволяет использовать хлорофильные мутанты в качестве моделей для поиска информативных критериев оценки физиологического статуса растений при действии на них экстремальных факторов внешней среды. Цель данной работы - изучение зависимости уровней активности р-глюкозидазы и Р-галактозидазы от фенотипического выражения хло-рофильного дефекта у пластомных мутантов, а также у растений подсолнечника, выращенных на среде с ингибитором органельного белкового синтеза - эритромицином.

Материал и методы

Для определения активности водорастворимых и связанных с мембранами хлоропластов р-гликозидаз, а также содержания редуцирующих сахаров использовали зрелые листья жизнеспособных пластомных мутантных линий подсолнечника (Helianthus annuus L.), выращенных в полевых условиях. Данные линии фенотипически разделялись на две группы: пестролистные и бледно-зеленые мутации chlorina. Все изученные мутанты были индуцированы N-нитрозо-М-метилмочевиной на генетической основе инбредной линии 3629.

Исследование действия эритромицина проводили на 12-дневных проростках подсолнечника зеленой линии 3629. Растения выращивали стерильно на питательном растворе Эриксона, в состав которого вводили антибиотик эритромицин в концентрации от 1 до 5 мМ.

Ферментные препараты водорастворимых Р-глюкозидазы (Р-Д-глюкозид-глюкогидролаза, КФ 3.2.1.21) и р-галактозидазы (Р-Д-галактозид-галактогидролаза, КФ 3.2.1.23) готовили, растирая листовую ткань на холоду в экстрагирующей среде, содержащей 10 мМ диэтилдитиокарбамат натрия. Экстракты центрифугировали 15 мин при 15000 об/мин и фильтровали через колонку (2,8x16,5 см), наполненную молселектом Г-15. Ферментативную реакцию проводили в 0,05 М фосфатно-нитратном буфере pH - 5,0 для Р-глюкозидазы и pH - 3,5 Р-галактозидазы. Субстратами для определения р-глюкозидазной активности служили 4-нитрофенил-или 4-метилумбеллиферил-р-Д-глюкозид, р-галакто-зидазной активности — 4-нитрофенил- или 4-метилум-

беллиферил-р-Д-галактозид. Количество освобожденного продукта ферментативной реакции определяли на фотоэлектроколориметре КФК-2МП (4-нирофенол) или на спектрофлюориметре Hitachi-650-60 (4-метилумбеллиферил). Содержание водорастворимого белка определяли по методу Лоури [5].

Активность хлоропластных ß-гликозидаз изучали в суспензии пластид, фракция которых была получена методом седиментации [6]. В качестве субстратов использовали 4-метилумбеллиферил-р-Д-глюко- и галактозид. Определение содержания белков в хлоро-пластах проводили с помощью модифицированного метода Лоури [7].

Водную вытяжку редуцирующих сахаров получали при инкубировании растертой свежей ткани листьев в водяной бане в течение 1 ч при 75-80 °С. Концентрацию редуцирующих сахаров определяли, используя микрометод [8].

Определение количества хлорофилла в 85 %-й ацетоновой вытяжке проводили на спектрофотометре СФ-26 по методике [9].

Результаты и их обсуждение

Различная степень хлорофильной недостаточности в мутантных пластидах подсолнечника, очевидно, должна коррелировать со снижением их фотосинте-тической активности. Экспериментально эту зависимость можно выявить, определив в мутантных тканях содержание восстановленных сахаров, являющихся первичными продуктами фотосинтеза.

В табл. 1 приведены результаты определения редуцирующих сахаров в процессе вегетации растений. В данном эксперименте использовали как белые участки листьев пестролистной линии уаг-10, содержащей лишь следы хлорофилла, так и зеленые участки тех же листьев с нормальным количеством зеленых пигментов. Для сравнения была взята листовая ткань мутанта еп:сЫоппа-1 с пониженным содержанием хлорофилла (90 % от контрольных значений растений линии 3629).

Таблица 1

Содержание редуцирующих сахаров (% к сухому весу) в листьях пластомных мутантов подсолнечника

на различных стадиях развития

Линия, фенотип ткани Фаза развития

3-4 пара листьев 5-6 пара листьев 7-8 пара листьев Ран. бутонизация Позд. бутонизация Цветение

3629, зеленая 3,8±0,36 4,27±0,43 4,32+0,82 3,88±0,77 3,71 ±0,96 1,31±0,11

еп:сЫ-1 желто-зеленая 2,08±0,41 1,35±0,28 1,64±0,22 1,85±0,62 2,83+0,39 0,97+0,16

уаг-10, зеленая 2,28±0,59 2,76±0,85 2,79±0,58 3,34±0,28 ■ 3,86±0,32 2,96+0,35

уаг-10, белая 0,67±0,17 0,36+0,03 0,12±0,01 0,70±0,07 1,64±0,72 1,17±0,15

Исследование уровня восстанавливаемых сахаров показало, что мутантные участки листьев пестролистной формы уаг-10 по этому показателю значительно уступают зеленым тканям. Содержание сахаров в этих участках было в 3-23 раза ниже, чем в соседних зеленых участках листьев той же линии, а по сравнению с зеленой тканью растений линии 3629 в 5-35 раз (табл. 1). Максимальное количество углеводов у всех изученных мутантов в отличие от контрольной линии 3629 накапливается в фазе поздней бутонизации. Последующее уменьшение их содержания, вероятно, связано с усиленной утилизацией углеводов в репродуктивных органах в фазу цветения. На протяжении всего периода роста растений для бесхлорофильной ткани (мутант уаг-10) характерно пониженное содержание сахаров. Зеленой и желто-зеленой тканям из мутантных линий уаг-10, еп:сЫогша-1 соответствует достаточно высокий уровень углеводов, хотя все же он несколько снижен по сравнению с линией 3629.

Таким образом, существует прямая связь между состоянием фотосинтезирующей системы и содержанием углеводов: чем больше выражена хлорофильная недостаточность в мутантных пластидах, тем ниже концентрация сахаров в тканях растений.

С другой стороны, моносахара также являются продуктами гидролитических реакций, катализируемых р-гликозидазами. Поэтому концентрация редуцирующих сахаров в тканях растений может нахо-

диться в зависимости и от активности данных ферментов.

В табл. 2 приведены результаты определения удельной активности водорастворимых Р-галакто- и р-глюкозидаз в мутантных тканях различных линий подсолнечника в процессе вегетации растений. Наиболее высокие значения удельной активности Р-галактозидазы получены для мутантной ткани пестролистных линий уаг-6, 10, 19, 23. Активность р-галактозидазы в этих тканях'превышает активность фермента в зеленых тканях растений контрольной линии 3629 в 2-3 раза (за исключением фазы цветения). Интересно отметить, что показатели активности Р-галактозидазы из мутантной и зеленой тканей одного и того же пестролистного растения (линия уаг-10) различаются в 2-5 раз.

Различия между контрольной линией 3629 и мутантом еп:сЫолпа-1 выявляются на более поздних этапах развития растений, начиная с 7-8-й пары листьев. Однако они не столь значительны: активность Р-галактозидазы у еп:сЫогша-1 ниже, чем у растений линии 3629 в 1,5-1,8 раза.

Таким образом, прослеживается определенная закономерность: уровень удельной активности Р-галактозидазы находится в зависимости от степени хлорофильной недостаточности и концентрации редуцирующих сахаров в мутантных тканях подсолнечника.

■ Таблица 2

Активность водорастворимой р-галактозидазы (числитель) и р-глюкозидазы (знаменатель) в листьях пластомных мутантов подсолнечника на различных стадиях развития растений

Линия, фенотип ткани Фаза развития

3—4 пара листьев 5-6 пара листьев 7-8 пара листьев Бутонизация Цветение

3629 3.33±0.32 0,57+0,05 3,18±0,82 0,41±0,03 3.71 ±0.51 0,54±0,06 4.96±1.86 0,33±0,09 9,75±1.36 1,34±0,11

En chl-1 2.96+0.17 0.33+0,04 3.21 ±0.3 8 0,77±0,34 2.96±0.38 0,49±0,06 3,03±0,54 0,37±0,04 6.26± 1.31 0,8±0,21

Var-10, зеленая 4,75±0,66 0,8+0,11 3.22±0.77 0,51 ±0,19 2.86+0.29 0,25±0,04 2.93±0.61 0,26±0,02 4.12+0.49 0,51±0,06

Var-10 бепая 11,26±2.02 2,14±0,28 6.8+0 74 2,86±0,51 11.5±1.26 3,46±0,73 7,75±0,54 2,33±0,33 10,5+0.52 2,78±0,67

Var-6 10.08+1.10 1,35+0,14 6.52±0.45 1,92±0,40 13.7±1.31 2,01 ±0,24 8.2±0.82 0,98±0,18 8.1±1.53 1.19±0,13

Var-19 4.3+0,86 0,58±0,06 5.78±1.50 1,6±0,11 9.15±0.83 1,78±0,09 6,47±1,29 1,14±0,12 15.25+3.2 3,23±0,23

Var-23 12.2±1.70 2,34+0,22 6.37±2.16 5,03±0,50 9.55±1,33 3,99±0,76 7.8±1.32 5,25±1,05 9.75±2.53 1,42±0,37

Еще более наглядно указанная закономерность проявляется у изученных форм подсолнечника при сравнении динамики р-глюкозидазы. Удельная активность водорастворимой Р-глюкозидазы в мутантных тканях пестролистных форм (уаг-6, 10, 19, 23) выше, чем в зеленых (3629, \'аг-10) в 3-12 раз, и выше, чем у еп:сЫоппа-1 в 2-10 раз. Однако различия между нормой и сЫоппа в отношении этого фермента еще менее выражены, чем для Р-галактозидазы.

По данным [10], у различных видов растений Р-глюкозидаза прочно связана с клеточными мембранами и при центрифугировании гомогенатов листьев в основном сосредоточена в осажденной фракции. Как показали наши эксперименты, у подсолнечника в зеленых тканях только 10 % от общей активности фермента определяется в водной фазе. В мутантных тканях с ярко выраженной хлорофильной недостаточностью доля водорастворимого фермента увеличивается .до 25 %. В то же время по р-галактозидазной активности надосадочная фракция превышает осажденную почти в 3 раза независимо от типа ткани. На этом основании можно сделать вывод, что у подсолнечника Р-глюкозидаза в основном связана с мембранными клеточными структурами, тогда как р-галактози-дазная активность принадлежит водорастворимым ферментам, локализованным главным образом в вакуолях.

Очевидно, что осажденная фракция клеток при центрифугировании наряду с различными мембранными структурами содержит и тилакоидные системы пластид. У некоторых высших растений были обнаружены р-гликозидазные активности, связанны^ с мембранами хлоропластов. Нам впервые удалось идентифицировать в пластидах подсолнечника как Р-галактозидазную, так и р-глюкозидазную активности. Для выявления зависимости между степенью хлорофильной недостаточности и уровнем активности р-гликозидаз, локализованных непосредственно в му-

тантных пластидах, были выделены фракции пла-стидных мембран контрольной линии 3629, нескольких пестролистных мутантов и желто-зеленого мутанта еп:сЫоппа-5. Удельная активность мембрано-свя-занных р-гликозидаз и содержание хлорофилла в пластидах изучаемых линий приведены в табл. 3.

Аналогично ферментам из водорастворимой фракции мембраносвязанные Р-гликозидазы хлоропластов проявляют повышенную активность в мутантных тканях пестролистных линий по сравнению с контрольными значениями, причем уровень удельной активности р-гликозидаз четко коррелирует со степенью нарушения фотосинтетического аппарата органелл (табл. 3).

Таблица 3

Активность хлоропластных р-гликозидаз и содержание хлорофилла в листьях пластомных мутантов подсолнечника

Линия Активность, мкМ/мин мг белка хЮ'3 Содержание хлорофилла, мг/г сухого веса

ß-галактозидаза ß-глюкозидаза

3629 2,1±0,20 5,53±1,16 6,3±0,53

En:chl-5 2,2+0,22 4,85±0,68 5,5±0,46

Var-6 2,06±0,39 6,0±0,84 4,3±0,52

Var-9 5,8±1,16 15,15±2,58 0,15±0,06

Var-10 6,15±1,60 16,8±4,37 0,25 ±0,09

Var-11 3,7±0,34 11,45+3,55 0,66+0,23

Var-13 4,35±1,13 12.25+2,57 0,70±0,18

Ранее для внеядерных хлорофильных мутаций подсолнечника было показано, что в полном соответствии с пониженным уровнем зеленых пигментов в мутантной ткани наблюдается изменение внутренней структуры пластид [И]. Так, в белых пластидах (линии уаг-9, 10) тилакоидных структур не обнаружива-

ется. В орган^ллах из желтых тканей (линии 11, 13) можно наблюдать только отдельные тилакоиды стро-мы, в то время как в пластидах из желто-зеленых участков (линия var-б) длина тилакоидов стромы увеличивается и иногда появляются неярко. выраженные граны. Ультраструктура пластид жизнеспособных мутантов chlorina (en:chlorina-5) характеризуется появлением тилакоидов гран, однако по мощности они уступают таковым из хлоропластов контрольной линии.

Наиболее высокие значения активности были получены у линий var-9, 10, у которых обесцвечивае-мость мутантных участков проявляется наиболее сильно по сравнению с другими линиями. Желто-зеленая ткань пестролистных химер var-б и линии en:chlorina-5 по величине активности хлоропластных р-гликозидаз не отличается от нормальной зеленой ткани растений 3629. Однако если для водорастворимой фракции была характерна повышенная активность Р-галактозидазы, то в мембранной фракции пластид преобладает р-глюкозидазная активность. Интересно, что независимо от типа исследуемой ткани она превышает уровень активности р-галактозидазы в 2,7 раза. Более того, обе изучаемые активности достигали максимальных величин при одном и том же pH, равном 4,8. Это может свидетельствовать о том, что как р-галактозидазная, так и р-глюкозидазная активности, связанные с мембранными структурами пластид, принадлежат одному и тому же ферменту с широкой специфичностью.

Таким образом, можно сделать вывод, что различные формы р-гликозидаз независимо от их локализации в клетке подчиняются общей биохимической закономерности: их активность резко возрастает в тканях, в которых наблюдается дефицит продукте/ фотосинтеза. Вместе с тем значительное увеличение активности происходит лишь в том случае, когда нарушения внутренних структур пластид достаточно велики, как это имеет место в мутантных участках пестролистных химер. Если же изменения в хлоропластах не столь глубоки, как, например, у мутанта chlorina, то данный эффект не проявляется. По-видимому, существуют некоторые критические концентрации фо-тосинтетических продуктов, и в первую очередь моносахаров, которые инициируют рост активности Р-гликозидаз. Весьма вероятно, что для разных форм ферментов эти критические точки различны, о чем свидетельствует сравнение уровней активности водорастворимых и мембраносвязанных р-гликозидаз в желто-зеленой ткани мутанта var-6.

Структурно-функциональные нарушения фото-синтетического аппарата, вызванные мутационными изменениями в пластоме, приводят к глубоким сдвигам в ходе нормального протекания метаболических процессов в клетке. К аналогичным изменениям могут приводить и эпигенетические факторы. В качестве такого фактора мы исследовали антибиотики, блокирующие белковый синтез на 70S рибосомах. В предварительных экспериментах с различными антибиотиками было обнаружено, что действие некоторых из

них приводит к тем же фенотипическим эффектам, что и хлорофильные мутации. Наиболее эффективным в этом отношении для подсолнечника оказался эритромицин.

Окраска листьев, проростков зеленой линии 3629, выращенных на питательной среде с добавлением эритромицина, зависела от его концентрации. Так, высокие концентрации антибиотика (3-5 мМ) приводят к значительному снижению содержания зеленых пигментов в тканях растений и вместе с тем к необратимым изменениям в функционировании фотосинте-тического аппарата (рисунок).

кониенграция эритромицина, мМ -Н-— I — — 2 • ‘ -Лгу -хл(ан-Ь)"|

Зависимость между концентрацией эритромицина, содержанием хлорофиллов и активностью р-гликозидаз (1 - активность р-глюкозидазы; 2 - активность р-галактозидазы; 3 - содержание хлорофилла а+в) в листьях исходной линии подсолнечника 3629

Листовая ткань проростков подсолнечника линии 3629, выращенных на среде с эритромицином, отличается от ткани контрольных растений высоким уровнем активности водорастворимых р-гликозидаз, причем показатели этой активности практически не зависят от повышения концентрации антибиотика в среде (рисунок). Сравнительно низкая концентрация ■ эритромицина (1 мМ), вызывающая незначительное обесцвечивание листовой ткани и не влияющая на жизнеспособность проростков, индуцировала, вероятно, максимально возможный в данном эксперименте рост как р-глюкозидазной, так и р-галактозидазной активности. Очевидно, активация данных ферментов является одним из звеньев ответной реакции растений на стрессовое воздействие, возникающее в результате снижения концентрации углеводов, индуцированного как хлорофильными мутациями,, так и действием антибиотика. Известно, что на стресс наиболее быстро реагирует лизосомальный аппарат клеток, функции которого в растениях выполняет вакуоль [12]. Активацию лизисных процессов подтверждают данные электронно-микроскопического исследования обесцвеченных тканей подсолнечника как в результате хлорофильной мутации, так и после действия эритромицина. В обоих случаях можно наблюдать наряду с деструкцией фотосинтетических мембран пластид, интенсивную вакуолизацию цитоплазмы. Автолиз в этом случае, вероятно, играет роль реконструктивного фактора, т.е. при недостатке пластических веществ

клетка поддерживает уровень метаболизма за счет расщепления собственных структурных компонентов и последующего использования продуктов расщепления в качестве строительного и энергетического материала. На биохимическом уровне усиление автоли-тических процессов выражается в частности в активации различных гидролитических ферментов. Водорастворимые и мембраносвязанные формы Р-гликозидаз, утилизируя разнообразные соединения углеводной природы участвуют в накоплении необходимого для жизнедеятельности клетки пула простых сахаров. В свою очередь моносахара регулируют активность Р-гликозидаз. Эта регуляция может осуществляться двумя способами. Во-первых, активность Р-гликозидаз и соответственно скорость катализируемых реакций может непосредственно зависеть от концентрации сахаров в клетке. Во-вторых, можно предположить, что недостаток углеводов в тканях с пониженным уровнем фотосинтеза опосредованно активирует ядерные гены, детерминирующие р-гликозидазы. В этом случае индукция синтеза данных ферментов при дефиците продуктов фотосинтеза имеет непосредственное отношение к проблеме пластид-но-ядерных взаимодействий. Механизмы, регулирующие эти взаимодействия на биохимическом уровне, до сих пор неизвестны. Многие исследователи склонны рассматривать пластидные факторы как регуляторы экспрессии ядерных генов. Некоторые предполагают белковую природу этих сигналов [13]. Если это действительно так, то при блокировании белоксинтезирующей системы пластид генерируемые ими сигналы будут исчезать. В связи с этим интересно отметить, что активность р-гликозидаз в проростках подсолнечника, выращенных на среде с эритромицином (соединение, связывающее большую субъединицу 70S рибосом) резко возрастает уже при низкой концентрации антибиотика.

Таким образом, широкое распространение Р-гликозидаз в различных компартментах растительной

клетки, особенности каталитического действия и регуляции их функционирования свидетельствуют о том, что уровень активности этих ферментов может служить интегральным информативным критерием физиологического статуса растений, отражающего не только генотипическую изменчивость, но и динамику метаболических процессов в пределах нормы реакции организма, поддерживающую его адаптивность в постоянно меняющейся' внешней среде.

Работа выполнена при поддержке гранта Минобразования РФ по фундаментальным исследований в области естественных и точных наук Е08-6.0—146.

Литература

1. Маевская АН и dp II Физиология растений. 1981. Т. 28. № 3. С. 536-540.

2. Тимашев НД. и dp. II Вестн Харьковского ун-та. 1981. №211. С. 23-25.

3. Волынец А.П., Палъченко Л. А. И Физиологобиохимические аспекты роста и развития растений. Минск, 1975. С. 50-56.

4. Володько И.К, Школьник М.Я. II Физиология и биохимия культ, растений. 1981. Т. 13. № 4. С. 374-381.

5. Lowry О. et al. // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. № 1. P. 256.

6. Турищева M.C. и др. И Физиология растений. 1987. Т. 34. №6. С. 1097-1102

7. Markwell М. et al. II Anal. Biochem. 1978. Vol. 87. P. 206-210.

8. Арасимович B.B. // Методы биохимического исследования растений. М., 1972.

9. Гавриленко В.Ф. и др. Большой практикум по физиологии растений. М., 1975.

10. Nagahashi Н. et al. II Plant Sci. 1985. Vol. 38. № 3. P. 173-178.

11. Белецкий Ю.Д. Искусственные мутации хлоропластов у высших растений. Ростов н/Д, 1989.

12. Дин Р. Процессы распада в клетке. М., 1981.

13. Brown Е. et al. // Genome Biology. 2001. Vol. 2. № 8.

НИИ биологии Ростовского государственного университета ______________5 августа 2002 г.