Хлорофилльные мутации горчицы Brassica junceae, индуцированные n-нитрозо-n- метилмочевиной Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ских препаратов, распространяемых с земли или воздуха [13] еще более вредные, чем расстрелы. Их применение приведет к непоправимым последствиям для водных и наземных ресурсов фауны дельты Дона, Таганрогского залива. По нашему мнению, рассмотренная колония рыбоядных птиц должна сохраниться, однако численность бакланов необходимо регулировать. Оптимальное их количество, при котором благополучно существовали бы другие птицы, и снизилось бы отрицательное рыбохозяйственное значение бакланов, вероятно, составляет 300 - 600 пар [7]. Это можно осуществить путем разработки и применения комплекса безвредных для живой природы мероприятий, однако пока рыбохозяйственные организации предпочитают использовать периодический отстрел бакланов.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта по фундаментальным исследованиям в области естественных и точных наук Минобразования Российской Федерации № 02-6.0-331.

Литература

1. Казаков Б.А. и др. И Научные основы обследования колониальных гнездовий околоводных птиц. М., 1981. С. 84-86.

2. Казаков Б.А. и др. // Тез. докл. Всесоюз. совещ. по проблемам кадастра и учета животного мира. М., 1986.

Ч. 2. С. 306-307.

3. Миноранский В.А. и др. // Тез. докл. 1 Рост. обл. науч,-практ. конф. Ростов н/Д, 1988. С. 26-28.

Ростовский государственный университет________________

4. Миноранский В.А. и др. И Тез. докл. Всесоюз. совещ. по проблемам кадастра, и учета животного мира. Уфа, 1989. Ч.З.С. 164-166.

5. Миноранский В.А. II Изв. СКНЦ ВШ. Естеств. науки. 1991. №4. С. 33-44.

6. Миноранский В.А. II Материалы 1-й междунар. науч.-практ. конф. «Птицы Кавказа». Ставрополь, 1994. С. 29-31.

7. Миноранский В.А. // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки, 1995. № 2. С. 80-82.

8. Миноранский В.А. и др. И Кавк. орнитол. вестн. Ставрополь, 1998. Вып. 10. С. 86-96.

9. Миноранский В.А. и др. II Современная орнитология. М., 1998. С. 317-321.

10. Миноранский В.А., Добринов А.В. II Кавк. орнитол. вестн. Ставрополь, 1996. Вып. 8. С. 125-131.

11. Лебедева Н.В. и др. II Экосистемные исследования Азовского моря и побережья. Т. 4: Апатиты, 2002. С. 344-359.

12. Казаков Б.А., Ломадзе Н.Х. Н Кавк. орнитол. вестн. Ставрополь, 1992. Вып. 4. Ч. 1. С. 125-131.

13. Миноранский В.А. и др. И Тез. докл. 11 межреспубликанской науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы экологии и охр. природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий». Краснодар, 1998.

• С. 111-112.

14. Велик В.П. II Тез. докл. краевой науч.-практ. конф. «Экологические проблемы Ставропольского края и сопредельных территорий». Ставрополь, 1989. С. 156-159.

12 мая 2003 г.

УДК 575.24

ХЛОРОФИЛЛЬНЫЕ МУТАЦИИ ГОРЧИЦЫ BRASSICA JUNCEAE, ИНДУЦИРОВАННЫЕ iV-НИТРОЗО-А^-МЕТИЛМОЧЕВИНОЙ

© 2003 г. А.В. Усатое, Е.К. Разорителева, Г.М. Федоренко, Л.Б. Щербакова, Е.В. Машкина

NMU induces the chlorophyll mutations in Brassica junceae. Among them are received as nuclear so and plastid mutants. The effecti vity of induction of the plastid mutations raises with increase of NMU concentration.

В [1] разработан эффективный способ индукции пластомных хлорофилльных мутаций у подсолнечника с помощью Д^-нитрозо-А^-метилмочевины (НММ). В связи с тем, что спонтанная изменчивость хлоро-пластов очень низка, а искусственное получение мутаций пластома до сих пор сопряжено со значительными трудностями, особый интерес представляло изучение возможности индукции пластидных мутаций с помощью НММ на других видах высших растений. В данной работе приведены результаты по индукции НММ хлорофилльных мутаций у горчицы, а также их генетическому и биохимическому анализу.

Материал и методы исследования

Воздушно-сухие семена горчицы Вгаззка ]ипсеае Ь. сорта Донская-5 обрабатывали водными растворами НММ в концентрации 0,01, 0,02 и 0,03 % при 25°С в условиях, приближенных к анаэробным при pH 7,0 -7,2. Обработанные и контрольные семена отмывали в проточной воде в течение 20 мин, после чего высевали в поле.

Выживаемость определяли по числу растений Мь давших урожай. Наследуемость проявившихся в М! и М2 хлорофилльных мутаций проверяли в последующих генерациях. Для этого проводили реципрокные

скрещивания хлорофилльных мутантов с растениями исходной сортовой популяции. Частоту мутаций определяли как по числу семей М2 с хлорофилльными мутациями, так и по числу мутантов М2.

Размноженные в последующих генерациях пестролистные растения стали родоначальниками генетических линий и получили обозначение Уаг. Внеядер-ные мутации сМоппа в свою очередь были классифицированы как еп:сМогта, ядерные — п:сЫоппа.

Содержание хлорофиллов в листьях растений определяли по методу [2]. Электронно-микроскопическое исследование ультраструктуры пластид проводили по методике, описанной ранее в [3].

Результаты и их обсуждение

Показано [4], что в результате действия НММ на подсолнечник в М! проявляются торможение роста растений, снижение • их выживаемости, повышение стерильности, увеличение длины вегетационного периода, появление пестролистных растений. Угнетающее действие НММ на рост и развитие подсолнечника начинает сказываться с концентрации мутагена

0,02% при времени обработки 24 ч. Выживаемость растений в этом случае ниже 50 %.

В предварительном опыте показано, что наиболее эффективное время обработки семян горчицы НММ (0,01%) ДЛЯ получения пестролистных форм В М! составляет 12 ч (табл. 1).

При 18-часовой обработке семян НММ наблюдали большое количество пестролистных растений, однако подавляющее число из них вследствие торможения роста и повышенной стерильности не формировало жизнеспособных семян. В последующих опытах мы использовали для семян горчицы время обработки НММ - 12 ч.

Таблица 1

Выживаемость и частота пестролистных растений М( в зависимости от времени обработки семян

Время обработки НММ, ч Выживаемость, % Кол-во пестролистных, %

8 95,1 3,4

12 96,0 7,6

18 77,3 5,6

В табл. 2 приведены показатели выживаемости и частоты пестролистных растений в зависимости от концентрации НММ. При увеличении концентрации НММ до 0,03 % наблюдается резкое уменьшение выживаемости растений, однако она остается выше 50%.

Частота пестролистности в М1 растет с увеличением концентрации мутагена. Однако если у подсолнечника в М1 мы отмечали пестролистные формы с частотой 81,4% при концентрации НММ 0,02%, то у горчицы даже при концентрации 0,03 % частота пестролистности не превышало 56,1 %.

Наивысшая частота хлорофилльных мутаций -48,8 % по числу семей М2 с наследственными изменениями (табл. 3) и 5,48 % хлорофилльных мутантов (табл. 4) получена при действии мутагена в концентрации 0,03 %. Следует подчеркнуть, что такой высокий процент мутаций был связан с существенным торможением роста, снижением выживаемости и увеличением стерильности растений М1.

Спектр хлорофилльных мутаций довольно узкий (табл. 4). Подавляющее число хлорофилльных аномалий приходится на пестролистные формы. Однако в отличие от предыдущего опыта на подсолнечнике, где было индуцировано 0,84 % летальных мутаций хагиИа, на горчице этот тип мутаций мы не обнаружили. Зато действие мутагена в концентрации 0,02 и 0,03 % вызвало летальные мутации Шгеясет (растения с зелеными семядолями и белой первой парой настоящих листьев).

Пестролистные формы горчицы на протяжении ряда лет расщеплялись в потомстве на 3 типа проростков: зеленые, пестрые и белые (летальные) (Табл. 5). Аналогичное соматическое расщепление мы наблюдали и для пестролистных форм подсолнечника [5]. Интересно отметить, что если у горчицы доля му-

Таблица 2

Выживаемость и частота появления пестролистных растений горчицы в М! в зависимости

Таблица 3 Количество семей горчицы в М2

Концентра- Выжи- Количество пестроли-

ция НММ, % ваемость, стных растений

% Абсол. %

Контроль 93,3 — —

0,01 96,0 11 7,6±2,2

0,02 71,3 37 34,6±4,59

0,03 54,7 46 56,1+5,48

Концен- трация НММ Кол-во семей М2 Кол-во семей М2 с мутациями

Абсол. %

Контроль 140 0 0

0,01% 144 13 9,0±2,38

0,02% 107 31 29,0±4,39

0,03% 82 40 48,8±5,52

Таблица 4

Частота и спектр хлорофилльных мутаций горчицы в зависимости от концентрации НММ

Концентрация, % Кол-во растений М2 Количество мутаций, %

albina lutescens chlorina Variegation Всего

Контроль 7682 0 0 0 0 0

0,01 4967 0,12±0,05 0 0,04±0,03 0,95±0,14 1,11±0,15

0,02 3453 0,96±0,16 0,09+0,05 0,17+0,07 2,11 ±0,24 3,33±0,31

0,03 3013 1,69±0,23 0,40+0,11 0,60+0,14 2,79±0,30 5,48±0,41

тантных растений при расщеплении составляет только 11,7-17,1 %, то у подсолнечника эта частота варьирует от 40 до 52,6 %.

Результаты реципрокных скрещиваний пестролистных форм с зелеными растениями исходной сортовой популяции горчицы Донская-5 приведены в табл. 6. Генетический анализ поколения Р1 выявил однородительское материнское наследование мутантного признака. В том случае, когда пестролистную форму опыляли пыльцой зеленого растения, гибридное потомство р1 расщеплялось как и при самоопылении. При возвратном скрещивании все потомство было зеленым и не расщеплялось в последующих поколениях. '

Второй по численности группой жизнеспособных хлорофилльных мутаций у горчицы, как и у подсолнечника, были мутации сЫогта. Две из них (сЫогта-

1, сЫогта-2) оказались ядерными, так как при реципрокных скрещиваниях с зелеными растениями в Р\ независимо от направления - скрещивания все растения были зелеными. В Р2 мутант п:сЫоппа-1 расщеплялся на 62 зеленых и 18 мутантных растения (X2 = 0,14), а п:сЫогта-2 -на 37 зеленых и 7 сЫогта (X2 = 1,93). Значительный дефицит мутантных растений Р2 во втором случае связан с резко пониженной жизнеспособностью мутанта п:сЫоппа-2.

Остальные 4 мутации сЫог'та на основании результатов реципрокных скрещиваний с растениями сорта Донская-5 отнесены к внеядер-ным мутациям (табл. 7). Если в скрещиваниях с мутантами материнским растением служила исходная форма Донская-5, в ^ всегда наблюдали только зеленые растения.

При возвратном скрещивании в Fl происходило расщепление на зеленые и мутантные растения. Зеленые растения в свою очередь также расщеплялись при самоопылении на зеленые и мутантные формы в соотношениях, сходных с приведенными в табл. 7.

Очевидно, что индуцированные НММ хлорофилльные мутанты горчицы характе-

Таблица 7

Расщепление реципрокных гибридов от

ризуются прежде всего сниженным содержанием зеленых пигментов. Степень этого снижения зависит от фенотипа мутации (табл. 8).

Визуально по цвету мутантной листовой ткани хлорофилльные мутанты можно разделить на 4 группы, Пестролистные формы с белыми участками содержат лишь следы зеленых пигментов (0,29±0,03-мг/г), в желтых секторах содержание хлорофиллов несколько выше (0,46±0,03 мг/г). В желто-зеленых участках пестрых растений оно достигает примерно половинного количества (6,50±0,15 мг/г) от содержания их у зеленых растений сортовой популяции, что, однако, не устраняет летальности. В зеленых участках пестролистных растений содержание пигментов не уступает контролю или даже несколько превосходит его. У жизнеспособных мутантов сЫогта количество хлорофиллов колеблется от 61 % у мутанта тсЫоппа-2 до 82 % у еп:сЫогта-б.

Для пластид в мутантных тканях характерны глу-

Таблица 5

Год наблю- дения Кол-в о изученных семей Кол-во растений в потомстве Кол-во мутантных растений, %

Зеленые Пестрые Белые (желтые)

1989 22 1936 295 57 15,4+0,75

1990 22 8687 1579 207 17,1±0,37

1991 22 12709 1867 236 14,2±0,29

1994 22 17223 2019 272 11,7±0,23

Таблица 6

Расщепление в потомстве реципрокных гибридов

Год опы- та Направление скрещивания Кол-во растений в Fi Кол-во мутантных растений, %

Зеленых Пестрых Белых (желтых)

1990 Пестрое х зеленое 612 72 12 12,1±1,24

Зеленое х пестрое 301 0 0 0

1991 Пестрое х зеленое 482 60 8 12,4±1,40

Зеленое х пестрое 230 ' 0 0 0

Таблица 8

Содержание хлорофиллов в листьях мутантов

Вид скрещивания Кол-во растений

Зеленые Chlorina

Еп:сЫ-Ъ х Донская-5 41 9

Донская-5 х eti:chl- 3 '71 —

En:chlA х Донская-5 31 22

Донская-5 х en:chl-4 29 —

En:chl-5 х Донская-5 34 43

Донская-5 х en:chl-5 46 -

En:chl-6 х Донская-5 50 17

Донская-5 X en:chl-6 41 -

Линия Фенотип ткани Содержание хлорофилла а+Ь, мг/г сырой массы

мг/г %

Донская-5 Зеленый 13,76±0,20 100

Var-8 Белый 0,29±0,03 2,1

Зеленый 14,77±0,11 107,34

Var-1 Желтый 0,46±0,03 3,34

Зеленый 13,82±0,16 100,44

Var-15 Желто-зеленый 6,50±0,15 47,24

Зеленый 12,91±0,18 93,82

n:chlorina-2 Зелено-желтый 8,39±0,12 60,97

en:chlorina Зелено-желтый 11,30±0,17 82,12

бокие изменения ультраструктуры [6]. Внутреннее строение хлоропластов зеленых растений горчицы сорта Донская-5 сходно с таковым для других высших растений. Хлоропласты овальной формы имеют хорошо развитую мембранную систему, представленную тилакоидами стромы и тилакоидами гран. Тила-коидная система занимает все внутреннее пространство хлоропласта, что свидетельствует о его высокой функциональной активности. Отмечено большое количество органельных рибосом. Встречаются довольно крупные крахмальные зерна, а также осмиофиль-ные пластоглобулы.

В белых участках листовой ткани (линия Уаг-8) пластиды тилакоидной системы не содержат. Митохондрии малочисленны, кристы в них слабо выражены. Только некоторые пластиды из желтых тканей (линия Уаг-1) содержат мембранный комплекс, представленный редкими тилакоидами гран и стромы. Митохондрии в этих участках крупные, с набухшими кристами. Ультраструктура пластид желто-зеленых участков листа также отличается от таковой у зеленых растений. Так, количество ламелл в многочисленных гранах значительно меньше, чем в норме, зато увеличивается число тилакоидов стромы. Митохондрии более крупные, чем у контрольных растений и плотно прилегают к пластидам. Таким образом, для мутантных пластид горчицы в зависимости от типа мутации и содержания зеленых пигментов характерна. различная степень повреждения структуры внутренней мембранной системы.

В заключение следует подчеркнуть результаты сравнительного анализа индуцированных НММ хло-рофилльных мутаций у двух представителей масличных культур - подсолнечника и горчицы. Во-первых, если у подсолнечника в М1 максимально было получено 81,4 % пестролистных форм при концентрации НММ 0,02 %, то у горчицы только 56,1 % при концентрации мутагена 0,03 %.Частота хлорофилльных мутаций у горчицы в М2 по сравнению с подсолнечником была также ниже. Следовательно, подсолнечник оказался более чувствительным видом к мутагенному действию НММ.

Во-вторых, спектр хлорофилльных мутаций у горчицы несколько отличается от такового у подсолнечника. У горчицы отсутствовали летальные мутации хатка, зато появились с небольшой частотой мутации 1ше$епсе. Так же как и у подсолнечника, подавляю-

Научно-иселедовательский институт биологии РГУ_________

щее число хлорофилльных мутаций горчицы приходится на пестролистные формы. Однако жизнеспособность и фертильность этих мутантов по сравнению с таковыми подсолнечника очень низка. В связи с этим генетический анализ мы провели только у 22 растений. Все они имели неядерный тип наследования индуцированной пестролистности. У мутантов chlorina горчицы генетический анализ нам удалось провести только у 6 растений. В отличие от подсолнечника, где было выделено 8 строго внеядерных мутаций данного типа, у горчицы мы выделили только 4 жизнеспособных мутации пластидно-ядерной природы: en:chlorina-3, en:chlorina-4 при концентрации НММ 0,01 %, en:chlorina-5 при 0,02 % НММ и en:chlorina-6 при 0,03 % НММ. Так же были получены две жизнеспособные мутации chlorina ядерной природы (рецессивный тип наследования мутантного признака) - n:chlorina-l при 0,02% НММ и n:chlorina-2 при 0,03 % НММ.

Таким образом, результаты по индукции НММ внеядерных хлорофилльных мутаций у горчицы, подсолнечника [7, 8], а также и на других видах растений [9, 10] свидетельствуют о эффективном и избирательном действии НММ на пластом высших растений.

Литература

1. Белецкий ЮД Искусственные мутации хлоропластов у высших растений. Ростов н/Д, 1989.

2. Гавршенко В Ф и др. Большой практикум по физиологии растений. М., 1975.

3. Белецкий ЮД и др. II Цитология и генетика. 1981. Т. 15. № 1.С. 34-37.

4. Белецкий ЮД. и др. // Цитология и генетика. 1969. Т. 3. №5. С. 421-425.

5. Разорителева Е.К. и др. // Генетические коллекции растений / Под. ред С.Ф. Коваля. Вып. 3. Новосибирск, 1995. С. 197-216

6. Федоренко Г.М. и др. И Генетика. 1995. Т. 31. № 4. С. 504-509.

7. Разорителева Е К. и др. II Генетика. 1970. Т. 6. № 8. С. 102-107.

8. Разорителева ЕК. и др. II Генетика. 1970. Т. 6. № 10. С. 43-48.

9. Hagemann R. И Stadler Symp. Columbia, 1979. Vol. 11. P. 91-116.

10. Walters T. et al. IIJ. Heredity. 1990. Vol. 81. № 3. P. 214-216.

______________________________________14 марта 2003 г.