CC BY
44
УДК 581.1
ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ И ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПРИЗНАКА СКРЫТОЙ МОЗАИЧНОСТИ ЛИСТЬЕВ РАСТЕНИЙ
© 2008 г. В.С. Лысенко
Педагогический институт Pedagogical Institute
Южного федерального университета of Southern Federal University
344042, г. Ростов-на-Дону, пер. Днепровский, 116, 344042 Rostov-on-Don, Dneprovskaya St., 116,
vl_lysenko @mail. ru vl_lysenko @mail. ru
Исследована дифференциальная экстрагируемость хлорофилла листьев 13 декоративных и дикорастущих видов растений, а также 9 пластомных линий и гибридов подсолнечника. В ряде случаев обнаружено ранее не известное явление скрытой мозаичности листьев. Высказывается предположение о пластомной природе скрытой мозаичности и обсуждается возможная связь дифференциальной экстрагируе-мости листьев с солеустойчивостью растений.
Ключевые слова: скрытая мозаичность, экстрагируемость хлорофилла, солеустойчивость, подсолнечник, пластомные мутации, линии Chlorina.
Differential leaf chlorophyll extracting ability of 13 decorative and 2 wild plant species was investigated as well as 9 plastome sunflower lines and hybrids. In a number of cases an unknown phenomenon of a leaf hidden mosaicism was revealed which is expressed as a irregular yellow-green coloration after 80%-acetone extraction. The trait can be detected from the daughter line obtained using N-nitrosomethylurea - inductor of plastome mutations whereas if it didn't reveals from the parental lines. Hybridization of normal with mutant on this basis line resulted in a maternal inheritance. The plastome origin of hidden mosaicism is assumed in regard to its possible relationship with plant salt tolerance.
Keywords: hidden mosaicism, extracting ability of chlorophyll, salt tolerance, sunflower, plastome mutants, Chlorina lines.
Вопрос о взаимосвязи параметров пигментации листьев с процессами адаптации растений к засолению почвы рассматривался рядом исследователей, начиная с 40-х гг. прошлого столетия. Помимо многочисленных данных о изменении содержания хлорофилла в листьях в ответ на засоление, в этот период были получены весьма интересные результаты иссле-
дований экстрагируемости хлорофилла листьев гало-фитов и гликофитов водно-ацетоновыми растворами при различных концентрациях засоляющих катионов и анионов.
Так, извлечение хлорофилла 60%-м ацетоном из листьев растений, не отличающихся высокой соле-устойчивостью, происходило более полно, если они
произрастали на засоленной почве [1]. В то же время экстрагируемость хлорофилла листьев галофитного растения - сахарной свеклы - возрастала с увеличением степени засоления [2].
Общий уровень представлений о механизмах фотосинтеза, существовавший в середине прошлого века, позволил исследователям интерпретировать феномен различной экстрагируемости хлорофилла лишь как следствие изменений характера хлорофилл-белковых взаимодействий [1]. Механизм таких изменений, их последствия и альтернативные объяснения не рассматривались и не могли быть рассмотрены в тот период развития физиологической науки.
В настоящее время очевидно, что увеличение или уменьшение прочности связи хлорофилл-белок, если это действительно имеет место, скорее всего приведет к глубоким изменениям таких тонких процессов, как работа ССК I и II, обеспечивающих захват и передачу энергии квантов света в реакционные центры соответствующих фотосистем. Доминирующие представления о способе передачи энергии здесь сводятся к межмолекулярным диполь-дипольным взаимодействиям пигментов [3], причем с высокой вероятностью эти взаимодействия могут быть существенно модифицированы ассоциированными белковыми молекулами, хотя бы за счет зарядового экранирования.
При рассмотрении причин различной экстрагируе-мости хлорофилла листьев растений, на наш взгляд, нельзя игнорировать также и то обстоятельство, что молекулы пигментов ССК находятся в липидном бис-лое мембраны тилакоида. Физиологическая роль температурной точки фазового перехода липидного бислоя мембран обсуждалась неоднократно [4 - 6]. В обычных условиях латерального разделения фаз следует ожидать неодинаковой растворимости полярных липидов «жидкой» и «твердой» составляющей мембраны, в особенности в высокополярных растворителях, таких как водно-ацетоновые смеси. Соответственно, следует ожидать и неодинаковой экстрагируемости молекул хлорофилла, определяемой тем, встроены ли они в «жидкую» или «твердую» фазу бислоя. Учитывая хорошо известные факты взаимозависимости температурных характеристик фазового перехода бислоя (а, следовательно, и соотношения фаз) от самых разных физиологических процессов, вполне логично предположить, что и физиологические последствия засоления почвы также способны влиять на экстрагируе-мость хлорофилла листьев.
Из вышесказанного также следует и то, что изменения в экстрагируемости хлорофилла листьев могут быть сопряжены с уровнем фотосинтетической продукции растения. Ранее нами было высказано предположение о фотозависимом характере формирования хлоридно-натриевой солеустойчивости у некоторых сортов и линий подсолнечника [6]. Это предположение сводится к следующему механизму: снижение уровня фотосинтетически продуцируемых НАДФН и АТФ приводит к зависимому снижению уровня деса-турации мембранных липидов, соответствующему увеличению температурной точки фазового перехода мембраны, которое, в свою очередь, может изменять проницаемость клеточных мембран для хлорид-ионов. В этой связи неудивительны старые данные
В.А. Новикова [7] о том, что снижение освещенности растений хлопчатника приводит к увеличению их со-леустойчивости. Аналогичные результаты были получены нами на подсолнечнике [8].
Ранее нами были получены экспериментальные подтверждения такого механизма, основанные на изучении солеустойчивости сортов подсолнечника, отличающихся жирнокислотным составом запасных и мембранных липидов, характером поступления в растения радиоактивного хлорид-иона (36С1) и тритиевой воды (Т2О). Другим подтверждением фотозависимого характера формирования солеустойчивости подсолнечника по вышеприведенной схеме было обнаружение солеустойчивости у некоторых пластомных му-тантных линий Chlorina [9], полученных при обработке семян М-нитрозометилмочевиной и отличающихся сниженным (до 30-40 % от нормы) содержанием хлорофилла в листьях [10].
Характерно, что М-нитрозометилмочевина, вызывая преимущественно мутации ДНК хлоропластов, сопровождающиеся обычно теми или иными функциональными нарушениями в этих органеллах, при обработке семян подсолнечника может дать до 23 % солеустойчивых форм в М1 [11].
Как известно, пластомные мутации растений приводят к появлению в первых поколениях признака мозаичности листьев - обычно это желтые пятна на зеленом фоне, возникающие в результате рассортировки мутантных (лишенных хлорофилла) хлоропла-стов по разным клеточным пулам [10]. Однако в связи с этим возникает вопрос, могут ли существовать пла-стомные мутации, приводящие не к полной или частичной потере хлоропластами хлорофилла, а к нарушению его функциональных физико-химических взаимодействий с компонентами мембраны тилакои-дов? Иными словами, существуют ли пластомные мутации, приводящие к появлению скрытой мозаич-ности листьев?
Объекты и методы
Цельные листья или их крупные фрагменты помещали в колбы с водно-ацетоновой смесью из расчета по массе: 1 часть сырых листьев + 1 часть воды + 8 частей ацетона. Экстрагировали 8-10 ч при температуре 25 °С, после чего растворитель сливали и экстрагировали повторно 80%-м ацетоном в течение 1 ч. Изучали окраску экстрагированных листьев. В процессе обработки мозаичность четко выявляется уже через 2-3 ч экстракции, причем хлорофилл остаточных мозаичных пятен далее также может быть экстрагирован используемой водно-ацетоновой смесью, однако на это требуется большее время - от 20 до 48 ч. Отсюда вывод об отсутствии мозаичности, если таковая не обнаруживалась ни на одном этапе 48-часовой экстракции.
В исследованиях использовали 9 видов декоративных растений и 2 вида сельскохозяйственных культур. Изучали не менее 5 экземпляров растений одного вида, по 8-10 листьев с каждого.
Отдельно исследовались линии подсолнечника Chlorina, полученные в НИИ биологии ЮФУ. Пластомные линии en;Chlorina-3 (1-138), en;Chlorina-5 (2-25), en;Chlorina-7 (2-43) и ядерная линия
Таблица 1
Скрытая мозаичность некоторых высших растений, выявляемая после экстракции 80%-м ацетоном
№ Вид Наличие и локализация пятен Интенсивность окраски пятен Фон или общая окраска
1 Фуксия гибридная Fuchia hybridica hort. Пятна неоп. Формы Зеленые Белый
2 Традесканция белоцветковая Tradescantia Albiflora kunth. Отсутствуют -/- Зеленая
3 Хлорофитум хохлатый Chlorophitum Commosum bak. Отсутствуют -/- Зеленая
4 Бальзамин султанский Impatiens sultani hook. Пятна неоп. формы Св.-зелен. Белый
5 Циссус антарктический Cissus antarctica vent. Отсутствуют -/- Зеленая
6 Пеларгония зональная Pelarginium zonale l. Отсутствуют -/- Белый
7 Бегония Фиста Begonia feastii hort. Отсутствуют -/- Св.-розовая
8 Гибискус Hibiscus Rosa-cinensis L. Пятна неоп. формы Св.-зелен. Белый
9 Огурец Cucumus sativus L. Пятна жилкования Зеленые Белый
10 Томат Lucopersicon Esculentum Mill. Отсутствуют -/- Белый
11 Сцинадапсус Scinadapsus sp. Пятна неоп. формы Св.-зелен. Белый
12 Вяз Ulmus laevis Pall. Отсутствуют -/- Зеленый
13 Шелковица черная Morus nigra L. Пятна неопред. формы Темно-зел. и желтые Св.-зелен.
n;Chlorina-5 получены непосредственно из нормальной зеленой линии 3629. Ревертант R;en;Chlorina-3 (по признаку окраски) получен путем обработки семян линии en;Chlorina-3 нитрозометилмочевиной с последующим самоопылением в течение нескольких лет. Аналогично из линии en;Chlorina-7 получен зеленый ревертант N2 и несколько линий повторных мутантов MChl1 (мощная Chlorina), превосходящих по урожайности и вегетативной массе другие пластомные линии, в том числе 3629. Линия en;Chlorina-7 послужила также предшественником нескольким независимо полученным повторным мутантам 2, 3, 4, 5, а линия en;Chlorina-1 (1-49) - мутантной линии 1. Исследовались гибриды между этими мутантами, имевшие четко выраженный эффект гетерозиса, и, несмотря на сниженное содержание хлорофилла в листьях, не уступающие по урожайности и вегетативной массе обычным гибридам подсолнечника.
В процессе изучения линий подсолнечника экстракционной обработке подвергали третью пару (сверху) настоящих листьев, отбираемых в интервале с 10.00 до 11.00, в 1-й декаде июня. Отдельные дополнительные образцы отбирали с 17.00 до 18.00.
Результаты и их обсуждение
Результаты исследований по выявлению скрытой мозаичности в листьях различных видов растений в естественных популяциях и агрокультуре показали большое разнообразие проявлений этого признака (табл. 1). Выявлено 5 типов окраски листьев после экстракции ацетоном:
1) зеленая, по интенсивности мало отличающаяся от окраски интактного растения;
2) светло-зеленая - равномерная, но значительно уступающая по интенсивности окраски ин-тактному растению;
3) интенсивно зеленые пятна, резко очерченные на белом или светло-желтом фоне;
4) светло-зеленые пятна, резко очерченные на белом или светло-желтом фоне;
5) темно-зеленые и желтые пятна на светло-зеленом фоне.
Как зеленая, так и светло-зеленая мозаичность выявлялась в двух формах: а) пятна неопределенной локализации; б) пятна жилкования, т.е. пятна, локализованные вдоль сосудистых пучков и оконтуривающие эти пучки.
Интенсивные зеленые пятна неопределенной формы выявлялись у одного вида растения: фуксии гибридной Fuchia hibrida hort.
Пятна жилкования выявлены у огурца Cucumus sativus L.
Светло-зеленые пятна также встречались редко и были обнаружены нами у трех видов: бальзамина султанского Impatiens sultani Hook, гибискуса Hibiscus rosa-cinensis L, сцинадапсуса Scinadapsus sp.
Уникальная мозаичность, образованная пятнами двух типов - с низкой (желтые) и высокой интенсивностью окраски (темно-зеленые) на фоне со средней интенсивностью окраски (светло-зеленый) обнаружена у шелковицы черной Morus nigra L. (рис. 1), причем интенсивно окрашенные пятна выявляются только после высушивания листа, что может свидетельствовать не столько о локальных различиях в содержании хлорофилла, сколько о неоднородных оптических свойствах листовой пластинки.
Остальные виды (табл. 1) после экстракции ацетоном имели равномерную зеленую окраску - 4 вида и белую (либо светло-желтую) - 3 вида.
Таким образом, скрытая мозаичность - широко распространенное явление среди природных популяций высших растений.
Дальнейшие исследования скрытой мозаичности, проведенные на подсолнечнике, показали (табл. 2), что исходная нормальная зеленая линия 3629 после экстрагирования ацетоном имеет интенсивную равномерную зеленую окраску листьев.
Рис. 1. Скрытая мозаичность листовой пластинки Morus nigra L., выявляемая в результате экстракции 80%-м ацетоном
Пластомная мутантная линия 2-43, характеризующаяся светло-зеленой окраской интактных листьев, не имеет скрытых пятен. Окраска ее листьев после экстракции ацетоном напоминает 3629. Повторная пластомная мутантная линия MChl5, полученная из линии 2-43, обнаруживает после экстракции ацетоном небольшие зеленые пятна неопределенной формы на желтом фоне. В данном случае, по-видимому, причиной появления скрытой мозаичности является мутация ДНК хлоропластов. У пластомной мутантной линии MChl7 (получена из 2-43) обнаруживаются аналогичные зеленые пятна, но больших размеров.
В то же время нормальный зеленый ревертант N2, полученный из линии 2-43 и не несущий пластомных мутантных генов, не имеет скрытой мозаичности.
Нами исследованы также две другие пластомные мутантные линии, имеющие светло-зеленую окраску интактных листьев, - 2" и 4" (табл. 2). Из них только линия 2" несет признак
ции.
Обработка листьев шелковицы черной Morus nigra L. (солеустойчивое растение) реактивом J2 - KJ показала наличие мозаичности распределения крахмала. На рис. 2 слева представлен лист после экстракции ацетоном; справа - этот же лист после полной экстракции этанолом (удаление зеленых пятен) и последующей обработки J2 - KJ. Как видно из рис. 2, локализация полученных интенсивно окрашенных (зеленых) пятен не совпадает точно с мозаичностью окраски иод-крахмального комплекса (на светлом фоне), однако, более плотно окрашенные, темные зоны остаточного хлорофилла с (рис. 2 - слева) явно приурочены к зонам с пониженным содержанием крахмала. Более того, отдельные экземпляры листьев (с высокой экспозицией) Morus nigra L. в условиях эксперимента после ацетоновой экстракции оставались равномерно темно-зелеными и вообще не окрашивались J2- KJ. Вероятно, локальное снижение экстрагируемости хлорофилла листьев обусловливает нарушение распределения в них крахмала.
Рис. 2. Скрытая мозаичность листа Morus nigra L. после экстракции 80%-м ацетоном (слева) и окраска, выявляемая у этого же листа после полного удаления хлорофилла и обработки реактивом J2 - KJ (справа)
Существует 3 возможности интерпретировать наблюдаемый феномен:
1. Скрытая мозаичность листьев не имеет адаптационного значения. Являясь следствием пластомной
скрытой мозаичности. При их скрещивании гибрид несет скрытую моза-ичность только в том случае, если линия 2" была материнской.
Время отбора листьев (периоды с 10.00 до 11.00 и с 17.00 до 18.00) не влияло на характер проявления признака.
Сам по себе характер проявления признака скрытой мозаичности подсолнечника (пятна неопределенной формы) и его наследование по материнской линии свидетельствует в пользу пла-стомной природы мута-
Таблица 2
Скрытая мозаичность листьев пластомных мутантных линий подсолнечника, выявляемая после экстракции 80%-м ацетоном
Линия Исходная Окраска Наличие Интенсивность Фон или
линия интактных и локализация окраски общая
листьев скрытых пятен пятен окраска
3629 Сорт «Маяк» Зеленая Отсутствуют -/- зеленая
2-43 3629 Св.-зеленая Отсутствуют Зеленая
MChll 2-43 Св.-зеленая Неопред. формы, небольшие Зеленые Желтый
MChl5 2-43 Св.-зеленая Неопред. формы, небольшие Желтые Св.- зеленая
MChll 2-43 Св.-зеленая Неопред. формы Зеленые Желтый
Ревертант 2-43 Зеленая Отсутствуют Зеленый
N2
N 2' 2-43 Св.-зеленая Неопред. формы -/- Желтый
N 4' 2-43 Св.-зеленая Отсутствуют -/- Зеленый
Гибрид 2', 4' Св.-зеленая Неопред. формы Зеленые Желтый
мутации, она приводит к нарушениям хлорофилл-белковых или хлорофилл-липидных взаимодействий, и, как следствие, появлению мозаицизма по уровню фотосинтетической активности.
2. Отсутствие накоплений крахмала в локально обособленных зонах листовой пластинки не является следствием снижения фотосинтетической активности, а отражает лишь функциональный переход от накопления крахмала к прямому выделению водорастворимых сахаров в качестве фотосинтетических продуктов. Смысл этого может заключаться в переходе клеток к более высокой осмотической защищенности.
3. Локальные зоны листовой пластинки, характеризующиеся нарушением экстрагируемости хлорофилла, менее эффективны с точки зрения фотосинтетической продуктивности. Вследствие этого выработка АТФ и восстановленного НАДФН падает, солеустой-чивость увеличивается.
В то же время очевидно, что признак скрытой мо-заичности листьев, даже если он действительно имеет адаптивное значение в развитии солеустойчивости, нельзя считать характерным атрибутом галофитов.
Выбор между тремя предполагаемыми вариантами интерпретации обнаруженного явления требует дальнейших исследований.
Литература
1. ШаховА.А. Солеустойчивость растений. М., 1956.
Поступила в редакцию_
2. Марголина К.П. Предпосевное повышение солеустой-чивости сахарной свеклы // Тр. Ин-та физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН СССР. 1950. Т. 7. Вып. 1. С. 160165.
3. Гавриленко В.Ф. и др. Избранные главы физиологии растений. М., 1986.
4. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. М., 1982.
5. Ноулс П.Ф. Мембраны и липопротеины // Общая органическая химия: В 12 т. Т. 11. М., 1996. С. 107-125.
6. Лысенко В.С. Механизм формирования хлоридно-натриевой солеустойчивости у подсолнечника // Науч. -техн. бюл. ВНИИМК. Краснодар, 1991. Т. 113. Вып. 2. С. 3-7.
7. Новиков В.А. Влияние интенсивности света на соле-устойчивость хлопчатника // Тр. ин-та физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН СССР. 1949. Т. 6. С. 85.
8. Лысенко В.С., Ефименко С.Г. Накопление засоляющих ионов и рост подсолнечника в условиях ограниченной освещенности // Масличные культуры. 2007. Вып. 1. С. 20-25.
9. Шевякова Н.И. Солеустойчивость пластомных хлоро-фильных мутантов подсолнечника // Физиология растений. 1982. Т. 29. Вып. 2. С. 317-324.
10. Белецкий Ю.Д. Искусственные мутации хлоропластов у высших растений. Ростов н/Д, 1989.
11. Разорителева Е.К., Усатов А.В., Машкина Е.В. Галоре-зистентные формы подсолнечника, индуцированные N нитрозо-Ы-метилмочевиной // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2004. № 1. С. 67-69.
10 октября 2007 г.
