CC BY
29
УДК 575.24. 575.111
ВЛИЯНИЕ ВНЕЯДЕРНЫХ МУТАЦИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ К ЭКСТРЕМАЛЬНЫМ ФАКТОРАМ
ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
© 2004 г. А. В. Усатов, Е.В. Машкина, В. А Даниленко, Н.С. Колоколова
Plant resistance to heat shock and high pressure of oxygen was investigated. The various genetic lines of sunflower from Research institute of biology collection of chlorophyll mutants were used. Plastid mutants have revealed resistance to heat shock and oxidative stress in comparison with initial inbred line 3629 and a nuclear mutant.
Ответная реакция организма на действие экстремальных факторов складывается из двух составляющих
- первичной стрессорной реакции, направленной на снижение негативных последствий внешнего воздействия, и долговременной адаптации, которая обеспечивает жизнедеятельность клеток на фоне действия экстремальных факторов [1]. Известно, что устойчивость организма к экстремальным воздействиям определяется его генотипом. Резистентность к неблагоприятным воздействиям контролируется как ядерными, так и цитоплазматическими генами. В литературе описаны пластидные мутанты хламидомонады, устойчивые к антибиотикам, температурно-чувствительные и солеустойчивые мутанты высших растений [2 - 4]. Цель данной работы - исследование роли внеядерных генетических детерминант в устойчивости растений подсолнечника к температурному (ТС) и окислительному стрессам.
Материал и методы исследования
Для определения роли ядра и цитоплазматических генов в устойчивости растений к внешним стрессовым воздействиям из коллекционного материала хло-рофилльных мутантов подсолнечника НИИ биологии РГУ были отобраны следующие линии: исходная ин-бредная линия 3629 и полученные на ее основе мутантные линии: ядерный мутант п:сЬ1оппа-1, пла-стомные мутанты еп:сЫоппа-3, еп:сЫоппа-5,
еп:сЫоппа-6, еп:сЫоппа-7. На генетической основе пластомного мутанта еп:сЫоппа-7 были получены частичный ревертант рг6-еп:сЫоппа-7 с измененной структурой как хпДНК, так и мтДНК и полный ревертант г-еп:сЫоппа-7. Истинная реверсия у полного ре-вертанта вызвала восстановление содержания хлорофиллов и морфологических признаков до контрольного уровня растений 3629. У частичного ревертанта при сохранении мутантной окраски листьев растений еп:сЫоппа-7 восстановились некоторые показатели габитуса [5]. В качестве внешнего контроля в работе был использован районированный в Ростовской области сорт Донской-99, любезно предоставленный нам автором сорта проф. Ф.И. Горбаченко (Донская опытная станция масличных культур им. Л. Жданова ВНИИ МК). Семена подсолнечника изучаемых линий обрабатывали повышенной температурой (45 оС) в
течение первых 6 ч прорастания; окислительный стресс моделировали гипербарической оксигенацией (ГБО) (0,7 МПа в течение первых 4 ч прорастания семян). Модельные эксперименты проводили на корневой апикальной меристеме проростков. Сразу после воздействия по высоте быстрой вспышки люми-нол-зависимой хемилюминесценции определяли интенсивность свободнорадикальных реакций, а также активность ключевых антиоксидантных ферментов -супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Для биохимических анализов готовили гомогенаты в 1/15М фосфатном буфере рН 7,8. Соотношение среды гомогенизации и массы растительного материала составляло 10:1 (объем: масса). Активность ферментов
определяли в супернатанте после центрифугирования гомогената (500 г, 10 мин), СОД - с использованием нитросинего тетразолия [6], каталазы - по методу Ко-ролюка с соавторами [7]. Активность ферментов рассчитывали на белок, концентрацию которого определяли по методу Lowry [8]. В таблицах и графиках представлены средние арифметические 7 - 8 повторностей и их стандартные ошибки. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента.
Обработанные и контрольные проростки высевали в поле в оптимальные сроки по типу селекционного питомника на 10-метровых делянках с площадью питания 40 х 60 см. В качестве критериев устойчивости в полевых опытах использовали всхожесть проростков и высоту растений на стадии развития 3, 4-й пары листьев.
Результаты и их обсуждение
Неспецифическим ответом организма на действие внешних экстремальных факторов является развитие стресс-реакции. Пусковым механизмом стресса может выступать нарушение динамического равновесия в системе прооксиданты - антиоксиданты, приводящее к активации процессов перекисного окисления липидов [7 - 12]. В связи с этим для оценки окислительного напряжения в тканях проростков подсолнечника после действия ТС и ГБО был проведен модельный эксперимент. Обнаружено, что воздействие высокой температуры и повышенного давления кислорода в
ранних этапах вегетации.
Таблица 1
Активность антиоксидантных ферментов - каталазы, ед/мг белка (числитель), и СОД, ед/мг белка (знаменатель), в корневой меристеме проростков подсолнечника
Линия Контроль ГБО 6 ати (0-4ч) 45оС (0-6ч)
Каталаза СОД Каталаза СОД Каталаза СОД
3629 4,8±0,62 30,1±6,94 7,9±0,39*** 11,3±2,53* 4,9±0,97 20,1±2,79
№сЫоппа-1 8,1±0,23+++ 9.9±0.49***++ 3,9±0,58***
15,3±3,13 23,1±4,6 + 9,1±1,29+++
Еп:сЫоппа-3 3.3±0.13+ 12,6±1,85+ 3.6±0.36+++ 12,0±2,13 3.3±0.23 11,0±1,37++
Еп:сЫоппа-5 4.0±0.79 13,5±2,53+ 7.9±0.05*** 16,6±2,56 5.6±0.22* 10,8±2,93+
Еп:сЫоппа-6 5,1±0,3 6.0±0.11*+++ 9.3±0.06*** +++
15,5±6,35 10,2±2,49 12,6±2,85
Еп:сЫоппа-7 4,7±0,27 12,6±1,92+ 6,6±0,46***+ 9,9±1,91 6,1±1,34 9,4±2,02++
рг6-еп:сЫоппа-7 6,9±0,45 35,6±4,79 2,7±0,46***+++ 8,2±3,56*** 6,4±0,25 8,2±1,4***+++
г-еп:сЫогта-7 3.2±0.49+ 5.9±0.49***++ 10.7±0.21***+++
14,8±2,06+ 7,4±1,36** 6,9±0,39***+++
Сорт Донской 6,6±1,02 17,3±2,07 8,3±0,41 33,7±7,92*+ 6,5±0,29 14,2±4,43
Примечание. Достоверные отличия по сравнению с контролем при: * - р < 0,05 ; *** - р < 0,01; *** - р < 0,001. Достоверные отличия по сравнению с линией 3629 при: + - р < 0,05; ++ - р < 0,01; +++ - р < 0,001.
изученных режимах не влияли на интенсивность свободнорадикальных реакций в клетках корневой меристемы проростков. Высота быстрой вспышки люминолзависимой хемилюминесценции сразу после окончания действия стрессовых факторов оставалась на уровне контрольных значений. Межлинейных различий по данному показателю также не выявлено.
Поддержание исходного уровня свободнорадикальных реакций после действия экстремальных факторов может быть следствием стабильного функционирования антиоксидантных ферментов. Так, после ТС активность СОД в клетках пла-стомных мутантов еп:сЬ1оппа-3, еп:сЬ1оппа-5, еп:сЬ1огіпа-6, также как и сортовых растений, практически не изменялась. При этом активность каталазы в клетках данных линий либо не изменялась, либо повышалась по сравнению с контролем (табл. 1). У ядерного мутанта п:сЫоппа-1 происходило снижение активности как СОД, так и ката-лазы (на 40 и 50 % соответственно), а у полного ревертанта г-еп:сЫоппа-7 после действия ТС активность СОД снижалась на 54 %, а активность каталазы повышалась на 234 %. Таким образом, анализ активности СОД и каталазы в корневой меристеме проростков подсолнечника выявил различия между изучаемыми линиями, которые позволили предположить, что наиболее устойчивыми к действию ТС являются пластомные мутанты, а наименее - ядерный мутант.
После действия повышенного давления кислорода активность СОД была снижена у растений трех линий: 3629, рг6-еп:сЬ1огіпа-7, г-еп:сЫоппа-7 (на 63, 77 и 50 % соответственно), а у пластомных хлорофилльных мутантов оставалась на уровне контрольных значений. Активность каталазы у всех линий, за исключением частичного ревертанта рг6-еп:сЫоппа-7, после действия повышенного давления кислорода достоверно увеличивалась. Вероятно, повышение активности каталазы в данном случае носит компенсаторный характер, стабилизируя свободнорадикальные реакции на уровне контроля.
В дальнейшем обработанные и контрольные проростки подсолнечника были высажены в поле. Из табл. 2 видно, что действие повышенной температуры в первые часы прорастания у всех исследуемых линий, за исключением сорта Донской-99, снижало всхожесть проростков. Однако степень этого снижения у разных линий оказалась различной. Наибольшие значения получены для частичного ревертанта рг6-еп:сЫоппа-7 (всхожесть после ТС составила 51 % по сравнению с контролем) и 2 пластомных мутантов
- еп:сЫоппа-3, еп:сЫоппа-5 (35 и 29 % соответственно). Ядерный мутант п:сЫоппа-1 оказался наиболее чувствительным к температурному воздействию -единичные взошедшие растения были представлены только летальными формами и погибали на самых
Таблица 2
Всхожесть семян подсолнечника, обработанных на ранних этапах прорастания повышенной температурой или повышенным давлением кислорода, %
Линия Контроль ГБО 0,7 МПа (0-4 ч) 45оС (0-6 ч)
3629 85,3 69,3 * 13,3 ***
п:сЫоппа-1 73,3 57,3 1 3 ***
еп:сИогіпа-3 78,7 84 28,0 ***
еп:сИогіпа-5 78,7 69,3 22 7 ***
еп:сИогіпа-6 56,0 34,0 8,0 **
еп:сИогіпа-7 74,7 56,0 9 3 ***
рг6-еп:сЬ1огіпа-7 62,7 61,3 * ,0 2, 3
г-еп:сШогіпа-7 80 56,0 * 22 7 ***
Сорт Донской 89,3 78,7 81,3
Примечание. Условные обозначения те же, что и в табл. 1.
В то же время ГБО не влияла на всхожесть проростков хлорофилльных мутантов подсолнечника. Достоверное по сравнению с контролем снижение количества взошедших растений отмечено только для линии 3629 и полного ревертанта г-еп:сЫоппа-7 (табл. 2).
Анализ морфометрических характеристик контрольных растений и растений, обработанных на ранних стадиях прорастания семян, показал, что повышенная температура замедляет рост растений вплоть до стадии развития 3, 4-й пары листьев. Высота растений линии 3629 была снижена на 75 % по сравнению с контролем, а рост пластомных мутантов снизился только на 22 - 39 %. Если в контроле высота растений 3629 была достоверно выше по сравнению с хлоро-филльными мутантами, то после ТС рост пластомных мутантов на стадии 3, 4-й пары листьев превышал таковой у растений исходной линии 3629 (табл. 3).
Повышенное давление кислорода достоверно снижало интенсивность роста проростков только исходной линии 3629, ядерного мутанта п:сЫоппа-1 и сортовых растений. Высота хлорофилльных пластомных мутантов, обработанных ГБО, на стадии формирования 3 - 4 пары листьев не отличалась от контроля, а у пластомного мутанта еп:сЫоппа-5 даже достоверно превышала контрольные значения.
Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что наиболее устойчивыми формами подсолнечника к действию высокой температуры и повышенного давления кислорода являются пластомные мутанты (прежде всего еп:сЫоппа-3, еп:сЫоппа-5) и сортовые растения. Повышенная чувствительность исходной инцухт-линии 3629 скорее всего вызвана высокой степенью гомозиготности ядерных аллелей, что, как известно, снижает адаптивный потенциал организма в изменившихся условиях среды. В то же время высокая степень гетерозиготности генетического материала растений подсолнечника сорта Донской-99 обеспечивает их повышенную устойчивость как к температурному фактору, так и к повышенному давлению кислорода. Особый интерес вызывает частичный ревертант рг6-еп:сЫоппа-7. Несмотря на сни-
жение активности антиоксидантных ферментов после действия ТС или ГБО, всхожесть семян данной линии наибольшая среди мутантных форм, а рост растений после действия ГБО не отличался от контроля. Возможно, что в данном случае активно функционируют другие звенья защитной системы, в том числе и низкомолекулярные антиоксиданты. Ранее было показано, что у данного мутанта увеличены размеры митохондрий, а в структуре мтДНК отмечены изменения по сравнению с исходной линией 3629 [13]. Вероятно, этим можно объяснить устойчивость данной формы к изученным стрессорным воздействиям.
Стресс-факторы вызывают неспецифическую реакцию защитного торможения метаболизма [14], которая включает в себя и подавление процессов деления и роста клеток. Известно, что одним из пусковых сигналов для пролиферации клеток является синтез циклина. Тепловой шок, ингибируя синтез большинства клеточных белков, в том числе и циклина, может привести к снижению пролиферативной активности клеток сразу после действия внешнего фактора, синхронизации клеточных делений и интенсивной пролиферации в отдаленные сроки после окончания воздействия. Можно предположить, что ТС на ранних стадиях прорастания семян способствует формированию длительной адаптации растительного организма, которая осуществляется за счет модификации функционального состояния макромолекул, изменения дифференциальной активности генетического аппарата [15] или/и соматического отбора ДНК-содержащих органелл. Изменение функциональной активности ферментов требует дополнительных энергетических затрат, что предполагает ключевую роль функционально активных митохондрий и пластид. Известно, что устойчивость растений к экстремальным факторам внешней среды во многом определяется цитоплазматическими органеллами, прежде всего митохондриями и пластидами, осуществляющими ключевые процессы метаболизма - дыхание, окислительное фосфорилирование, фотосинтез. Наличие собственной ДНК в этих органеллах предполагает возможность возник-новения цитоплазматических мутаций, изменяющих норму реакции растительного организма.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ по программе: Р2003 ЮГ-а №03-01-96546.
Литература
1. Селье Г. // Новое о гормонах и механизмах их действия. Киев, 1977.
2. Сэджер Р. Цитоплазматические гены и органеллы. М., 1975.
3. Титов А.Ф. // Успехи совр. биол. 1979. № 1. С. 1256 -64
Таблица 3
Рост растений подсолнечника на стадии развития 3, 4-й пары листьев, см
Линия Контроль ГБО 0,7 МПа (0-4 ч) 45оС (0-6 ч)
3629 12,2±0,35 10,1±0,35+++ 3,0±0,52+++
п:сЫоппа-1 8,9±0,29*** 7,6±0,29***++ -
еп:сЫогта-3 7,5±0,22*** 7,0±0,23*** 4,6±0,48*+++
еп:сЫогта-5 7,15±0,18*** 7,9±0,17***++ 5,6±0,53***+++
еп:сЫогта-6 8,5±0,33*** 7,7±0,49*** -
еп:сЫогта-7 8,1±0,30*** 7,5±0,36*** 5,2±0,25***+++
эг6-еп:сЫоппа-7 9 7±0 37*** 8,7±0,28** 6,4±0,58***+++
г-еп:сЫоппа-7 10,8±0,40* 10,7±0,45 5,6±0,56***+++
Сорт Донской 16,5±0,36*** 14,4±0,41***+++ 12,7±0,37***+++
Примечание. Достоверные отличия сравнение с линией 3629 при: * - р < 0,05 ; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001. Достоверные отличия по сравнению с контролем при: + - р < 0,05 ; ++ - р < 0,01; +++ - р < 0,001.
132.
4. Шевякова Н.И. // Физиол. растений. 1982. № 2. С. 317
- 324.
5. Усатов А.В., Разорителева Е.К., Машкина Е.В., Улит-чеваИ.И. // Генетика. 2004. Т. 40. № 1. С. 248 - 255.
6. Чевари С. и др. //Лаб. дело. 1985. № 11. С. 678 - 681.
7. КоролюкМ.А. и др. // Лаб. дело. 1988. №1. С. 16 - 19.
8. Lowry O.N. et al. // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265
- 275.
9. Жиров В.К. и др. // Физиол. растений. 1982. № 6. С. 1045 - 1052.
10. Барабой В.А. // Успехи совр. биол. 1991. Т. 111. С. 923 НИИ биологии РГУ
- 932.
11. Курганова Л.Н. и др. // Физиол. растений. 1997. Т. 44.
№ 5. С. 725 - 730.
12. Курганова Л.Н. и др. // Физиол. растений. 1999. Т. 46.
№ 2. С. 218 - 222.
13. Triboush S.O. et al. // Plant Growth Regulation. 1999.
Vol. 27. Р. 75 - 81.
14. Мелехов Е.И. Общая биология. 1985. С. 174. Т. 46. № 2.
15. Кузнецов В.В. и др. // Физиол. растений. № 5. С. 987 - 996. 1990. Т. 37.
2в февраля 2004 г.
