CC BY
13
УДК 616.981.452
А.А.Бывалов2, А.В.Чернядьев1, И.В.Маракулин1, К.Е.Гаврилов1
ВЛИЯНИЕ НОСИТЕЛЬСТВА FRA-ОПЕРОНА YERSINIA PESTIS НА МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОК РЕЦИПИЕНТНОГО ШТАММА YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS
ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны РФ», Киров; 2Институт физиологии Коми Научного Центра Уральского Отделения Российской Академии Наук, Сыктывкар
Оценена зависимость морфологических свойств микробов Yersinia pseudotuberculosis 164/84 от температуры культивирования и носительства fra-оперона чумного микроба. При температуре выращивания 4-6 °С бактерий двух изогенных вариантов (fra+ и fra) штамма 164/84 отмечается меньшая, по сравнению с температурой 26-28 и 36-38 °С, скорость развития популяции. Существенные различия между микробами fra+- и fra - вариантов проявляются лишь на поздних сроках выращивания культур при температуре 36-38 °С и заключаются в относительно больших размерах клеток капсулообразующего варианта.
Ключевые слова: Yersinia pseudotuberculosis, микробная культура, fra-оперон, антиген FI, fra+- и fra - изогенные варианты.
Капсула (или капсулоподобные образования) является одним из факторов патогенности бактерий многих таксонов, вызывающих антропонозные заболевания. К числу таких микробов относится и возбудитель чумы, способный образовывать капсулу, участвующую в проявлении антифагоцитар-ной, адгезивной активностей микроба в организме теплокровного хозяина [1]. Иммунохимическая активность капсулы определяется антигеном FI, продукция которого усиливается при повышении температуры культивирования чумного микроба. Капсульный антиген FI широко используется в производстве и разработке иммунопрофилактических, иммунодиагностических препаратов. В качестве штаммов - продуцентов FI-антигена в таких работах обычно используют вакцинный штамм EV чумного микроба либо рекомбинантные варианты гра-мотрицательных бактерий, в геном клеток которых включен fra-оперон Yersinia pestis. Такие варианты могут применяться при изучении механизмов патогенеза чумы, формирования специфического иммунитета, а также филогенеза Y. pestis. В настоящее время считается общепризнанной теория о происхождении чумного микроба от возбудителя туберкулеза. Одним из крупных эволюционных шагов этого процесса явилось приобретение клетками «прародителя» Y. pestis плазмиды, детерминирующей в том числе биосинтез FI-антигена и обусловившей существенный вклад в процесс перехода одной из ветвей иерсиний от сапрофитизма к паразитизму.
Ранее нами получены два изогенных варианта иерсиний, с помощью которых мы начали исследования условий экспрессии и структурно-функциональной значимости признака капсулообразования Y. pestis в бактериях близкородственного реципиента - Yersinia pseudotuberculosis [2, 3].
Целью настоящей работы являлось изучение
по морфометрическим показателям экспрессии fra-оперона Y. pestis в клетках Y. pseudotuberculosis при различных температурных условиях культивирования.
Материалы и методы
В работе использовали два изогенных варианта Y. pseudotuberculosis, полученных путем трансформации в клетки реципиентного штамма 164/84, плазмид рВR328-Fra и рВЮ28, различающихся лишь наличием или отсутствием fra-оперона чумного микроба и поименованных далее Y. pseudotuberculosis 164/84 ( рВR328-Fra ) и Y. pseudotuberculosis 164/84 (рВЮ28) (или fra+- и fra - варианты) соответственно [2]. Культуры двух названных вариантов Y. pseudotuberculosis выращивали на агаре Хоттингера (рН 7,2) при температуре 4-6, 26-28 и 36-38 °С в течение 5 сут. Культуры для исследования смывали с поверхности среды 0,9 % раствором NaCl.
Иммунохимическую активность культур оценивали в реакции диффузионной преципитации (РДП) с антисывороткой к FI-антигену и в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарным чумным иммуноглобулиновым диагностикумом производства 48 ЦНИИ Минобороны России. Наличие или отсутствие капсулы у бактерий изучаемых вариантов оценивали микроскопическим методом тушевого контрастирования.
Морфологические свойства микробов анализировали при помощи циторефрактометрическо-го метода и автоматизированной морфометрии. Циторефрактометрический метод использовали для определения относительного содержания в пробах живых и делящихся клеток. Препараты для аноптраль-ной микроскопии готовили по известной методике [5] и анализировали с помощью микроскопа МБИ-15. Для автоматизированного измерения геометрических ха-
Микроскопия методом тушевого контрастирования бактерий У. рзеиЛоЫЪвгси1оз1з 164/84 (pBR328) (А) и 164/84 (pBR328-Frа) (Б), выращенных при температуре 36-38 °С
рактеристик микробов использовали анализатор изображений «MAGISCAN 2» фирмы «JOYCE-LOEBL», Англия. Коэффициент формы эллипсоидных клеток определяли принятым методом [4].
Результаты и обсуждение
Результаты микроскопических исследований методом тушевого контрастирования показали, что вокруг бактерий 164/84 (рВЮ28-Гга), выращенных при температуре 26-28 °С и (в большей степени) 36-38 °С, выявляется капсула. На рисунке видно, что клетки капсулообразующего варианта (Б) окружены зоной просветления, отсутствующей у контрольного варианта 164/84 (рВЯ328) (А). При температуре выращивания микробов 164/84 (рВЮ28-Гга), равной
4-6 °С, капсула не выявлялась.
Результаты определения иммунохимической активности культур двух сравниваемых вариантов псевдотуберкулезного микроба, представленные в табл. 1, показывают, что £га-оперон У ре$и$ в составе гибридной плазмиды рВЯ328-Бга индуцирует биосинтез И-антигена и в клетках нового хозяина: культуры референс-варианта (й'а-варианта) П-ан-тиген не продуцировали (данные не представлены). Следует отметить, что выраженность этого призна-
Таблица 1
Иммунохимическая активность культур У. ряеийоШЬегсиїояія 164/84 (pBR328-Fra), выращенных при различных температурах
Метод Титр Р1-антигена в культурах, выращенных при температуре ... , °С
4-6 26-28 36-38
РДП Нет 1:16 1:128
РНГА Нет 1:64 1:512
Примечание. Исследуемые культуры, выращенные в течение 5 сут, начинали титровать (с шагом 2): для РДП с концентрации 1011 м.к.-см-3, для РНГА - с 107 м.к.-см-3.
ка, как и в чумных бактериях, зависит от температуры выращивания биомассы клеток: максимальная продукция И-антигена отмечена при температуре культивирования 36-38 °С, существенно меньшая при температуре 26-28 °С; при 4-6 °С РДП и РНГА не выявляли в культуре &а+-варианта И-антиген при использованных условиях их постановки.
Интенсивное шуттелирование культуры £га+-ва-рианта, выращенной при температуре 36-38 °С, и последующее ее центрифугирование (10000 g, 30 мин) приводили к «вымыванию» капсулообразного вещества с поверхности клеток, о чем судили по данным микроскопии (метод тушевого контрастирования) клеток до и после указанных операций, а также по результатам РДП и РНГА препаратов надосадочной жидкости и клеточных осадков, полученных после центрифугирования шуттелированной и нешуттели-рованной культур.
При высеве на плотную питательную среду микробы двух вариантов У pseudotuЪerculosis приживались и начинали активно расти, скорость роста зависела от температуры выращивания.
Наибольшая скорость роста популяции наблюдалось при температуре 26-28 °С, при которой культуры обычно уже на 2-е - 3-и сутки выходили на стационарную или близкую к ней фазу. Об этом свидетельствуют невысокое содержание делящихся клеток, их размеры и форма, а также относительная однородность культур и высокое значение отношения площади поверхности к объему микробов (табл. 2). При дальнейшем выращивании изменения в культурах продолжались в сторону снижения размеров клеток и содержания делящихся особей, а также резкого уменьшения содержания живых бактерий, что указывает на отмирание большей части популяции уже на 5-е сутки культивирования (табл. 2).
При температуре выращивания 4-6 °С все мета-
Таблица 2
Динамика морфометрических параметров бактерий У. рэеи^шЬегси1оэ1з штамма 164/84 при выращивании на плотной питательной среде, (х ± J95)
Температура выращивания, °С Вариант штамма Время выращи- вания, сут Содержание живых клеток, % Содержание делящихся клеток, % Длина клеток, мкм Диаметр клеток, мкм Коэффициент формы клеток, отн. ед. Отношение площади к объему клеток, мкм -1
4-6
26-28
36-38
fra- 1 91,5 ± 1,6 40,0 ± 3,6 3,07 ± 0,26 0.92 ± 0,05 0.91 ± 0,02 4,84 ± 0,22
3 93,8 ± 1,3 15,1 ± 3,0 2,72 ± 0,23 0,91 ± 0,05 0,89 ± 0,02 4,95 ± 0,19
5 96,8 ± 1,0 10,8 ± 1,9 2,34 ± 0,16 0,83 ± 0,04 0,87 ± 0,02 5,47 ± 0,18
fra+ 1 93,6 ± 1,4 43,5 ± 3,9 3,25 ± 0,29 0,92 ± 0,05 0,92 ± 0,03 4,76 ± 0,25
3 94,0 ± 1,4 19,9 ± 2,2 2,56 ± 0,25 0,91 ± 0,05 0,89 ± 0,02 4,90 ± 0,20
5 98,5 ± 0,7 14,8 ± 2,8 2,26 ± 0,17 0,77 ± 0,03 0,88 ± 0,02 5,87 ± 0,19
fra- 1 99,0 ± 0,6 11,8 ± 1,7 1,54 ± 0,11 0,82 ± 0,04 0,72 ± 0,02 5,92 ± 0,14
3 78,0 ± 2,1 5,4 ± 1,2 1,41 ± 0,10 0,72 ± 0,04 0,74 ± 0,02 6,71 ± 0,12
5 18,9 ± 2,0 3,0 ± 1,0 1,32 ± 0,10 0,70 ± 0,03 0,72 ± 0,01 6,95 ± 0,12
fra+ 1 98,1 ± 0,7 12,4 ± 1,8 1,51 ± 0,12 0,76 ± 0,03 0,75 ± 0,02 6,29 ± 0,15
3 62,0 ± 2,3 5,8 ± 1,3 1,52 ± 0,11 0,75 ± 0,03 0,76 ± 0,02 6,40 ± 0,11
5 17,8 ± 1,8 3,5 ± 1,0 1,38 ± 0,10 0,69 ± 0,03 0,75 ± 0,02 6,99 ± 0,12
fra- 1 90,2 ± 1,5 12,6 ± 1,7 1,63 ± 0,13 0,93 ± 0,05 0,68 ± 0,02 5,30 ± 0,16
3 69,3 ± 2,2 10,5 ± 1,6 1,75 ± 0,13 0,99 ± 0,05 0,69 ± 0,02 4,99 ± 0,17
5 51,8 ± 2,3 4,6 ± 1,2 1,70 ± 0,12 0,94 ± 0,04 0,69 ± 0,02 5,23 ± 0,16
fra+ 1 87,8 ± 2,0 15,2 ± 3,0 1,78 ± 0,13 0,92 ± 0,04 0,73 ± 0,03 5,23 ± 0,15
3 65,3 ± 2,3 10,8 ± 2,0 1,87 ± 0,14 0,97 ± 0,05 0,73 ± 0,02 4,99 ± 0,16
5 56,1 ± 2,2 7,4 ± 1,6 1,96 ± 0,13 1,06 ± 0,05 0,71 ± 0,02 4,61 ± 0,17
болические процессы в популяции Y. pseudotuberculosis, по-видимому, протекают значительно медленнее. Низкие скорости подготовки к делению и самого деления, а также отмирания и лизиса клеток находят отражение в высоком содержании живых и делящихся микробов, больших размерах бактерий и выраженном полиморфизме культур. Даже к 5-м суткам культивирования при температуре 4-6 °С популяции далеки от стационарной фазы.
Для культур Y. pseudotuberculosis, выращенных при температуре 36-38 °С, уже в начальный период развития популяции отмечено значительное содержание отмирающих клеток на различных стадиях этого процесса. В таких культурах наблюдалось и много морфологически измененных микробов - раздутых, округлых, иногда шаровидных. В связи с наличием большого разнообразия форм клеток культуры выглядели очень полиморфными (хотя средние размеры клеток варьируют мало). При выращивании культуры в течение более 3 сут процессы отмирания клеток продолжали нарастать, а доля делящихся бактерий снижалась.
По морфологическим параметрам различия бактерий fra+- и fra - вариантов штамма 164/84 псевдотуберкулезного микроба выражены слабо, существенных отличий между культурами двух вариантов, выращенными при температуре 4-6 °С и 26-28 °С, ни по одному из оцениваемых показателей не отмечено. Однако анализ динамики развития культур при температуре 36-38 °С выявил, что культуры fra+- и fra - вариантов после 3 сут культивирования
резко расходятся по размерам клеток - их длине и диаметру (табл. 2). По другим морфологическим показателям культуры так выраженно не отличались. По-видимому, такие различия между двумя вариантами микробов обусловлены относительным повышением биосинтеза и/или экскреции И-антигена к
5-м суткам выращивания бактериями £га+-варианта с усилением процесса капсулообразования и соответствующим увеличением размеров клеток. Отличия в развитии штаммов подтверждаются и тем, что для &а+-варианта с 3-х по 5-е сутки выращивания убыль относительного содержания живых клеток составила 9,2 %, а делящихся - 3,4 %, в то время как значения указанных показателей для £га-варианта составили 17,5 и 5,9 % соответственно, т.е. различались почти в 2 раза. Кроме того, только у &а+-варианта при температуре выращивания 36-38 °С на 5-е сутки роста отмечено снижение отношения площади поверхности клеток к их объему (табл. 2), что обычно наблюдается при стабильных условиях развития популяции.
Таким образом, установлено, что микробы рекомбинантного варианта У. pseudotuЪerculosis 164/84, включающие &а-оперон У pestis и выращенные на плотной питательной среде при температуре 3638 °С, образуют капсулу (капсулоподобное вещество), непрочно связанную с клеточной поверхностью. Показано также увеличение средних размеров (длины и диаметра) клеток названного варианта, в отличие от его изогенного &а-варианта, на 5-е сутки культивирования при температуре 36-38 °С. При использовании иных температурных режимов выращи-
вания - 4-6 °С и 26-28 °С - значимых морфометрических различий между культурами сравниваемых вариантов не выявлено.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чУмы в экосистемах природных очагов. Сообщение I. Мол. генет., микробиол. и вирусо-лол. 2002; 3:3-23.
2. Бавалов А.А., Гаврилов К.Е., Крупин В.В. и др. Биологические и физико-химические свойства культур бактерий Yersinia pseudotuberculosis, несущих fra-оперон Yersinia pestis. Мол. генет., микробиол. и вирусолол. 2008; 1:14-8.
3. Печенкин Д.В., Бывалов А.А., Маракулин И.В. Влияние капсулы Yersinia pestis на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов морской свинки. Пробл. особо опасных инф. 2005; 90(2):47-8.
4. Тимаков В.Д., Гольдфраб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии. М.: Медгиз; 1958. 347 с.
5. Фихман Б.А. Микробиологическая рефрактометрия. -М.: Медицина; 1967. 325 с.
A.A.Byvalov, A.V.Chemyadiev, I.V.Marakulin, K.E.Gavrilov
Effects of Yersinia pestis Fra-Operon Carriage on the Cellular Morphologic Features of the Recipient Yersinia pseudotuberculosis Strain
The 48th Central Scientific Research Institute of the RFMinistry of Defense, Kirov; Physiology Institute of Komi Scientific Center of the Urals Division of the Russian Academy of Sciences, Syktyvkar
Cellular morphologic variations of Yersinia pseudotuberculosis strain 164/84 were assessed depending on the cultivation temperature and the plague agent’s fra-operon carriage by these cells. Notably slower population growth of the two isogenic variants of strain 164/84 (fra+ and fra-) was observed at the cultivation temperatures of 4 to 6 °C as compared with those at 26-28 °C and 36-38 °C. Only late growth stages at the temperatures of 36 to 38 °C brought about significant differences between the fra+ and fra- cell variants expressed in the occurrence of relatively bigger cells in the population of the capsule forming Y. pseudotuberculosis variant.
Key words: Yersinia pseudotuberculosis, microbial culture, fra-operon, Fl-antigen, fra+- and fra-- isogenic variants.
nociynHHa 07.12.07.
УДК 616.981.452+616-002.71
Н.А.Видяева, А.В.Гаева, Л.М.Куклева, Г.Н.Одиноков, В.В.Кутырев
сравнительная характеристика антиокислительных ферментов штаммов yersinia pestis различных подвидов и YERSINIA pseudotuberculosis
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Проведено сравнительное электрофоретическое изучение антиокислительных ферментов (супероксиддисму-тазы, каталазы и пероксидазы) у штаммов Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Eschericha coli и Salmonella typhimurium. Показано, что антиокислительные ферменты иерсиний по электрофоретической подвижности отличаются от ферментов E. coli и S. typhimurium. Их экспрессия зависит от температуры культивирования и плазмид-ного состава. Выявлены особенности экспрессии каталазы-пероксидазы у штаммов возбудителя чумы улэгейско-го подвида, у штаммов возбудителя псевдотуберкулеза VI серовара и штаммов, выделенных от людей.
Ключевые слова: Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, антиокислительные ферменты, супероксиддисму-таза, каталаза, пероксидаза.
Возбудитель чумы, Yersinia pestis, в отличие от своего предшественника возбудителя псевдотуберкулеза, Yersinia pseudotuberculosis, является факультативным внутриклеточным паразитом. Попадая в фагоцит, чумной микроб подвергается антимикробному действию факторов защиты фагоцитирующей клетки, проявлением одного из которых является «окислительный взрыв». При этом в фагоците образуются активные формы кислорода: супероксиданион, гидроперекиси, гидроксильный радикал, действие которых направлено на повреждение жирных кислот, белков, ДНК [9, 17, 20]. Патогенные микроорганизмы выработали ряд механизмов, направленных на защиту клетки от окислительного повреждения, среди которых важная роль принадлежит антиокислительн-ным ферментам (АО) - супероксиддисмутазе (СОД) и гидропероксидазам (каталазе и пероксидазе) [5]. У целого ряда патогенных бактерий обнаружена корреляция между активностью АО ферментов, устойчивостью к фагоцитозу и вирулентностью [6, 18].
У возбудителя чумы выявлены и охарактеризованы супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза [1, 2, 15, 19, 21]. Установлено, что супероксиддис-
мутазная и каталазная активности являются термо-индуцибельными признаками [2, 4, 19, 21] и активность супероксиддисмутазы не связана с носитель-ством собственных плазмид. В 1993 г. R.J.Mehigh и Я.Я.ВтЬакег [21] идентифицировали белок с молекулярной массой ~70 кД (р70), как каталазу, но не пероксидазу и супероксиддисмутазу. Этот белок экспрессировался в Са2+-дефицитной среде только при 37 °С, и его каталазная активность составляла менее 10 % от общей каталазной активности в клеточных экстрактах. Они также определили, что белок р70 является одним из термоиндуцибельных антигенов возбудителя чумы, названного антиген 5 или Е, так как этот белок перекрестно реагировал с антителами, полученными к антигену 5. М^оскептаЛег [23] обнаружил корреляцию между высокой каталазной активностью и вирулентностью У pestis, по мнению других авторов такой корреляции не наблюдается. Кроме того, было выявлено, что активность и катата-зы, и пероксидазы возбудителя чумы и псевдотуберкулеза несколько различались между собой [1, 10].
На территории бывшего СССР и Монголии, помимо основного подвида возбудителя чумы, цир-
