CC BY
129
Am 7universum.com
UNIVERSUM:
ХИМИЯ И БИОЛОГИЯ
НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ ИЕРСИНИЙ С ПЛАЗМИДАМИ pFra И pCad БАКТЕРИЙ ЧУМЫ
Трухачёв Алексей Леонидович
канд. мед. наук, зав. лабораторией микробиологии чумы и других иерсиниозов, ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»,
РФ, г. Ростов-на-Дону Е-mail: allet777@ yandex.ru
Васильева Екатерина Анатольевна
научный сотрудник лаборатории микробиологии чумы и других иерсиниозов, ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»,
РФ, г. Ростов-на Дону
Арсеньева Татьяна Евгеньевна
научный сотрудник лаборатории микробиологии чумы и других иерсиниозов, ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»,
РФ, г. Ростов-на Дону
Морозова Инна Владимировна
научный сотрудник лаборатории микробиологии чумы и других иерсиниозов, ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»,
РФ, г. Ростов-на-Дону
Кочеткова Анна Павловна
научный сотрудник лаборатории диагностики особо опасных инфекций, ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»,
РФ, г. Ростов-на-Дону
Лебедева Светлана Александровна
д-р мед. наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии чумы и других иерсиниозов, ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»,
РФ, г. Ростов-на-Дону
Некоторые свойства рекомбинантных иерсиний с плазмидами pFra и pCad бактерий чумы // Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. Трухачев А.Л. [и др.]. 2015. № 1-2 (11) . URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/1912
SOME PRPERTIES OF RECOMBINANT YERSINIA WITH pFra AND pCad
PLASMIDS AND PLAGUE BACTERIA
Truchachev Aleksey
Candidate of Medical Sciences, Head of Plague Microbiology and Other Yersina Laboratory, FGHI “Rostov-on-Don antiplague Institute of Russian Federal Consumer Rights Protection and Human Health Control Service ",
Russia, Rostov-on-Don
Vasilyeva Ekaterina
Research Scientist of Plague Microbiology and Other Yersina Laboratory, FGHI “Rostov-on-Don antiplague Institute of Russian Federal Consumer Rights
Protection and Human Health Control Service ",
Russia, Rostov-on-Don
Arsenyeva Tatyana
Research Scientist of Plague Microbiology and Other Yersina Laboratory, FGHI “Rostov-on-Don antiplague Institute of Russian Federal Consumer Rights
Protection and Human Health Control Service ",
Russia, Rostov-on-Don
Morozova Inna
Research Scientist of Plague Microbiology and Other Yersina Laboratory, FGHI “Rostov-on-Don antiplague Institute of Russian Federal Consumer Rights
Protection and Human Health Control Service",
Russia, Rostov-on-Don
Kochetkova Anna
Research Scientist of Plague Microbiology and Other Yersina Laboratory, FGHI “Rostov-on-Don antiplague Institute of Russian Federal Consumer Rights
Protection and Human Health Control Service",
Russia, Rostov-on-Don
Lebedeva Svetlana
Doctor of Medical Sciences, Professor, Leading Research Scientist, Plague Microbiology and Other Yersina Laboratory, FGHI “Rostov-on-Don antiplague Institute of Russian Federal Consumer Rights
Protection and Human Health Control Service ",
Russia, Rostov-on-Don
АННОТАЦИЯ
Обсуждается реальность межвидовых обменов плазмидами у иерсиний, персистирующих в природных очагах чумы. Показано влияние плазмид чумного микроба на вирулентность, антифагоцитарную активность и иммуногенность
возбудителей псевдотуберкулёза и кишечного иерсиниоза. Предложены праймеры для монолокусной видоспецифической ПЦР, высокоэффективные для детекции и идентификации плазмидных рекомбинантов иерсиний в культурах и при исследовании биологического материала от инфицированных носителей.
ABSTRACT
The reality of interspecies exchange of plasmids in Yersinia persistent in natural locus of plague is discussed. The influence of plasmid plague bacterium on virulence, antiphagocytic activity and immunogenicity of pseudotuberculosis activators and intestinal yersiniosis is shown. Primers for monolocus species-specific PCR, high-efficiency for the detection and identification of recombinant plasmid of Yersinia in cultures and in the study of biological material from infected agents are offered.
Ключевые слова: Yersinia pestis, иерсинии, обмен плазмидами,
патогенетические эффекты, фагоцитоз, природные очаги чумы, ПЦР-анализ.
Keywords: Yersinia pestis, Yersinia, exchange of plasmids, pathogenic effects, phagocytosis, natural locus of plague, PCR-analysis.
Возбудитель псевдотуберкулёза (Yersinia pseudotuberculosis), предком которого предположительно является инфекционный агент кишечного иерсиниоза (Yersinia enterocolitica), в настоящее время, по данным геномного анализа, сам оценивается как предшественник микроба чумы [24]. Одним из этапов эволюционного становления Yersinia pestis было приобретение и рекомбинантное формирование двух дополнительных видоспецифических плазмид pFra и pPst [30]. Первая из них с М.м. 65—90 МД содержит гены в составе caZ-оперона, обеспечивающие синтез и продукцию
видоспецифического F1 антигена. Сам антиген, детерминирующие его синтез гены и антитела к антигену, которые вырабатываются в организме чувствительных теплокровных, являются основными диагностическими маркерами классического возбудителя чумы. В плазмиде локализованы гены
«мышиного» экзотоксина и другие малоисследованные детерминанты, влияние которых на фенотип клетки-носители нельзя исключить. Бактерии чумы и псевдотуберкулёза, а иногда и кишечного иерсиниоза, могут одновременно циркулировать в одном природном очаге [4; 20], обусловливать микст-инфекции и сосуществовать в организме одного носителя и даже переносчика [1; 15; 23]. Псевдотуберкулёз обычно протекает в хронической форме и за счёт наличия у возбудителя ряда общих с Y.pestis антигенов [29] может вызывать перекрестный иммунитет к чуме, что может препятствовать чумной инфекции, снижать её остроту и активность эпизоотии [5]. Длительное сосуществование двух близкородственных инфекционных агентов в одном макроорганизме, в эктопаразитах-переносчиках или на объектах внешней среды может создавать условия для обмена их плазмидами и формирования клонов Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica c видоспецифическими плазмидами Y.pestis. Появление плазмиды (pFra) в бактериях иерсиний, особенно в Y.pseudotuberculosis, может приводить к ошибкам детекции и дифференциации иерсиний. В эксперименте передача плазмид Y.pestis различным иерсиниям и другим бактериям была показана нами и разными исследователями с помощью фагов и при совместном культивировании бактерий [2; 7; 8; 12]. Сохранение таких клонов в природе во многом зависит от особенностей их патогенетической активности, стабильности сохранения плазмид, влияния на фенотип нового хозяина и скорость его размножения в организме животных [2].
Цель работы: определение биологической активности рекомбинантных штаммов Y. pseudotuberculosis и Y.enterocolitica c плазмидами Y.pestis и отработка подхода к первичной экспресс-детекции таких бактерий, применительно к условиям обследования природных очагов чумы.
Материалы и методы. В экспериментах использовали штаммы, полученные нами ранее 1) вакцинный штамм Y.pestis EV76, две собственные плазмиды которого были маркированы транспозонами (pFra::Tn5, pCad::Tn7, pPst)+; 2) вирулентный штамм Y.pestis 231(pFra, pCad, pPst)+; 3) исходные штаммы—Y.pseudotuberculosis 493 (бесплазмидный, авирулентный) V серовара
и Y.enteroolitica Lucas 421 (бесплазмидный, авирулентный), а также по два варианта каждого из них, которым с помощью трансдукции фагом P1cml clr 100ts(pl) и сопереноса конъюгационной R-плазмидой [7; 8] были переданы маркированные плазмиды штамма Y.pestis EV76: одна плазмида pFra::Tn5 и две плазмиды pFra::Tn5 + pCad::Tn7. В качестве контрольного использовали также аттенуированный штамм Y.pestis TS Pgm+, pCad-, pPst-, pFra+ с целью проверки влияния маркированных плазмид на летальный протективный эффекты у возбудителя чумы.
Антиген F1 в культурах бактерий исследуемых штаммов определяли по инструкции с помощью объёмной реакции агглютинации (РАО) и «диагностикума чумного иммуноглобулинового полимерного сухого для РАО» (ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»).
Летальный эффект проверяли в дозах: 104 микробных клеток (м.к.), 107м.к. и 108м.к. на белых мышах при внутрибрюшинном введении бактерий, а у морских свинок — при подкожном введении. Культуры бактерий выращивали при 28оС. Наблюдали за животными 14 сут. Павших вскрывали. Материал из селезёнок и мезентериальных лимфоузлов сеяли «отпечатками» на агар Хоттингера. Посевы выращивали при 28оС 2 сут.
Протективность проверяли на модели выживших после первичного инфицирования животных, заражая их в конце срока наблюдения 200 DCL исходного вирулентного штамма Y.pestis 231 (2103м.к.). Культуры для заражения выращивали 18 ч при 28оС на агаре Хоттингера.
Антимакрофагальную активность оценивали по индексу завершённости фагоцитоза (ИЗФ6) через 6 ч контакта бактерий с перитонеальными макрофагами (МФ) белых мышей и морских свинок по известной методике при нагрузке 50 м.к./МФ и оценке характера и интенсивности фагоцитоза [18]. Отрицательные значения ИЗФ6 служили свидетельством способности бактерий размножаться в МФ. Положительные обозначали подавление бактерий факторами МФ. Статистическую обработку проводили по формуле L95=(Mmax-Mmin) R, где L95 — среднеарифметическая ошибка при уровне достоверности
95%; (Mmax-Mmin) — амплитуда колебаний показателей; R005 — коэффициент для нахождения ошибки [19].
Наличие иерсиний в селезёнках и посевах, а также их видовую принадлежность определяли при постановке ПЦР с применением проверенных на модели атипичных штаммов иерсиний [21] надёжных видоспецифических пар праймеров vlm12for/ISrev216 [32], Уеп(реагент фирмы GenPakR DNA PCR Test^ JS [33], направляющих синтез видоспецифических ампликонов соответственно для Y.pestis, Y.enteroolitica и Y.pseudotuberculosis размером 390, 373 и 223п.н. Использовали также ПЦР c парой праймеров caf1 (306п.н.) из набора «ГенПест» («Микроб» Саратов) в поиске ДНК pFra Y.pestis. Условия постановки ПЦР соответствовали описаниям авторов публикаций и инструкции.
Результаты и обсуждение. Антиген F1 в культурах донора плазмид Y.pestis EV76 и штамма 231 с плазмидой рFra в РАО при 37оС определялся в титре (0,25^0,5)105 м.к. Для рекомбинантного штамма Y.pseudotuberculosis 493 ^га::Тп5) этот показатель был на порядок ниже— (0,2^0,4)106м.к. У рекомбинантов кишечного иерсиниоза антиген F1 продуцировался на уровне, характерном для Y.pestis, как при 28°C, так и при 37оС выращивания бактерий. Реципиентные штаммы иерсиний F1 не продуцировали вообще. С праймерами cafl положительную ПЦР регистрировали с ДНК всех штаммов иерсиний, кроме реципиентных, не содержащих плазмиду pFra.
Фагоцитоз изучали на модели МФ белых мышей как в пробах с исходным, наиболее близким к возбудителю чумы штаммом Y.pseudotuberculosis 493, так и с его рекомбинантами, содержащими одну плазмиду pFra::Tn5 или две pFra::Tn5 + pCad::Tn7. ИЗФ6 во всех случаях, независимо от температуры предварительного выращивания бактерий, имел, хотя и различные по цифровому выражению, но отрицательные значения, что доказывало факт внутриклеточного размножения бактерий этих штаммов и неспособность МФ белых мышей к завершению их фагоцитоза. Существенного усиления антифагоцитарной активности бактерий псевдотуберкулёза под влиянием плазмид Y.pestis на модели МФ мышей не обнаружено. Температура предварительного культивирования
бактерий влияла лишь на интенсивность их размножения внутри МФ. Так, рекомбинанты Y.pseudotuberculosis с плазмидой pFra::Tn5 (с одной или вместе с pCad::Tn7), выращенные при 37оС, судя по количеству внутриклеточных бактерий в разный временной период, размножались внутри МФ несколько медленнее, чем бактерии исходного бесплазмидного реципиентного варианта. Выращенные при 28оС рекомбинанты по скорости размножения в МФ белых мышей не отличались от исходного штамма (таблица 1).
Показатели ИЗФ6 на модели перитонеальных МФ морских свинок представлены в таблице 1. И в этих опытах отрицательные значения ИЗФ6 свидетельствовали о способности бактерий размножаться в МФ. Приближение значений к «0» указывало на уменьшение этой способности, а положительные значения означали подавление роста и отмирание бактерий под влиянием бактерицидных продуктов МФ. К нашему удивлению, приобретение бактериями Y.pseudotuberculosis «чумных» плазмид, детерминирующих активные антифагоцитарные компоненты (в т. ч. F1-антиген), мешало проявлению собственной способности бактерий псевдотуберкулёза выживать внутри МФ морских свинок (положительный ИЗФ6) и определяло тенденцию к их постепенной гибели микробов. Этот эффект был более выражен после выращивания рекомбинантных бактерий при 37оС по сравнению с 28оС, что указывает на неблагоприятность этих условий для экспрессии всех факторов защиты от МФ. Вполне вероятно, что отмеченное в одной из публикаций [2] снижение репродуктивности плазмидных рекомбинантов при повышенной температуре играет в этом некоторую роль.
Дополнительные данные были получены через 24 ч контакта бактерий и МФ. В этом случае более чётко оказалась выраженной разница в уровнях корреляции показателей ИЗФ24 с температурой культивирования бактерий перед фагоцитозом. Выросшая при 28оС малая часть бактерий
Y.pseudotuberculosis, сохранившихся в МФ через 6 ч, затем размножалась, проявляла цитотоксичность и вызывала через 24 ч полную гибель МФ, так же, как бактерии штамма Y.pestis EV76.
Таблица 1.
Показатели фагоцитоза бактерий исходных штаммов и рекомбинантов перитонеальными макрофагами
Штамм Плазмиды Y.pestis Индекс завершенности фагоцитоза через 6 ч контакта с макрофагами
Макрофаги белых мышей Макрофаги морских свинок
37оС 28оС 37оС 28оС
Y.pestis БУ76-донор pFra::Tn5 pCad::Tn7, pPst -(1,6±0,21) -(3,8±0,25) -(0,6±0,08) -(1,33±0,1)
Y.pseudotuberculosis 493-реципиент — -(2,9±0,3) -(4,2±0,3) -(0,77±0,04) -(1,09±0,05)
Y.pseudotuberculosis 493 (рекомбинанты) pCad::Tn7 н/и н/и н/и н/и
pFra::Tn5 -(0,28±0,02) -(1,0±0,2) +(0,34±0,06) -(0,18±0,04)
pFra::Tn5 pCad::Tn7 -(0,39±0,08) -(0,65±0,08) +(0,25±0,02) -(0,21±0,05)
Напротив, после предварительного культивирования при 37оС бактерий Y.pestis EV76 в МФ через 24 ч не обнаруживали (завершённый фагоцитоз). Сохранение близких к значению «0», но отрицательных показателей ИЗФ24 у плазмидных рекомбинантов Y.pseudotuberculosis 493 позволяет предположить, что после массивной гибели их бактерий (частичный фагоцитоз), в последующем возникает устойчивая к фагоцитозу популяция. В отличие от этого исходный вариант штамма Y.pseudotuberculosis 493 постоянно противостоял фагоцитозу и сохранял явную способность к росту внутри МФ как через 6, так и 24 ч контакта.
Летальный эффект исходных штаммов и плазмидных рекомбинантов на модели морских свинок не обнаружен при подкожном введении 109м.к. Его проверили на модели белых мышей при внутрибрюшинном заражении (таблица 2). В присутствии одной плазмиды pFra он был заметен лишь при заражающей дозе 108м.к., а при дополнении второй pCad::Tn7 плазмидой, подобием которой обладают многие природные штаммы возбудителя иерсиний, он стал очевидным. Рекомбинанты с одной плазмидой pCad::Tn7 гибели мышей не вызывали. Судя по посевам органов павших мышей, при внутрибрюшинном заражении бактерии этих слабо вирулентных рекомбинантов Y.pseudotuberculosis оказывались не только в мезентериальных узлах, но выделялись также из селезёнки, что подтверждалось и результатами ПЦР. Склонность этой иерсинии даже при отсутствии выраженной вирулентности размножаться во внеклеточном матриксе РЭС (ретикулоэндотелиальной системы) и длительно там сохраняться в литературе отмечена [27].
Морские свинки, инфицированные подкожно 106—109м.к. реципиентных вариантов иерсиний, были резистентны к 200 DCL вирулентного штамма Y.pestis 231 до приобретения «чумных» плазмид. Поэтому протективность определяли на белых мышах (таблица 3). Плазмида pFra снова играла ведущую роль, но pCad явно стимулировала протективный эффект, хотя самостоятельно активности не проявляла. Это чётко обнаруживалось на Y.pestis и бактериях
псевдотуберкулёза. Данные по Y.enterocolitica пока трудно объяснить. С учётом необычной термонезависимости синтеза F1 антигена этими рекомбинантами требуются дополнительные исследования.
Таблица 2.
Летальный эффект рекомбинантов при внутрибрюшинном заражении
белых мышей
Штамм Плазмиды Y.pestis* Летальный эффект
108м.к. 107м.к. 104м.к.
Зара- жено/пало Пало, % Зара- жено/пало Пало, % Зара- жено/пало Пало, %
Y.pestis EV76 Pgm- pPst, pFra::Tn5 pCad::Tn7 12/12 100 12/12 100 12/12 100
Y.pestis 231 pFra, pCad, pPst 12/1 9 12/0 0 12/0 0
Y.pestis TS pFra/ Pgm+ pFra 12/4 58 12/0 0
pFra::Tn5 12/8 67 12/0 0
pFra::Tn5 pCad::Tn7 12/10 83 12/0 0
Y.pseudot uberculosi s 493 - 12/0 0 12/0 0
pCad::Tn7 12/0 0 12/0 0
pFra::Tn5 12/8 67 12/0 0
pFra::Tn5 pCad::Tn7 12/12 100 12/11 92 12/0 0
Y.enteroco litica Lucas 421 - 12/0 0 12/0 0
pCad::Tn7 12/0 0 12/0 0
pFra::Tn5 12/12 100 12/2 17 12/0 0
pFra::Tn5 pCad::Tn7 12/12 100 12/10 83 12/0 0
В эмульсиях ткани селезёнок и мезентериальных лимфоузлов от павших белых мышей, инфицированных бактериями чумы и рекомбинантами, а также в культурах из посевов «отпечатков» тех же органов с помощью РАО обнаружили F1 антиген в диагностическом титре. Однако эффективность детекции в пробах с возбудителем чумы была на порядок выше.
Таблица 3.
Протективность подкожного введения реципиентных штаммов и рекомбинантов с маркированными плазмидами при чуме белых мышей
Штаммы Плазмиды Y.pestis П ротективный эффект
108м.к. 106м.к. 104м.к.
Иммун/ выж. Живых % Иммун/ выж. Живых, % Иммун/ выж. Живых, %
Y.pestis EV76 Pgm- pFra, pCad, pPst 12/12 100 12/12 100 6/6 100
Y.pestis TS pFra+ /Pgm+ pFra 6/5 83 6/4 67 6/3 50
pFra::Tn5 6/6 100 6/6 100 6/4 67
pFra::Tn5 pCad::Tn7 6/6 100 6/5 83 6/6 100
Y.pseudo- tuberculo-sis 493 - 6/6 100 6/3 50 6/1 17
pCad::Tn7 6/6 100 6/2 33 6/1 17
pFra::Tn5 6/6 100 6/5 83 6/4 67
pFra::Tn5 pCad::Tn7 н/и 6/6 100 6/6 100
Y.entero-colitica Lucas 421 - 6/0 0 6/0 0 н/и
pCad::Tn7 6/1 17 6/0 0 н/и
pFra::Tn5 н/и 6/6 100 н/и
pFra::Tn5 pCad::Tn7 н/и 6/4 33 н/и
При исследовании ДНК из ткани селезёнок и выросших культур-«отпечатков» результаты ПЦР с парой праймеров cafl были во всех пробах положительны, независимо от того, присутствовали в пробе рекомбинанты иерсиний или контрольный штамм Y.pestis. Специфических ампликонов (306 п.н.) не было лишь в пробах с ДНК контрольных реципиентных иерсиний, не содержащих pFra.
В материале, взятом из органов мышей, заражённых F1+ рекомбинантами Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica с плазмидами Y.pestis, ни в одном случае не обнаружили культур, подозрительных на принадлежность к чумному микробу и позитивных в ПЦР с парой праймеров vlm12for/IS216rev. ДНК во всех пробах реагировала с праймерами JS или Yen, подтверждая принадлежность рекомбинантов к виду Y.pseudotuberculosis
или Y.enterocolitica, несмотря на наличие cafl гена. Только пробы с контрольным штаммом Y.pestis EV76 реагировали со специфической для Y.pestis парой праймеров vlm12for/IS216rev (таблица 4).
Вопрос о закономерностях персистенции возбудителей чумы, псевдотуберкулёза и кишечного иерсиниоза в одном очаге в настоящее время нуждается в дополнительных исследованиях. Окончательная формулировка представлений об их взаимоотношении в природе крайне необходима. Близкое родство этих иерсиний неизбежно должно приводить к их конкуренции. В частности, антигенное сходство с чумным микробом при склонности возбудителя псевдотуберкулёза индуцировать затяжные формы заболевания
Таблица 4.
ПЦР-анализ исходных штаммов иерсиний и рекомбинантов
№ п/п Характер материала Праймеры Наличие специфических ампликонов в зависимости от присутствия в пробе бактерий штаммов
Y.pestis EV76- донор Y.pseudotu-berculosis -493 реципиент Y.pseudotu-berculosis-рекомбинант (pFra) Y.enterocolitic a Lucas 421 -pеципиент Y. enterocolitica -реком-бинант (pFra)
1. Культуры исследуемых штаммов vlm/IS+JS* +vlm +JS +JS - -
Yen - - - + +
cafl + - + - +
2. Взвесь клеток ткани селезёнки павших биопробных белых мышей vlm/IS + н/и - н/и -
JS - н/и + н/и -
vlm/IS+JS* +vlm н/и +JS н/и -
Yen - н/и - н/и +
cafl + н/и + н/и +
3. Культуры из посевов «отпечатков» селезёнок павших биопробных белых мышей vlm/IS + н/и - н/и -
vlm/IS+JS* +vlm н/и +JS н/и -
Yen - н/и - н/и +
cafl + н/и + н/и +
Пояснение: н/и —пробы не исследованы из-за отсутствия павших биопроб. * —две пары разных праймеров в одной пробе,
естественно, может влиять на восприимчивость природных носителей инфекции к чуме, на форму её проявления, остроту и вероятность чумных эпизоотий, а также способствовать селекции форм возбудителя чумы с изменённой серологической специфичностью, в первую очередь появлению Fra" вариантов. Более того, при известной способности обоих видов возбудителей обитать в кишечнике блох и почве, где не редки их контакты с бактериофагами, трудно исключить возможность обмена генетическим материалом, в частности плазмидами, участвующими в реализации иммуногенности и вирулентности. Давно показана трансдуцирующая активность полигостального фага Р1 [8; 17], фагов Н и Л-413 [10; 16] и cходных с ними вирионов, выделенных из нор грызунов в зоне природных чумных очагов [13]. Важно знать биологическую активность таких рекомбинантов, а также их стабильность при циркуляции в организме носителей. Эти исследования требуют более широкого развития. Представленные нами данные могут быть полезным заделом при решении этой проблемы. Более того, разработка алгоритма ПЦР-диагностики таких рекомбинантных форм иерсиний будет способствовать их поиску и контролю, а также расширит возможности решения экологических проблем в природных очагах чумы. На наш взгляд, исследование рекомбинантов с практически интактными природными плазмидами, а не клонированными, приближает ситуацию к естественной, которая может произойти в природных чумных очагах со смешанным спектром возбудителей. Ведь до сих пор нет окончательного заключения о механизмах многолетнего сохранения возбудителя чумы и его генетического материала во временно «потухших» очагах, о «сберегающих» формах изменчивости возбудителя, хотя имеется много интересных фактов и предположений, которые нуждаются в специальном анализе [3; 11; 14; 22]. Представляется, что полученные нами данные будут в этом ракурсе полезными.
В наших экспериментах на животных приобретение плазмиды pFra усиливало летальный эффект рекомбинантов только при больших дозах инфицирования, что по существующим критериям не выводит их из ранга «аттенуированных» или вирулентных в той степени, какая была характерна
для исходных штаммов. Факт, что гибли только мыши (при внутрибрюшинном введении!) и этот эффект не стимулировался одиночной плазмидой pCad, свидетельствует о ведущей роли pFra, в составе которой локализован ген «мышиного» токсина. Его эффект обычно обнаруживают при высоких дозах заражения внутрибрюшинно именно у мышей, так как морские свинки в таких дозах к этому токсину не чувствительны. Для объяснения синергидности действия плазмиды pCad нужны дополнительные исследования.
Судя по результатам тестирования иммунизирующей активности, приобретение плазмиды pFra сопровождается достоверным повышением иммуногенности рекомбинантов для белых мышей в отношение Y.pestis. Распространение таких штаммов в очаге, несомненно, может тормозить развитие чумной эпизоотии, снижая уровень восприимчивости популяций грызунов к смертельной инфекции. Этот факт мешает тотальному вымиранию высокочувствительной прослойки популяции носителей и способствует сохранению скрытых, атипичных форм возбудителя чумы. Сказать что-либо о морских свинках на данном этапе затруднительно в силу высокой иммуногенности использованного бесплазмидного авирулентного исходного штамма Y.pseudotuberculosis 493. Результаты наших исследований межвидовой иммуногенности при чуме подтверждают данные литературы относительно природных штаммов возбудителя псевдотуберкулёза, способных защитить экспериментальных животных от чумы, включая её лёгочную форму[6; 9], и плазмидных рекомбинантов с клонированным ш/-опероном [2; 28].Эти данные делают наши рассуждения о влиянии иерсиний на ход эпизоотий в природных очагах более вескими. Более того, они служат основанием для возвращения интереса к псевдотуберкулёзному микробу и его рекомбинантам с pFra плазмидой как к основе для конструирования противочумной вакцины [28]. Хотя, на наш взгляд, прежде необходимо решить вопрос: является ли иммунитет к чуме стерильным или требует сохранения рекомбинантов Y.pseudotuberculosis в организме в скрытом состоянии, возможно, в виде плёнок в РЭС, реализация которых оптимальна в отсутствии pCad плазмиды [25].Не следует забывать,
что иерсинии данного вида стимулируют у теплокровных аутоиммунные процессы, эффект которых не всегда можно предсказать. Соответствующие исследования очень важны как для проблемы вакцин, так и экологии чумных природных очагов в целом.
При анализе фагоцитоза мы обратили внимание на снижение сопротивляемости исследованного штамма бактерий псевдотуберкулёза антибактериальному действию перитонеальных макрофагов после введения плазмиды pFra, хотя бактерии исходного штамма-реципиента способны к размножению внутри макрофагов. Возможно, экспрессия генов pFra плазмиды сопровождается торможением собственных антифагоцитарных факторов бактерий псевдотуберкулёза, которое они всё же могут преодолевать. Заложен ли в этом определённый биологический смысл, покажут дальнейшие исследования. В пользу этого свидетельствует медленное размножение в течение 24 ч оставшихся в живых бактерий, обладающих большим потенциалом приживляемости in vivo, чем у противочумной вакцины. Проявление антифагоцитарной активности у исходного реципиентного штамма
Y.pseudotuberculosis, не имеющего собственной плазмиды pCad (pIB), позволяет предположить, согласно описанным фактам, что его бактерии in vivo выживают за счёт инвазина и детерминированных хромосомой факторов секреции III типа [27]. Угнетение этой активности в присутствии плазмид чумного микроба создаёт условия, при которых неспособность противостоять фагоцитозу, вероятно, вынуждает рекомбинантные бактерии искать убежище в лимфоузлах и селезёнке в участках внеклеточного матрикса, богатых Т и В лимфоцитами, но не фагоцитами, и проявлять склонность к индукции затяжной инфекции без резких патоанатомических проявлений с возможностью сохранения генетического материала бактерий длительное время, как это имеет место за счёт разных механизмов у других паразитов [26; 31]. Для выяснения механизмов, определяющих особенности поведения «чумной» плазмиды pCad в бактериях псевдотуберкулёза, нужны дополнительные исследования с учётом видовых вариаций структуры ДНК.
Отмеченная нами более высокая антифагоцитарная активность культур обеих исходных вариантов иерсиний и рекомбинантов возбудителя псевдотуберкулёза, выращенных при 28оС, по сравнению с 37-градусными является биологически оправданной в силу известной большей инфекциозности бактерий этих иерсиний при пониженной температуре и может быть предметом дальнейших исследований.
Необходимо отметить ещё один аспект. Возможность передачи плазмид чумного микроба с «диагностическим» cafl-геном близкородственным иерсиниям вносит затруднения при поиске микроба чумы с помощью иммунологических тестов на F1 антиген и ПЦР-анализа с «плазмидными» праймерами, утверждёнными как специфические для вида Y.pestis. Позитивные результаты поиска возбудителя чумы с помощью «плазмидных» праймеров в ПЦР и иммунологических тестов на F1 антиген при отрицательных результатах ПЦР с видоспецифическими «хромосомными» праймерами и посевов проб могут иметь место при наличии в пробах бактерий псевдотуберкулёза и кишечного иерсиниоза или других бактерий, приобретших плазмиды чумного микроба. Дополнительное использование пар праймеров JS, Yen и vlm12for/IS216rev, направляющих синтез ампликонов, специфических соответственно для каждого вида иерсиний, облегчает решение этой проблемы. Доказанная нами высокая эффективность ПЦР с праймерами, комплементарными видоспецифическим фрагментам хромосомы каждой из иерсиний, и с праймерами на фрагменты плазмид чумного микроба будет не только способствовать поиску предполагаемых природных рекомбинантов, но и позволит проследить пути распространения их в чувствительных носителях, выявить их возможное депо в организме и длительность сохранения в разных органах.
К тому же нужно учесть, что существуют ещё две возможности: высокая эффективность передачи разными методами третьей плазмиды pPst, ответственной за синтез биологически активной p/a-протеазы (маркера при детекции вида Y.pestis), и доказана реципиентная способность в отношении «чумных» плазмид у разных видов патогенных и условно патогенных бактерий
сем. Enterobacteriaceae, которые, как известно, могут циркулировать в популяциях грызунов, обитающих в природных очагах чумы. Неисключено, что недостаточная проработка адекватных приёмов скрининга различных отклоняющихся от нормы форм возбудителей может приводить и к упущениям, и к некорректной оценке результатов анализа исследуемых материалов, когда при позитивных результатах ПЦР-анализа и иммунологических тестов на F1-антиген, бактериологический анализ не обнаруживает роста типичных форм возбудителя чумы.
Выводы
1. Приобретение pFra плазмиды Y.pestis бактериями иерсиний даже при слабом повышении вирулентности для белых мышей или его отсутствии может существенно повышать способность рекомбинантов защищать от чумной инфекции, делая их равноценными вакцинному штамму Y.pestis EV76, что при циркуляции двух иерсиний в одном очаге и обмене плазмидами может способствовать иммунизации грызунов-носителей, менять течение чумной эпизоотии и способствовать формированию изменённых форм возбудителя в их организме.
2. Бактерии обеих исследованных иерсиний с агаровой среды при 28оС имеют более высокий антимакрофагальный потенциал, чем после культивирования на питательной среде при 37оС и проявляют его по разному при взаимодействии с МФ белых мышей и морских свинок. Плазмида pFra оказывает ингибирующий эффект на этот потенциал у бактерий псевдотуберкулёза. Плазмида pCad усиливает этот эффект, не проявляя себя в отсутствии pFra.
3. Позитивные результаты поиска возбудителя чумы с помощью «плазмидных» праймеров в ПЦР и иммунологических тестов на F1 антиген при отрицательных результатах посевов в отсутствии дефектов бактериологического анализа могут иметь место при наличии в пробах гетерологичных или родственных бактерий, приобретших плазмиды чумного микроба.
4. Сочетание пар праймеров на диагностический cafl ген чумного микроба и видоспецифический фрагмент хромосом каждой из иерсиний проявляет
высокую эффективность при детекции рекомбинантных по плазмиде форм
как при анализе культур, так и органов биопробных или исследуемых животных.
Использование этих праймеров будет полезно при обследовании природных
очагов чумы и поисках рекомбинантных форм.
Список литературы:
1. Бибикова В.А., Классовский Л.Н., Осадчая Л.М. и др. О судьбе чумных и псевдотуберкулёзных бактерий в смешанных культурах //Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. — 1967.—№ 5. — С. 138—139.
2. Бывалов А.А., Гаврилов К.Е., Крупин В.В. и др. Биологические и физикохимические свойства культур бактерий Yersinia pseudotuberculosis, несущих fra-оперон Yersinia pestis //Мол.генетика, микробиол., вирусол. — 2008. — № 1. — С. 14—18.
3. Вариабельность возбудителя чумы и проблемы его диагностики/ под ред. С.А. Лебедева, Ю.И. Арутюнов. — Ростов н/Д, 2009.— 533 с.
4. Гольдфарб Л.М., Герасименко Р.Т., Пономарев Н.Г. и др. Характеристика энтерококков, выделенных от песчанок и изучение взаимоотношений возбудителя чумы и энтерококков //Пробл. особо опас. инф. — Саратов, 1972. — Вып. 5. — С. 114—117.
5. Занина В.М., Таран И.Ф., Дмитриев В.Ф. и др. К изучению перекрёстного иммунитета при чуме и псевдотуберкулёзе грызунов //Пробл. особо опас. инф. —Саратов, 1977. — Вып. 3(55). — С. 68—69.
6. Заплатина С.И., Хохлова А.М. Об иммунологическом родстве P.pestis и P.pseudotuberculosis //Тр. Ростовского н/Д н.-и. противочум. ин-та. — Ростов-на-Дону, 1959. — Т. XVI. — С. 97—104.
7. Заренков М.И., Лебедева С.А. Tn-опосредованная мобилизация плазмидных детерминантов чумного микроба с помощью плазмиды pKA7 // Мол.генетика, микробиол., вирусол.—1986. —№ 5. — С. 16—20.
8. Заренков М.И., Лебедева С.А., Гребцова Н.Н. и др. Способ трансдукции
хромосомных маркеров и плазмид у чумного микроба: А.с. № 1304406 СССР. Заявка Ростовского—на-Дону противочумного института
№ 3858282/28-14. Приоритет от 25.02.1985.
9. Колесник Р.С., Колесник В.С., Домарадский И.В. и др. Экспериментальные данные о способности некоторых псевдотуберкулёзных штаммов предохранять против интратрахеального заражения чумой //Пробл. особо опас. инф. — Саратов, 1968. — Вып. 4.— С. 114—120.
10. Ларина В.С. Трансдукция стрепомицинрезистентности у чумного микроба с помощью умеренного фага Л-413 «С» //Пробл. особо опас. инф. — Саратов, 1969. — Вып. 610. — С. 104—106.
11. Ларина В.С., Степанов В.С., Айкимбаев А.М. и др. О сложном симбиозе чумного микроба, сальмонелл и почвенных микроорганизмов. //Орг. Эпиднадзора при чуме и меры её проф.: Матер. межгос. науч.-практ. конф. — Алма-Ата, 1992. — Ч. 1. — С. 125—129.
12. Лебедева С.А., Гуревич Г.К., Заренков М.И. и др. Трансдукция у Yersinia pestis, осуществляемая бактериофагами Р^г и P1 cmlclr 100 ts //Мол. генетика, микробиол., вирусол. — 1984. —№ 2. — С. 17—19.
13. Лешкович Н.Л. Ермилова В.П. О диапазоне и специфичности действия фагов 1701, 1710 и их мутантов //Пробл. особо опас. инф. — Саратов, 1974. — Вып. 2. — С. 38—41.
14. Литвин В.Ю. Механизмы устойчивого сохранения возбудителя чумы в окружающей среде (Новые факты и гипотезы) //Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.— 1997. —№ 4. — С. 26—31.
15. Никульшин С.В., Онацкая Т.Г., Луканина Л.М. и др. Изучение ассоциации почвенных амёб Hartmanella rhizoids c бактериями-возбудителями чумы и псевдотуберкулёза в эксперименте //Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. — 1992.—№ 9—10. — С. 2—5.
16. Новосельцев Н.Н. Получение стрептомицинустойчивых рекомбинантов чумного микроба методом трансдукции //Пробл. особо опас. инф. — Саратов, 1970. — Вып. 1. — С. 98—100.
17. Плотников О.П. Трансдуцирующая система на модели чумного и псевдотуберкулёзного микробов //Мол. биология и генетика возб. особо опас. инф. — Саратов, 1982. — Ч. 2. — С. 52—55.
18. Пустовалов В.Л., Васильева Г.И., Киселёва А.К. Определение антифагоцитарной активности антигенов чумного микроба //Патол. физиол., иммунол и аллергол. особо опас. инф. — Саратов, 1984. — С. 8—12.
19. Стрелков Р.Б. Статистические таблицы для экспресс-обработки
экспериментального и клинического материала: методические
рекомендации. — Обнинск, 1980. — 20 с.
20. Тарасова В.Е., Инокентьева Т.И. Восприимчивость монгольской пищухи Тувы и Горного Алтая к псевдотуберкулёзу //Пробл. особо опас. инф. — Саратов, 1974. — Вып. 6(40). — С. 76—79.
21. Трухачёв А.Л., Иванова В.С., Арсеньева Т.Е. и др. Поиск праймеров на основе хромосомной ДНК Yersinia pestis для эффективной ПЦР-идентификации типичных и атипичных штаммов возбудителя чумы // Клин. лаб. диагностика. — 2008. —№ 12. — C. 49—52.
22. Хрусцелевская Н.М., Бибикова В.А., Сержанов О.С. Взаимоотношение возбудителя чумы с эризопелотриксами, пастереллами, листериями и сальмонеллами в организме блох, мышей и на питательных средах //Пробл. особо опас. инф. — Саратов, 1975. — Вып. 1(41). — С. 72—82.
23. Шамова А.М. Случай выделения чумных и псевдотуберкулезных культур из грызунов на территории энзоотичного очага чумы //Изв. Иркут. н.-и. противочум. ин-та Сибири и Дальнего Востока. — Иркутск, 1959. — С. 63—67.
24. Achtman M., Zurth R., Morelli G. et al. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — Vol. 96, N 24. — P. 14043—14048.
25. Atkinson S., Goldstoun R.J., Joshua G.W.P. Biofilm development on Caenorhabditis elegans by Yersinia is facilitated by quorum sensing-dependent repression of type III secretion //PLoS Pathogen. — 2011. — Vol. 7.— Issue 1.e1001250.
26. Azadech B., Sells P.G., Ejeckam G.C. et al. Lockalized leishmania lymphadenitis. Immunohistochemical studies //Am. J. Clin. Pathol. — 1994. — Vol. 102. — P. 11—15.
27. Balada-Liasat J.M., Mecsas J. Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system //PLoS Pathogen. — 2006. — Vol. 2.—Issue 9.e86.
28. Derbise A., Man'n A.C., Ave P. et al. An encapsulated Yersinia
pseudotuberculosis is a highly efficient vaccine against pneumonic plague //PLoS Neglected Tropical Diseases — 2012. —Vol. 6.—Issue 2. e1528.
29. Lawton W.D., Fukui G.W., Surgalla M.G. Studies on the antigens of Pasteurella pestisand Pasteurella pseudotuberculosis //J. Immunol. — 1960. — Vol. 84, N 5. — P. 475—479.
30. Lindler L.E., Plano G.V., Burland V. et al. Complete DNA sequence and detailed analysis of the Yersinia pestis KIM5 plasmid encoding murine toxin and capsulare antigen //Infect. Immun. — 1998. — Vol.66. — P.5731—5742.
31. Monack D.M., Bouley D.M., Falkow S. Salmonella typhimurium persists with in macrophages in the mesenteric lymph nodes of chronically infected Nramp1+/+mice and can be reactivated by IFN{gamma} neutralization // J.Exp. Med. — 2004. — Vol. 199. — P. 231—241.
32. Motin V.L., Georgescu A.M., Elliot J.M. et al. Genetic variability of Yersinia pestis isolates as predicted by PCR-based IS100 genotyping and analysis of structural genes encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase (glpD) // J. Bacteriol. — 2002. — V. 184, N. 4. — P. 1019—1027.
33. Radnedge L., Agron, P.G., Worsham P.L. et al. Genomic plasticity in Yersinia pestis //Microbiology. — 2002. — Vol. 148. — P. 1687—1698.
