CC BY
36
вания - 4-6 °С и 26-28 °С - значимых морфометрических различий между культурами сравниваемых вариантов не выявлено.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чУмы в экосистемах природных очагов. Сообщение I. Мол. генет., микробиол. и вирусо-лол. 2002; 3:3-23.
2. Бавалов А.А., Гаврилов К.Е., Крупин В.В. и др. Биологические и физико-химические свойства культур бактерий Yersinia pseudotuberculosis, несущих fra-оперон Yersinia pestis. Мол. генет., микробиол. и вирусолол. 2008; 1:14-8.
3. Печенкин Д.В., Бывалов А.А., Маракулин И.В. Влияние капсулы Yersinia pestis на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов морской свинки. Пробл. особо опасных инф. 2005; 90(2):47-8.
4. Тимаков В.Д., Гольдфраб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии. М.: Медгиз; 1958. 347 с.
5. Фихман Б.А. Микробиологическая рефрактометрия. -М.: Медицина; 1967. 325 с.
A.A.Byvalov, A.V.Chemyadiev, I.V.Marakulin, K.E.Gavrilov
Effects of Yersinia pestis Fra-Operon Carriage on the Cellular Morphologic Features of the Recipient Yersinia pseudotuberculosis Strain
The 48th Central Scientific Research Institute of the RFMinistry of Defense, Kirov; Physiology Institute of Komi Scientific Center of the Urals Division of the Russian Academy of Sciences, Syktyvkar
Cellular morphologic variations of Yersinia pseudotuberculosis strain 164/84 were assessed depending on the cultivation temperature and the plague agent’s fra-operon carriage by these cells. Notably slower population growth of the two isogenic variants of strain 164/84 (fra+ and fra-) was observed at the cultivation temperatures of 4 to 6 °C as compared with those at 26-28 °C and 36-38 °C. Only late growth stages at the temperatures of 36 to 38 °C brought about significant differences between the fra+ and fra- cell variants expressed in the occurrence of relatively bigger cells in the population of the capsule forming Y. pseudotuberculosis variant.
Key words: Yersinia pseudotuberculosis, microbial culture, fra-operon, F1-antigen, fra+- and fra-- isogenic variants.
Поступила 07.12.07.
УДК 616.981.452+616-002.71
Н.А.Видяева, А.В.Гаева, Л.М.Куклева, Г.Н.Одиноков, В.В.Кутырев
сравнительная характеристика АнтиокиСлитЕльных ферментов штаммов YERSiNiA PESTiS различных подвидов и YERSiNiA PSEUDOTUBERCULOSiS
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Проведено сравнительное электрофоретическое изучение антиокислительных ферментов (супероксиддисму-тазы, каталазы и пероксидазы) у штаммов Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Eschericha coli и Salmonella typhimurium. Показано, что антиокислительные ферменты иерсиний по электрофоретической подвижности отличаются от ферментов E. coli и S. typhimurium. Их экспрессия зависит от температуры культивирования и плазмид-ного состава. Выявлены особенности экспрессии каталазы-пероксидазы у штаммов возбудителя чумы улэгейско-го подвида, у штаммов возбудителя псевдотуберкулеза VI серовара и штаммов, выделенных от людей.
Ключевые слова: Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, антиокислительные ферменты, супероксиддисму-таза, каталаза, пероксидаза.
Возбудитель чумы, Yersinia pestis, в отличие от своего предшественника возбудителя псевдотуберкулеза, Yersinia pseudotuberculosis, является факультативным внутриклеточным паразитом. Попадая в фагоцит, чумной микроб подвергается антимикробному действию факторов защиты фагоцитирующей клетки, проявлением одного из которых является «окислительный взрыв». При этом в фагоците образуются активные формы кислорода: супероксиданион, гидроперекиси, гидроксильный радикал, действие которых направлено на повреждение жирных кислот, белков, ДНК [9, 17, 20]. Патогенные микроорганизмы выработали ряд механизмов, направленных на защиту клетки от окислительного повреждения, среди которых важная роль принадлежит антиокислительн-ным ферментам (АО) - супероксиддисмутазе (СОД) и гидропероксидазам (каталазе и пероксидазе) [5]. У целого ряда патогенных бактерий обнаружена корреляция между активностью АО ферментов, устойчивостью к фагоцитозу и вирулентностью [6, 18].
У возбудителя чумы выявлены и охарактеризованы супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза [1, 2, 15, 19, 21]. Установлено, что супероксиддис-
мутазная и каталазная активности являются термо-индуцибельными признаками [2, 4, 19, 21] и активность супероксиддисмутазы не связана с носитель-ством собственных плазмид. В 1993 г. R.J.Mehigh и R.R.Brubaker [21] идентифицировали белок с молекулярной массой ~70 кД (р70), как каталазу, но не пероксидазу и супероксиддисмутазу. Этот белок экспрессировался в Са2+-дефицитной среде только при 37 °С, и его каталазная активность составляла менее 10 % от общей каталазной активности в клеточных экстрактах. Они также определили, что белок р70 является одним из термоиндуцибельных антигенов возбудителя чумы, названного антиген 5 или Е, так как этот белок перекрестно реагировал с антителами, полученными к антигену 5. М^оскептаЛег [23] обнаружил корреляцию между высокой каталазной активностью и вирулентностью Y pestis, по мнению других авторов такой корреляции не наблюдается. Кроме того, было выявлено, что активность и катата-зы, и пероксидазы возбудителя чумы и псевдотуберкулеза несколько различались между собой [1, 10].
На территории бывшего СССР и Монголии, помимо основного подвида возбудителя чумы, цир-
кулируют штаммы четырех неосновных подвидов (кавказского, гиссарского, алтайского и улэгейского). Эти штаммы имеют избирательную вирулентность (вирулентны для белых мышей и авирулентны для морских свинок) и обладают как свойствами, объединяющими основной и неосновные подвиды, так и общими для неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза. Неосновные подвиды в настоящее время рассматриваются как наиболее древние формы возбудителя чумы [3]. Возможно, что избирательная вирулентность неосновных подвидов обусловлена либо изменением, либо активности АО ферментов, либо их изоформ.
В связи с этим цель нашей работы: дать сравнительную электрофоретическую характеристику ан-тиокислительных ферментов иерсиний, Escherichia coli и Salmonella typhimurium; определить влияние различного сочетания собственных плазмид и температуры культивирования иерсиний на экспрессию антиокислительных ферментов; провести сравнительный электрофоретический анализ АО ферментов штаммов Y pestis биоваров antiqua, medievalis и orientalis и пяти подвидов (основной, алтайский, кавказский, гиссарский, улэгейский), циркулирующих на территории России и ближнего зарубежья, а также штаммов Y. pseudotuberculosis.
Материал и методы
Для сравнительного изучения влияния температуры и плазмид на экспрессию антиокислительных ферментов у бактерий использовались производные вакцинного штамма Y pestis EV с различным сочетанием плазмид pFra, pCad и pPst, Y pseudotuberculosis 85 (pCad+) и его изогенный бесплазмидный клон, а также Escherichia coli K12 и Salmonella typhimurium LT2. Для исследования изоферментного спектра ан-тиокислительных ферментов у иерсиний различного происхождения выбрано по два штамма возбудителя чумы биоваров medievalis (212 и 162) и orientalis (243 и 195 Р), один штамм биовара antiqua (172), по одному штамму основного (231) и кавказского (1146) подвидов, по два штамма алтайского (И-2998 и 2359) и гиссарского (А-1724 и А-1728) подвидов, три штамма улэгеского подвида (И-3131, И-3068 и И-3069), по одному штамму Y pseudotuberculosis I-IV сероваров и по два штамма возбудителя псевдотуберкулеза, выделенных от грызунов (417, 2600) и людей, больных дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой (312, 50-73).
Культуры иерсиний выращивали в бульоне Хоттингера (рН 7,2) с добавлением 20 мМ Mg2+ в течение 6 ч при 28 “С и в течение 18 ч - при 37 “С (для экспрессии Ca2+-зависимых белков), либо 24 ч - при 28 “С, а E. coli и S. typhimurium - при 37 “С в течение 24 ч. Для штаммов возбудителя чумы пяти подвидов и штаммов возбудителя псевдотуберкулеза использовали условия культивирования, при которых проявляется только одна из изоформ фермента: бульон
LB (без добавления магния) и температура культивирования 28 °С. Клетки собирали центрифугированием, отмывали дважды физраствором и разрушали ультразвуком. Неразрушенные клетки и осколки мембран осаждали центрифугированием (4000 g, 20 мин), цитоплазму отбирали, концентрировали замораживанием-оттаиванием, доводили концентрацию белка до 1 мг/мл и анализировали методом электрофореза в неденатурирующих условиях по B.J.Davies [12] с последующей обработкой электро-фореграмм для специфического проявления супе-роксиддисмутазы [7], каталазы [16] и пероксидазы [22]. Определение активности ферментов проводили спектрофотометрически: СОД по [8], каталазы по [25], пероксидазы по [11].
Результаты и обсуждение
Изучение изоферментного спектра антиокис-лительных ферментов бесплазмидного штамма и штаммов с различным сочетанием плазмид чумного микроба показало, что все три фермента (СОД, ката-лаза и пероксидаза) продуцируются как у плазмидсо-держащих, так и у бесплазмидных штаммов Y pestis (рис. 1).
Выявленные на энзимограммах СОД каталаза и пероксидаза отличались по своей электрофоретической подвижности от соответствущих антиокис-лительных ферментов E. coli и S. typhimurium. СОД Y pestis представлена двумя изоформами СОД-1 и СОД-2. Обе они отличались от известных форм СОД (Mn-СОД и Fe-СОД) E. coli, но по электрофоретической подвижности СОД-1 чумного микроба близка к Mn-СОД, а СОД-2 - к Fe-СОД E. coli.
Анализ энзимограмм СОД, производных штамма Y pestis EV с различным сочетанием собственных плазмид, выращенных при 28 и 37 °С показал,
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Рис. 1. Изоферментный спектр супероксиддисмутазы штаммов Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, E. coli K-12 и S. typhimurium LT2:
1 - Y. pestis EV (pCad+ pPst+ pFra+), 37 “C; 2 - Y. pestis EV, 28 “C;
З - Y. pestis КМ 217 (pCad+ pPst- pFra-), 37 “C; 4 - Y. pestis 217, 28 “C;
5 - Y. pestis КМ 218 (pCad- pPst- pFra-), 37 “C; б - Y. pestis КМ 218, 28 “C; 7 - Y. pestis КМ 216 (pCad- pPst+ pFra-), 37 “C; 8 - Y. pestis КМ 216,
28 “C; 9 - Y. pestis КМ 215 (pCad+ pPst+ pFra-), 37 “C; 10 - Y. pestis КМ 215, 28 “C; 11 - Y. pestis КМ 225 (pCad- pPst- pFra+) 37 “C; 12 - Y. pestis КМ 225, 28 “C; 13 - Y. pestis КМ 226 (pCad+ pPst- pFra+), 37 “C;
14 - Y. pestis КМ 226, 28 “C; 15 - Y. pestis КМ 227 (pCad- pPst+ pFra+), 37 “C; 16 - Y. pestis КМ 227, 28 “C; 17 - E. coli K-12; 18 - S. typhimurium LT2; 19 - Y. pseudotuberculosis 85 (pCad+), 37 “C; 20 - Y. pseudotuberculosis 85, 28 “C; 21 - Y. pseudotuberculosis 85/21 (pCad-), 37 “C;
22 - Y. pseudotuberculosis 85/21, 28 “C
что плазмида pCad и температура инкубации влияют на изоферментный спектр АО ферментов чумного микроба: при 37 °С культивирования интенсивность окраски СОД-1 значительно снижена у штаммов, содержащих pCad (EV - pCad+ pPst+ pFra+, KM 217 - pCad+, KM 215 - pCad+ pPst+), а у Y pestis КМ 226 (pCad+ pFra+) при 37 °С появились еще три быстродвижущиеся полосы. Однако спектрофотометрическое изучение активности СОД не выявило значительных различий в активности этого фермента в зависимости от плазмидного состава, то есть активность СОД штамма КМ 226, выращенного и при 28, и 37 °С была одинаковой.
Специфическая окраска полиакриламидных гелей, содержащих белки цитоплазмы, на перокси-дазу позволила выявить в штаммах Y pestis две полосы, которые отличались от пероксидаз E. coli и S. typhimurium.
Применяемый нами метод выявления каталазы не позволил обнаружить этот фермент у штаммов E. coli и S. typhimurium, в то время как у штаммов чумного микроба он проявлялся на уровне перокси-дазы с более высокой электрофоретической подвижностью По-видимому, выявляемый фермент является каталазой, обладающей пероксидазной активностью (каталаза-пероксидаза).
Анализ энзимограмм каталазы и пероксидазы производных штамма Y. pestis EV с различным сочетанием собственных плазмид, выращенных при 28 и 37 °С, показал, что плазмида pCad и температура инкубации влияют на изоферментный спектр АО ферментов чумного микроба: при 37 °С культивирования у штаммов pPst+, pCad+, pPst+ pCad+ pFra+, pPst+ pCad+ отсутствовала полоса с более высокой электрофоретической подвижностью и соответствующая ей полоса на энзимограмме каталазы. Эти данные полностью коррелировали с результатами спектрофотометрического определения активности пероксидазы и каталазы.
Специфическое выявление ферментов на элек-трофореграммах в настоящее время широко применяется в методе мультилокусного энзимотипирова-ния различных видов бактерий [24]. С этой целью подбираются условия культивировния, при которых проявляется одна из изоформ данного фермента. Поэтому для изучения экспрессии антиокислитель-ных ферментов у штаммов возбудителя чумы различного происхождения и у псевдотуберкулезного микробов клетки выращивали при 28 °С в бульоне LB в течение 18 ч. При данных условиях культивирования специфическая окраска гелей на АО ферменты позволила установить, что все изученные штаммы возбудителя чумы и псевдотуберкулеза экспрессируют только одну форму супероксиддисмутазы с одинаковой электрофоретической подвижностью у всех изученных штаммов. Судя по интенсивности негативных пятен на геле, которые формируются на фиолетовом фоне в процессе специфической окраски на супероксиддисмутазу, ее активность у всех штам-
Псрокс.
Перокс.
Рис. 2. Энзимограмма пероксидазы штаммов Y pestis и Y. pseudotuberculosis
1-12 - Y. pestis: 1 - 231, 2 - 1146, 5 - И 2998, 4 - 2359,
5 - A 1728, 6 - A 1724, 7 - И 3131, 8 - 172,
9 - 162, 10 - 212, 11 - 195P-, 12 - 243;
13-22 - Y. pseudotuberculosis: 13 - 2600, 14 - 50-73, 15 - 312,
16 - 417, 17 - I, 18 - II, 19 - III, 20 - IV, 21 - V, 22 - VI
мов была одинакова. Окраска гелей на пероксидазу и каталазу также выявила только одну изоформу этих ферментов. Сопоставление энзимограмм этих ферментов показывает, что при данных условиях культивирования экспрессируется только фермент, обладающий двумя активностями, а именно пероксидаза-каталаза (рис. 2).
Он продуцируется всеми изученными штаммами, кроме улэгейского, у которого его экспрессия отсутствует или значительно снижена. В настоящем исследовании показано, что улегэйский подвид, как и ожидалось, обладает повышенной чувствительностью к окислительному стрессу, что может быть следствием пониженной активности каталазы-пероксидазы у этого подвида. У возбудителя псевдотуберкулеза каталаза-пероксидаза имела ту же электрофоретическую подвижность, что и у Y. pestis. Исключение составляют штаммы Y. pseudotuberculosis, выделенные от людей, и штамм VI серовара, у которых этот фермент имеет более высокую подвижность, чем у остальных изученных штаммов.
Таким образом, в результате проведенных исследований было обнаружено, что АО ферменты чумного микроба отличаются по электрофоретической подвижности от АО ферментов E. coli и S. typhimurium; изоферментный спектр АО ферментов зависит от температуры культивирования и плазмидного состава; штаммы Y. pestis улэгейского подвида обладают сниженной активностью пероксидазы, а у штаммов Y. pseudotuberculosis VI серовара и штаммов, выделенных от людей, пероксидаза имеет более высокую электрофоретическую подвижность.
Работа поддержана грантами РФФИ: 07-04-00100а, 08-0400731а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Джапаридзе М.Н. Каталазная и пероксидазная активность чумного и псевдотуберкулезного микробов [дис. ... канд. мед. наук]. 1953. 205 с.
2. Куликов О.А., Дробков В.И., Дармов И.В. и др. Супероксиддисмутазы чумного микроба. Вестн. Рос. АМН.
3. Куклева Л.М., Проценко О.А., КутыревВ.В. Современные представления о родстве возбудителей чумы и псевдотуберкулеза. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2002,1:3-7.
4. Шиманюк Н.Я., Асеева А.Е., Мишанькин Б.Н. Супероксиддисмутазная активность у иерсиний. В кн.: Иерсиниозы: микробиол., эпидемиол., клиника, патогенез, им-мунол. Владивосток; 1968. С. 83-84.
5. Babior B. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes. New Engl. J. Med. 1978; 289:659-68.
6. Beaman B., Black C., Doughty F., et al. Role of superoxide dismutase and catalase as determinants of pathogenicity of Nocardia asteroids: importance in resistance to microbicidal activities of human polymorphonuclear neutrophils. Infect. Immun. 7985; 47:135-41.
7. Beauchamp C., Fridovich I. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Anal. Biochem. 1971; 44:276-87.
8. Beyer W., Fridovich I. Assaying for superoxide dismutase activity: some large consequences of minor changes in conditions. Anal. Biochem. 1987; 161:559-66.
9. Brot N., Weissbach L., Werth J., et al. Enzymatic reduction of protein-bound methionine sulfoxide. Prot. Natl. Acad. Sci USA. 1981; 78:2155-58.
10. Burrows T., Farrel J., Gillett W. The catalase activity of Pasteurella pestis and other bacteria. Br. J. Exp. Pathol. 1964; 45:579-88.
11. Cohen H. The use of diaminobenzidine for spectrophoto-metric and acrylamide gel detection of sulfite oxidase and its applicability to hydrogen peroxide-genereting enzymes. Anal. Biochem. 1973; 53:208-22.
12. DavisB. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serumproteins. Ann. N.Y Acad. Sci. 1964; 121:404-27.
13. Fridovich I. Oxygen radicals, hydrogen, peroxide and oxygen toxicity. In: W.A.Prior, editor. Free radicals in biology. New York: Academic Press; 1976. p. 239-277.
14. Fridovich I. The biology of oxygen radicals. Science. 1978; 201:875-80.
15. Carcia E., Nedialkov Y., Elliott J., et al. Molecular characterization of KatY (Antigen 5), a thermoregulated chromosomally encoded catalase-peroxidase of Yersinia pestis. J. Bacteriol. 1999; 181(10):3114-22.
16. Gregory E., Fridovich I. Visualization of catalase in acrylamide gels. Analyt. Biochem. 1974; 58:57-62.
17. Hollsstein M., Brooks P., Linn S., et al. Hydroxymethyluracil DNA glycosylase in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984; 81:4003-7.
18. Mandell G. Catalase, superoxide dismutase and virulence in Staphylosossus aureus: in vitro and in vivo studies with emphasis on staphylococcal-leukocyte intraction. J. Clin. Invest. 1975; 55:561-66^
19. Marcheva D., Nicolova S., Veljanov D. О распространении каталазной активности у бактерий рода Yersinia. Докл. Ъолг.
AH. 1988; 41(3):57-60.
20. Mead J. Free radical mechanism of lipid damage and consequences for cellular mambranes. In: W.A.Prior, editor. Free radicals in biology. New York: Academic Press; 1976. P. 51-68.
21. Mehigh R., Brubaker R. Major stable peptides of Yersinia pestis synthesized during the low-calcium response. Infect. Immun. 1993; 61(1):13-22.
22. Raymond S. Acrylamide gel electrophoresis. Ann. N.Y Acad. Sci. 1964; 121:350-65.
23. Rockenmacher M. Relationship of catalase activity to virulencein Pasteurella pestis. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1949; 71:99-101.
24. Selander R., Caugant D., Ochman H., et al. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics. Appl. Environ. Microbiol. 1986; 51:873-84.
25. Vassilyadi M., Archibald F. Catalase, superoxide dismutase and production of O2-sensitive mutants of Bacillus coagulans. Can. J. Microbiol. 1985; 31:994-99.
N.A.Vidyaeva, A.V.Gaeva, L.M.Koukleva, G.N.Odinokov, V.V.Kutyrev
Comparative Characteristics of Antioxidative Enzymes of Yersinia pestis Strains of Different Subspecies and Yersinia pseudotuberculosis Strains
Russian Anti-Plague Research Institute “Micribe", Saratov
Comparative electrophoretic investigation was carried out to study antioxidative enzymes (superoxide dismutase, catalase and peroxidase) in strains of Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli and Salmonella typhimurium. It was shown that Yersinia antioxidative enzymes are different from E. coli and S. typhimurium enzymes in electrophoretic motility. Their expression depends on cultivation temperature and plasmid content. Peculiarities of catalase-peroxidase expression were determined in strains of plague etiological agent of Ulegei subspecies, in strains of pseudotuberculosis etiological agent of IV serovar and in strains isolated from humans.
Key words: Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, antioxidative enzymes, superoxide dismutase, catalase, peroxidase.
Поступила 12.03.08.
УДК 576.851.132:616.982.27-033
Е.В.Калинкина, Н.П.Агеева, О.А.Меринова, Д.А.Лобойко, Д.В.Викторов, Л.К.Меринова фЕнотипичЕСкиЕ СвойСтвА мутАнтов патогенных BURKHOLDERIA,
резистентных к фторхинолонам и цефалоспоринам
ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт»
Исследованы фенотипические свойства мутантов филогенетически родственных патогенных видов Burkholderia (B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia), резистентных к фторхинолонам и цефалоспоринам. Показано, что штаммы с маркерами PfxR (OfxR), CfzR приобретают перекрестную устойчивость множественного типа к антибиотикам различных классов. Резистентность штаммов изменяется под действием от блокирующего влияния ингибитора кальциевых мембранных каналов - верапамила. Мутантные штаммы отличаются по продукции внеклеточных ферментов (протеаз, лецитиназы, липазы) и вирулентностью.
Ключевые слова: Burkholderia, антибиотикорезистентность, мутанты, фторхинолоны, цефалоспорины, фенотипические свойства, верапамил.
Возбудители мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) и сапа (Burkholderia mallei), а также являющиеся оппортунистическими патогенами микроорганизмы комплекса Burkholderia cepacia составляют группу филогенетически родственных видов [3, 8].
Наряду с общностью и клинической значимостью, эти микроорганизмы характеризуются высокой природной резистентностью к антибактериальным
препаратам, включающим широкий спектр антибиотиков различных классов [1, 2].
Способность всех трех видов быстро повышать антибиотикорезистентность в процессе лечения ограничивает выбор эффективных лекарственных средств и создает серьезные трудности при химиотерапии заболеваний, вызываемых буркхольдериями [2, 5, 7].
