CC BY
104
/ • 7universum.com
iklJNIVERSUM:
/У\ ХИМИЯ И БИОЛОГИЯ
ОСОБЕННОСТИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ,
НЕ ПРОДУЦИРУЮЩИХ ОСНОВНОГО КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА F1, И АПРОБАЦИЯ ОТДЕЛЬНЫХ МЕТОДОВ ИХ ДЕТЕКЦИИ
Арсеньева Татьяна Евгеньевна
научный сотрудник ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»,
РФ, г. Ростов-на-Дону
Трухачёв Алексей Леонидович
канд. мед. наук, зав. лабораторией микробиологии чумы и других иерсиниозов, ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»,
РФ, г. Ростов-на-Дону
Васильева Екатерина Анатольевна
научный сотрудник лаборатории микробиологии чумы и других иерсиниозов ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»,
РФ, г. Ростов-на-Дону
Морозова Инна Владимировна
научный сотрудник лаборатории микробиологии чумы и других иерсиниозов
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»,
РФ, г. Ростов-на-Дону
Лебедева Светлана Александровна
д-р мед. наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии чумы и других иерсиниозов ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора»,
РФ, г. Ростов-на-Дону E-mail: illans@mail.ru
Особенности штаммов возбудителя чумы, не продуцирующих основного капсульного антигена F1 и апробация отдельных методов их детекции //
Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. Арсеньева Т.Е. [и др.]. 2014. № 8 (8) . : http://7universum.com/ru/nature/archive/item/1513
CHARACTERISTICS OF PLAGUE AGENT STRAINS NOT PRODUCING MAIN CAPSULAR ANTIGEN F1 AND APPROBATION OF SEPARATE
METHODS OF DETECTION
Arsenyeva Tatiana
Research scientist, Rostov-on-Don Antiplague Institute of Rospotrebnadzor,
Russia, Rostov-on-Don
Trukhachev Aleksey
Candidate of Medical Science, Head of Plague microbiology and other yersiniosis laboratory, Rostov-on-Don Antiplague Institute of Rospotrebnadzor,
Russia, Rostov-on-Don
Vasilieva Ekaterina
Research scientist of Plague microbiology and other yersiniosis laboratory, Rostov-on-Don Antiplague Institute of Rospotrebnadzor,
Russia, Rostov-on-Don
Morozova Inna
Research scientist of Plague microbiology and other yersiniosis laboratory, Rostov-on-Don Antiplague Institute of Rospotrebnadzor,
Russia, Rostov-on-Don
Lebedeva Svetlana
Doctor of Medical Science, Professor, Leading research scientist of Plague microbiology and other yersiniosis laboratory,
Rostov-on-Don Antiplague Institute of Rospotrebnadzor,
Russia, Rostov-on-Don
АННОТАЦИЯ
Изучена коллекция природных Бга-штаммов Y. pestis, уклоняющихся от идентификации по основному капсульному антигену F1 и антителам к нему и вызывающих чуму с изменённой клиникой, микробиологическими, иммунологическими методами и в ПЦР с видоспецифическими праймерами. Показаны особенности штаммов и отличия в патогенезе у белых мышей, морских свинок и монгольских песчанок. В ПЦР с праймерами на caf-гены, доказана различная локализация дефектов оперона и предложены надёжные доступные подходы к детекции Fra- штаммов в культурах и в органах биопроб.
ABSTRACT
The collection of natural Fra- strains Y. pestis is studied deviating from main capsular antigen F1 and antibodies identification, and giving rise to plague with modified clinic by microbiological, immunotechniques, and in PCR with species-specific primers. Strain characteristics of white mice, cavies, Mongolian gerbils, and differences in pathogenesis are shown. In PCR with primers on caf-genes the variant operon fault isolation is proved; safe and accessible approach to detection of Fra-strains in planting and organs of bioprobe is suggested.
Ключевые слова: Yersinia pestis, Fra-штаммы, сaf-оперон,
патогенетическая активность, детекция бактерий, ПЦР-анализ.
Keywords: Yersinia pestis, Fra- strains, сa/-opeгon, pathogenic activity, bacteria detection, PCR-analysis.
Предшественником микроба чумы, Yersinia pestis, является один из отщепившихся клонов возбудителя псевдотуберкулёза (Yersnia pseudotuberculosis) серовара Olb. Оба они имеют высокую степень гомологии нуклеотидной и генной структуры геномов [9, с. 17837; 10, с. 13828]. Хотя у возбудителя чумы часть общих генов существует в виде повреждённых псевдогенов, имеются отличия в регуляторных системах [4, с. 5; 10, с. 13830] и при контакте с другими бактериями дополнительно к имевшейся плазмиде pCad (45-47 Md) приобретены ещё два внехромосомных репликона, в процессе эволюции ставшие видоспецифическими плазмидами [15, с. 2589]. Мажорная pFra (pMT, 65 Md) влияет на вирулентность и обеспечивает продукцию основного диагностического капсульного антигена «фракция 1» (F1, Cafl), который считается ведущим маркером чумного микроба [2, с. 58]. Его генетическая детерминанта, плазмидный caf-оперон, включает ген-регулятор cafR, структурный ген co/7-субъединиц и два вспомогательных гена, ответственных за сборку субъединиц и транспорт на поверхность бактерий [12, с. 39; 14, с. 525]. Утрата плазмиды pFra и/или повреждения генов
cf-оперона вызывают прекращение (Fra-) или (Fra±) или различные дефекты в продукции F1 антигена. Это ведёт к изменению клинических проявлений чумы, ослаблению остроты инфекции, увеличению её длительности, а также к снижению вирулентности для некоторых чувствительных к чуме теплокровных [3, с. 155; 7, с. 67]. При этом становится невозможным обнаружение Fra- возбудителя и антител к нему основными иммунологическими диагностикумами на F1 антиген. В диагностике признана высокая эффективность полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако возможность утраты плазмид чумным микробом и мутационных дефектов некоторых хромосомных генов может снижать эффективность соответствующих праймеров. Наши предыдущие сравнительные исследования по детекции, идентификации и межвидовой дифференциации на модели обширной коллекции типичных штаммов Y. pestis и Y. psdtbc из разных очагов мира показали [8, с. 7] эффективность известных праймеров 3а и JS [17, с. 1695] и полную надёжность праймеров группы vlm12/IS [13, с. 1021].
Цель работы: Охарактеризовать патогенетическую активность
различающихся природных Fra-штаммов Y. pestis на разных по чувствительности биопробных моделях. Проконтролировать механизмы появления Fra^^ra^ и предложить приёмы, повышающие эффективность микробиологического и ПЦР-анализа при детекции изменённых вариантов возбудителя чумы.
Материалы и методы. Исследовали 21 штамм Y. pestis, антиген F1 у которых в реакции объёмной аггломерации (РАО) не выявлялся даже в титре
о л
10 м.к. (при титре 10 м.к. у контрольного дикого штамма Y. pestis 231). Штаммы выделены в различных отечественных и зарубежных очагах от природных носителей и больных людей. Бактерии выращивали на агаре
Хоттингера, рН 7.2, пигментсорбцию определяли посевом изолированных
2_|_
колоний после добавления в среду 0,01 % Конго-рот, Са -зависимость — после добавления 8 % 0,25М раствора MgCl2 и 4 % 0,5 М раствора оксалата натрия. Синтез пестицина 1 выявляли методом отсроченного антагонизма в слое
мягкого агара Хоттингера с индикаторными бактериями (^ pestis 337); коагулазную активность проверяли в плазме крови (фирмы Difco, ША) в соответствии с инструкцией. Скрининг плазмид выполняли по методу [11, с. 1366]. Свойства исследовали, как рекомендовано [5, с. 30]. Наличие антигена FV определяли в реакции коагглютинации (КоА) с авторским антительным диагностикумом согласно инструкции [1, с. 50]. Летальный эффект штаммов проверяли при подкожном заражении белых мышей (16—18 г) и морских свинок (180—190 г). В качестве биопробных испытали также монгольских песчанок, Meriones unguiculatus, сем. хомячковых (100—110 г) из питомника Ростовского НИПЧИ. Животных отбирали при достижении указанной весовой категории без учёта половой принадлежности. Выживших заражённых животных усыпляли хлороформом. Для идентификации вида культур и их детекции с помощью ПЦР использовали праймеры, комплементарные фрагментам хромосомы Y. pestis — 3а и у1ш12/^216 или только у1ш12/К216. Методики соответствовали авторским.
Праймеры для ПЦР-детекции генов са/1 (йэг-5’-
лсАлттлтаалсАлтааАллслтса-з ’; геу-5,-АлтталасаАл-
СААЛаАЛЛТССТа-З’) и cafR (for-5,-CCTCAACGCTGTGAAATCCTG-3,; геу-
5,-GTTACGATGTGGAGGTCATAAAA-3,) были сконструированы в ходе наших исследований на основе известных данных секвенса caf-оперона. Протяженность направляемых праймерами ампликонов была соответственно 267 и 192 п.н. Реакцию проводили в программируемом термостате «Терцик». Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле. Для ПЦР из взвеси клеток селезёнки, предположительно содержащих бактерии исследуемых штаммов, или из неидентифицированной бактериальной культуры, снятой с поверхности питательного агара, выделяли ДНК и обеззараживали её, как принято [6, с. 24]. Условия постановки ПЦР соответствовали авторским. Эксперименты выполняли, соблюдая требования режима работы с возбудителями I группы патогенности.
Результаты и обсуждение. Все бактерии формировали R-колонии и были полностью или частично чувствительны к диагностическому чумному бактериофагу. Большинство клеток их популяции экспрессировали связанный с вирулентностью признак пигментсорбции. Все штаммы обладали специфическим для вида Y. pestis антигеном FV [1, с. 49]. Автономная pFra плазмида, не обнаружена только у двух штаммов (1330 и С-393). Средняя (pCad, 47 Md, общая с Y. psdtbc) и минорная видоспецифическая (pPst, 6 Md) плазмиды выявлены у всех избранных штаммов при экспрессии соответственно зависимости роста от ионов Са2+ и продукции пестицина 1 и плазмокоагулазы. По результатам ПЦР с «хромосомными» специфическими для чумного микроба праймерами vlml2/IS2l6 и За все штаммы принадлежали к виду Y. pestis. Специфические ампликоны, содержащие 390 и 276 п.н., соответственно, были обнаружены во всех пробах.
После заражения мышей в дозах 103 и 10б м.к. (по 6 мышей на дозу) шесть штаммов оказались авирулентными. Гибель всех мышей вызывали бактерии
11 штаммов. Остальные четыре индуцировали падёж части мышей без корреляции с заражающей дозой. Срок жизни павших в среднем составлял 8—11 сут. Редко — 15 сут. При остром течении чумы у контрольных мышей (штамм 231 Fra+) они погибали через 3—5 сут. От всех павших мышей выделены культуры. Практически у всех культур, кроме контрольной (штамм 231 Fra+), в РАО F1 антиген не обнаружен, или результат был «сомнительный» (Fra±, 108 м.к.). Только у одной культуры после пребывания в организме мышей восстановился фенотип Fra+при титре антигена 107 м.к. (230—30 pFra::TnlO). Из двух штаммов, не имеющих плазмиды pFra в автономном состоянии, после пассажа через организм мыши у одного автономная плазмида 65 Md появилась, но без восстановления продукции F1. Возможно, ранее она была в интеграции с хромосомой [1б, с. 127]. У всех выделенных культур РАО на F1 антиген была отрицательной, а РКоА на FV антиген положительной. В ПЦР с праймерами vlml2/IS2l6 и ДНК выделенных культур синтезировались специфические для Y. pestis ампликоны 360 п.н.
А) В)
Рисунок 1. Некротические узлы в селезёнке (фрагмент органа) морских свинок, заражённых Fra штаммами Y. pestis.
А) — павшая на 30 сут. (№16К-1); В) — забитая в тот же срок (№252). Культуры Y. pestis выделены после повторного «отпечатка» селезёнки с рассевом материала фрагментом селезёнки по поверхности агара
Бактериями 15 Fra" культур от павших мышей заразили морских свинок
3 8
в дозах 10 и 10 м.к. (по 2 на дозу) Только часть штаммов вызывала гибель
о
морских свинок. Павшие были среди заражённых дозой 10 м.к. восьми исследуемых Fra-штаммов (И-2442-к, 252-2, 923-6, 923-10, 16К-1, 16К-4, 31а-7,
-5
4-908), а дозой 10 м.к. — только двух штаммов (4-908, 16К-1). Свинки погибали через 8—15 сут. (в контроле, штамм Fra+ 231, — 6—8 сут.). В единичных случаях они гибли в конце срока наблюдения (30 сут.). У многих павших были увеличены лимфоузлы в месте введения бактерий и в 2—3 раза селезёнка. У погибших в конце срока наблюдения в селезёнке обнаружили крупные некротические абсцессы (d=3—6 мм), чего не было у контрольных свинок (штамм 231), павших в короткие сроки (рисунок 1).
В ПЦР с праймерами vlm12/IS216 и ДНК из материала селезёнок обнаружены специфичные для Y. pestis ампликоны. Чистые культуры Y. pestis Fra- выделены от большинства биопроб. В поздние сроки отмечены случаи роста смешанных культур на месте отпечатков селезёнки. В ПЦР обнаружили ДНК Y. pestis, а чумной микроб выделяли только после повторных
дополнительных пересевов. Такого не было при исследовании биопроб погибших в ранние сроки. Возможно, это известная при чуме иммуносупрессия с активацией аутомикрофлоры свинок при затяжном течении инфекции. Исследовали также 20 выживших к концу срока наблюдения свинок на предмет сохранения у них Fra- бактерий чумы. У пяти в селезёнке обнаружены: увеличение размера, зернистости ткани, мелкие некротические очажки. В эмульсии ткани селезёнки в трёх пробах обнаружено присутствие ДНК Y. pestis. Эти результаты стимулировали более тщательные поиски бактерий возбудителя чумы. Выделены дополнительно три культуры. Они позитивно реагировали с чумным коагглютинационным диагностикумом на FV и в ПЦР с видоспецифическими «хромосомными» праймерами vlml2/IS2l6. Но в РАО антиген F1 у них не обнаруживали. Таким образом, через 30 сут. после заражения морских свинок нам удалось выделить от них культуры Fra-штаммов Y. pestis при отсутствии внешне заметных признаков заболевания. Эти сложности побудили нас испытать для биопроб монгольских песчанок, чувствительных к полноценным бактериям Y. pestis. Заражение их бактериями тех же Fra- штаммов в дозах 103 и 10б м.к. (по две песчанки на дозу) вызвало тотальную гибель животных в течение 3—5 сут. при гиперемии подкожной клетчатки и внутренних органов. Культуры выделены от всех животных.
Нами предприняты попытки определить причины дефектности исследованных Fra-штаммов. Практически все штаммы, полностью утратившие плазмиду pFra, в условиях наших опытов были авирулентны для биопробных животных. ПЦР праймеров caf1 и cafR с ДНК Fra-штаммов, лишённых плазмиды pFra, была отрицательной. У штаммов, сохранивших плазмиду и выраженную в разной степени вирулентность, обнаружены дефекты последовательности, комплементарной праймеру caf1 (144, 252-624, 16К-554, 2442-630), у одного (139) в последовательности фрагмента cafR, а у пятого (144) — в обоих фрагментах. Полученные нами результаты ПЦР-анализов не обнаружили явной связи локализации дефекта в caf-опероне и нарушения вирулентности. Но они свидетельствует об отсутствии единообразного
механизма повреждения caf-оперона при формировании Fra- вариантов Y. pestis и побуждают к проведению более детального ПЦР-анализа дефектных caf-оперонов.
Выводы.
1. Затяжное течение «бесфракционной» чумы у белых мышей и особенно морских свинок требует наблюдения за животными и исследования их органов в сроки, превышающие 14 сут., или обязательного тщательного исследования материала от всех выживших и забитых в более ранние сроки биопробных животных с применением ПЦР с праймерами на фрагменты стабильных генов.
2. Высокая чувствительность монгольских песчанок к Fra- штаммам Y. pestis облегчает анализ штаммов чумного микроба, подозрительных на дефектность продукции F1 антигена при использовании этих животных в качестве биопроб.
3. Доказана высокая эффективность ПЦР с парой праймеров vlml2for/IS2l6rev, комплементарных конститутивному специфическому для Y. pestis фрагменту хромосомы при детекции его вариантов с Fra-фенотипом in vitro и in vivo. Появление специфических ампликонов в ходе исследования культур или органов биопробных животных при сомнительных или отрицательных результатах бактериологических исследований и иммунотеста на F1-антиген требует дополнительных настойчивых поисков Fra- бактерий в пробе.
4. При детекции и идентификации Fra-бактерий вида Y. pestis можно использовать в качестве дополнительного теста ПЦР с предложенными нами праймерами на гены caf-оперона, при учёте только положительных результатов.
Список литературы:
1. Божко Н.В., Лебедева С.А., Лысова Л.К. и др. Изучение возможности конструирования чумного диагностикума для реакции коагглютинации на основе иммуноглобулинов к антигену «фракция V» и выяснение его диагностической ценности // Клиническая лабораторная диагностика. — 2006. — № 7. — с. 49—51.
2. Вариабельность возбудителя чумы и проблемы его диагностики: сборник научных трудов / ред. Ю.М. Ломов. — Ростов-на-Дону: «Антей», 2009. — 533 с.
3. Дроздов И.Г., Ежов И.Н., Самойлова С.В. и др. Оценка биологических свойств бескапсульных вариантов возбудителя чумы // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов, 1993. — Вып. 1—2. — с. 154—159.
4. Куклева Л.М., Проценко О.А. Современные представления о родстве возбудителей чумы и псевдотуберкулёза // Молекулярная генетика. — 2002.— № 1. — с. 3—7.
5. Лабораторная диагностика ООИ. Практическое руководство / ред. Г.Г. Онищенко. — М.: «Медицина» «Шико»; 2009. — 472 с.
6. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I—II группы патогенности. Методические указания МУ 1.3. 1794—09. — М.: Минздрав России, 2010.
7. Самойлова Л.В. Сравнительное изучение развития клинических форм экспериментальной чумы при аэрогенном и подкожном заражении вирулентными штаммами Y. pestis и их изогенными вариантами с различным плазмидным профилем // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов, 2008.— Вып. 3(97). — с. 66—67.
8. Способ идентификации штаммов вида Yersinia pestis и Yersinia pseudotubrculosis. Патент РФ № 2422535. С1 / А.Л. Трухачёв, Т.Е. Арсеньева, С.А. Лебедева, Л.П. Алексеева, Е.А. Васильева. — Опуб. 27.06.2011. — Бюл. № 18. Приоритет 11.01.2010 (in Russian).
9. Achtman M., Morelli G., Zhu P. et al. Microevolution and history of the plague bacillus, Yersinia pestis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2004. — Vol. 101 (51). — P. 17837—17842.
10. Chain P.S.G., Carniel E., Larimer F.W. et al. Insights into the evolution of Yersinia pestis through whole-genome comparison with Yersinia pseudotuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2004. — Vol. 101 (38). — P. 13826—13831.
11. Kado S.I., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacteriol. — 1981. — Vol. 145. — P. 1365—1367.
12. Karlishev A.V., Galyov E.E., Abramov V.M. et al. Caf1R gene and its role in the regulation of capsula formation of Yersinia pestis // FEBS Lett. — 1992. — Vol. 305. — № 1. — P. 37—40.
13. Motin V.L., Georgescu A.M., Elliott J.M. et al. Genetic variability of Yersinia pestis isolates as predicted by PCR-based IS 100 genotyping and analysis of structural genes encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase (glpD) //J. Bacteriol. — 2002. — Vol. 184. — P. 1019—1027.
14. Parkhill J., Wren B.W., Tompson N. et al. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague // Nature. — 2001. — Vol. 413 (6855). — P. 523—526.
15. Prentice M.B., James K.D., Parkhill J. et al. Yersinia pestis pFra show biovar-specific differences and recent common ancestry with a Salmonella enterica serovar Typhi plasmid // J. Bacteriol. — 2001. — Vol. 183. — P. 2586—2594.
16. Protsenko O.A., Filippov A.A., Kutyrev V.V. Integration of the plasmid encoding the synthesis of capsular antigen and murine toxin into Yersinia pestis chromosome // Microb. Patholog. — 1991. — Vol. 11. — P. 123—128.
17. Radnedge L., Agron P.G., Worsham P.L. et al. Genome plasticity in Yersinia pestis // Microbiology. —2002. — Vol. 148. — P. 1687—1698.
