CC BY
34
УДК 579.842.23:577.1:579.61
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛЕВОЧЬЕЙ (РАМНОЗОПОЗИТИВНОЙ) РАЗНОВИДНОСТИ БАКТЕРИЙ ВИДА YERSINIA PESTIS
© 2007 г. С.А. Лебедева, В.С. Иванова, А.Л. Трухачев
The review contains data on a history of revealing by the rhamnose-positive variety of the causative agent of plague (Yersinia pes-tis). The brief characteristic of the corresponding natural focuses, including located on territory of Southern Federal region is given. The diversity of properties between of strains of "Microtus" and classical strains of the causative agent of plague are listed. The researches of evolutionary divergence of Y.pestis strains, necessity of precise criteria for intraspecific differentiation, and also a degree of danger of original rhamnose-positive strains for human is discussed.
Современный уровень знаний генетики, молекулярной биологии, биохимии и биологии возбудителя чумы (Yersinia pestis), а также биологии и географии его носителей и переносчиков позволил сформулировать положение о поэтапном эволюционном процессе развития чумного микроба и генезисе его очагов. Прежде всего, следует отметить формирование первичного прародителя микроба чумы из микроба псевдотуберкулеза, предполагаемое на основе данных молекулярно-генетического анализа геномов этих микроорганизмов [1]. Последующее приобретение высокомолекулярной плазмиды от Salmonella enterica serovar Typhi в дополнение к плазмиде, общей с псевдотуберкулёзным микробом, и её перестройки в новом хозяине обеспечили вновь зарождающийся вид специфическим высокомо-
лекулярным автономным репликоном, способствующим реализации оригинальных патогенных свойств. Затем продолжающая изменчивость микроба и его селекция в организме специфических носителей обусловили «совершенствование» микроба как возбудителя чумы грызунов. На этом же этапе микроб приобретает третью, самую низкомолекулярную, тоже специфическую для него плазмиду, и продолжается формирование вариантов возбудителя, стабильно различающихся по некоторым другим признакам. Образование первичных очагов в Евразии, где обитали дикоживущие древние грызуны-носители и кровососущие переносчики, в последующем привело к транслокации возбудителя в Африку, Южную и Северную Америку. Он не проник только в природные очаги Австралии. Расширение зон
персистенции возбудителя способствовало образованию локальных мезочагов и периодическому переходу возбудителя на новых хозяев, а затем и на человека. Различную систематическую принадлежность основного носителя возбудителя чумы считают важнейшим фактором, влияющим на формирование его свойств и дивергенцию вида. Особенности обмена веществ у спящих и бодрствующих зимой животных-носителей, меняющийся температурный режим их организма в разные периоды года и в различных климатических поясах, специфика иммунной системы, резкое изменение свойств среды обитания микроба при переходе его из теплокровного микроорганизма во внешнюю среду (в блох и других кровососущих, в почву, гнёзда и т.п.) и обратно - всё это эффективные факторы, влияющие на фенотип микроба чумы. В результате их воздействия на фоне различных генетических процессов в геноме возбудителя могли возникнуть популяции бактерий Y.pestis, определённым образом отличающиеся друг от друга, которые представляют известные на сегодняшний день разновидности.
Yersinia pestis привлекает внимание исследователей в связи с её способностью вызывать у человека тяжелейшее контагиозное эпидемически опасное заболевание чумой, хотя сам человек является для микроба случайным носителем. Микробиология возбудителя чумы началась с момента выделения культур от больных и умерших от чумы людей. И за классический образец возбудителя были приняты выделенные от человека штаммы со всеми их основными диагностическими признаками и особенностями. Дальнейшие поиски микроба чумы позволили обнаружить природные источники инфекции, носителей, переносчиков, пути распространения и очаги персистенции возбудителя. Сообщения о фактах значительной вариабельности возбудителя по некоторым диагностическим признакам и характеристики разновидностей микроба тоже основывались на свойствах штаммов, опасных для человека, выделенных от людей в зонах, где заболевания людей регистрируются неоднократно. Это позволило обособить варианты возбудителя чумы в рамках сурочьей, сусликовой, песчаночьей и крысиной разновидностей, принадлежность к которым определялась с помощью набора признаков и основного грызуна-носителя в конкретном очаге. Для штаммов, выделенных от больных или умерших людей, помимо признаков, присущих большинству штаммов вида Y.pestis, как правило, характерна неспособность ферментировать рамнозу. Этот признак долгое время считался отличительным при дифференциации похожих возбудителей чумы и псевдотуберкулёза. Среди штаммов чумного микроба от грызунов и их блох были обнаружены значительные массивы рамнозопози-тивных штаммов, по ряду признаков отличающихся от классических рамнозонегативных образцов. Основными носителями этих штаммов зарегистрированы различные полевки, а в некоторых природных очагах пищухи, а также их эктопаразиты.
Известно, что некоторые виды полевок в отдельных местах ареалов их распространения играют роль
основных носителей бактерий Y.pestis. Вместе со своими блохами они способны поддерживать размножение микроба вида Y.pestis и сохранять локальные инфицированные очаги в длинном ряду поколений грызунов. Из 109 современных видов полевок, обитающих в Евразии и в Северной Америке (Калифорния), более чем у 13 в естественных условиях обнаружена чума [2]. Наименее чувствительными к ней являются полёвки Брандта и афганские. Наиболее чувствительными - обыкновенная и общественная, а остальные занимают промежуточное положение [3]. В большинстве известных очагов полевочьего типа ведущую роль в эпизоотии чумной инфекции играют полевки рода Microtus: обыкновенная, узкочерепная, кустарниковая, арчевая, Брандта, серебристая, калифорнийская. Вовлекаются и плоскочерепные полёвки. Полевочьи природные очаги чумы занимают особые районы в пределах высокогорья, а именно среднего-рье. Они локализованы на небольших территориях ареалов обитания полевок, пищух и других мелких и мышевидных грызунов [4]. В них сложились особые закономерности эпизоотий. Последние протекают вяло и длительно. Наиболее известные автономные природные очаги чумы, где основными носителями бактерий чумы являются полевки, пищухи и другие мелкие грызуны, перечислены в таблице.
Считают, что здесь сформировался свой тип возбудителя чумы, во многом отличающийся от классического. В зоне Кавказа полёвочьи очаги обнаружены на территории высокогорья Армении, Азербайджана, Грузии и в высокогорных зонах Дагестана в Российской Федерации. Исследование показало [5] циркуляцию оригинальных штаммов, существенно отличающихся от «полёвочьих» штаммов из других природных географических очагов.
Впервые заболевание полевок чумой обнаружил А.М. Скородумов в 1928 г. [6]. Позже чума зарегистрирована другими исследователями, и показана рам-нозопозитивность штаммов возбудителя [7, 8]. Осенью 1958 г. чумная эпизоотия среди полёвок обнаружена в зонах высокогорья Кавказа. Установлено, что штаммы чумного микроба от полевок, описанные различными исследователями в разных очагах, обладали как типичными, так и оригинальными свойствами. Сумма сведений о сходстве бактерий Y.pestis, выделенных от разных полевок, позволила М.И. Леви [9] утвердить самостоятельность «полевочьей» разновидности. Таким образом, была продолжена градация вида Y.pestis на сурчиную, сусликовую/песчаночью, крысиную и «полевочью» разновидности [10], которые по свойствам соответствуют предложенным за рубежом биоварам vv. antiqua, mediaevalis, orientalis [11]. «Полёвочьи» штаммы китайские специалисты недавно предложили выделить в отдельный четвёртый биовар «microtus» (полёвочий) [12]. По сути, это - повторение заключения М.И. Леви, сделанного в 1961 г., о наличии особой «полёвочьей» разновидности и подтверждение его справедливости. Критерий принадлежности бактерий чумы к «полевочьей» разновидности: способность ферментировать рамнозу (признак,
характерный для близкородственного возбудителя псевдотуберкулёза) и снижение или отсутствие вирулентности избирательно для морских свинок.
В последнее время в связи с внедрением приёмов анализа ДНК интерес к «полёвочьим» штаммам у нас в стране и за рубежом резко возрос. Пока окончательного согласованного решения о таксономическом положении этих обособленных штаммов не принято, но исследования проводятся всё более интенсивно. У нас в стране они направлены на детализацию характеристик штаммов с целью доказать правомерность разделения рамнозопозитивных штаммов чумного микроба на дополнительные подвиды в соответствии с географическим расположением очагов и особенностями характеристик (altaica, hissarica, talassica, ulegeica, caucasica). За рубежом они включают сравнительный анализ геномов для решения вопроса о правомерности их включения в вид Y.pestis и очерёдности эволюционного возникновения различных групп рамнозопозитивных штаммов. Ранее у нас в стране было предложено [13] выделить рамнозопозитивные «полёвочьи» штаммы из вида Yersinia pestis в отдельный вид Yersinia pestoides. Предложение у нас не было принято, но за рубежом, с учётом его, «полёвочьи» штаммы условно сейчас отнесены к группе «Pestoides».
В процессе длительного наблюдения за «поле-вочьими» очагами были выявлены основные признаки, которые в сумме могут отличать штаммы «поле-
Характеристика очагов распространения штаммов У .pestis «полёвочьей» разновидности (по данным цитированных работ)
вочьей» разновидности от классических штаммов Y.pestis, выделяемых от других грызунов, верблюдов и людей. Кроме рамнозопозитивности и избирательной вирулентности, включающей авирулентность для большей части основных носителей возбудителя чумы (серых сурков, малых и малоазийских сусликов, больших песчанок и крыс [5, 14], а также лабораторных морских свинок, [7]), обнаружены и другие. Гомогенность популяций штаммов по рамнозопозитивности у «полевочьих» штаммов коррелирует со способностью утилизировать мелибиозу [15], которая рассматривается как их генетическая метка. Установлена чувствительность к пестицину 1, к собственному и/или гетерологичному, независимо от того, способны эти штаммы продуцировать его или нет. У штаммов от полёвок в зоне Кавказа обнаружена повышенная чувствительность к бактерицидному действию нормальной сыворотки [16]. Оригинальные питательные потребности «полёвочьих» штаммов превышают характерные для классических рамнозонегативных штаммов. «Полёвочьи» штаммы из очагов Кавказа имеют уникальные потребности по сравнению со штаммами из других очагов. Гены, соответствующие ауксотрофности у «полевочьих» штаммов, видимо, имеют значительные дефекты, поскольку, по данным литературы, получить у них «гипотрофные» варианты по отдельным аминокислотам весьма проблематично. Из популяций классических штаммов Y.pestis
№ п/п Наименование очага Основной носитель Сопутствующие носители
1 Закавказский высокогорный (Ленинаканский, Присеванский, Зангезурокарабахский, Джавахатский хребет) Полёвка обыкновенная Мышь лесная
2 Закавказский горный (Дагестан, Кокмадатский участок) Полёвка обыкновенная Мышь лесная, полёвка водяная
3 Забайкальский (граница с Монголией) Пищуха даурская, полёвка Брандта Полёвка стадная
4 Горно-Алтайский (сев. окраина Салюгемского хребта, Южно-Чуйский хребет) Пищуха монгольская Пищуха даурская, пищуха алтайская, хомячок джунгарский
5 Горно-Алтайский (Таджикистан, Дарвазо-Гиссарский хребет) Полёвка арчовая Мышь лесная, соня лесная
6 Северо-Восточная Монголия, пустыня Гоби, Баян-Улэгейский аймак Пищуха монгольская Не указан
7 Тянь-Шаньский. Таласский хребет, Беш-Ташский участок Полёвка серебристая Сурок красный
8 Северная Америка, Зап. Калифорния, горный район Сан-Бруно Полёвка калифорнийская Не указаны
удается селекция даже полных прототрофов, хотя и с очень низкой частотой [13].
Штаммы «полёвочьей» разновидности оригинальны и по отношению к некоторым бактериофагам. Они чувствительны к бактериофагу М1, тогда как штаммы сурчиной, сусликовой, песчаночьей и крысиной разновидности к нему устойчивы [17]. В пробах с R-специфиче-скими полигостальными фагами FP1 и FP3 при 26 оС рамнозонегативные «классические» штаммы Y.pestis лизировались обоими фагами. При 37 °С -только фагом FP3, и лизис был выражен слабее. Штаммы «полевочьей» разновидности вели себя иначе [18]. Ведутся поиски бактериофагов, избирательно действующих на отдельные группы «поле-вочьих» штаммов.
Штаммы «полёвочьей» разновидности зачастую отличаются от классических рамнозонегативных увеличенной молекулярной массой (М.м.) тяжёлой плаз-миды, которая отвечает за продукцию видоспецифи-ческого капсульного антигена F1 и «мышиного» токсина. Стабильно этот признак обнаружен у кавказских штаммов. М.м. самой тяжёлой плазмиды у них около 90 МД, при 65 МД у классических штаммов. В её составе обнаружены дополнительные вставки ДНК, в частности фрагменты 1та-оперона энтеробактерий [19]. У них также отсутствует (штаммы из кавказских очагов) или имеет увеличенную М.м. низкомолекулярная плазмида пестициногенности [20 - 22].
К другим дифференциальным признакам бактерий «полёвочьей» разновидности могут быть отнесены их способность дезаминировать аспартат [23], активность изоцитратлиазы и оксидазы фенилаланина и триптофана [24]. Этим они отличаются от классических рамнозонегативных штаммов чумного микроба и похожи на бактерии возбудителя псевдотуберкулёза. Число отличительных признаков растёт по мере изучения штаммов.
Вопрос об особой таксономической позиции штаммов «полевочьей» разновидности поднимался уже во время первоначальных дискуссий по их поводу. Ещё в 1964 г. до внедрения методов анализа структуры ДНК отечественными исследователями было высказано предположение о промежуточной позиции «полевочьих» штаммов между возбудителями чумы и псевдотуберкулёза. Известно, что нук-леотидный состав ДНК является в высокой степени близким у штаммов «полевочьей» разновидности и классических рамнозонегативных штаммов Y.pestis. Однако в микробиологических тестах по отдельным признакам установлено выраженное сходство именно «полёвочьих» штаммов с возбудителем псевдотуберкулеза. В сумме это подтверждает широко известное близкое родство двух видов, но свидетельствует о гораздо меньшей дистанции от «полёвочь-их» штаммов до классических Y.pestis, чем до Y.pseudotuberculosis. В то же время, по данным числовой таксономии, «полевочьи» штаммы из очагов Кавказа имеют лишь 75 % подобия с типичными штаммами других разновидностей, вызывающих классическую чуму людей [13]. Отличия «полёвочь-их» штаммов Y.pestis от представителей других разновидностей установлены по результатам генодак-тилоскопического анализа ДНК различных штаммов с помощью ВХ зонда (повторяющиеся фрагменты Ш элемента) [25]. Изучение УКТЯ-генотипа по (СА-АА).п локусу показало, что кавказские «полевочьи» штаммы имеют в среднем в 2 раза меньше повторов, чем сурчиные (var. antiqua), песчаночьи и сусликовые (var. mediaevalis) штаммы, принадлежащие к классическим представителям Y.pestis [26].
Схему взаиморасположения различных групп «по-лёвочьих» штаммов чумного микроба на эволюционном «дереве» пытались определить с помощью ПЦР, используя данные о расположении и кратности повторов Ш285, 18100 и тандемных повторов [27]. Судя
по результатам, «полёвочьи» штаммы из Закавказья более древние и являются промежуточным звеном между возбудителями чумы и псевдотуберкулёза. Правда, недавно [27] по результатам мультилокусного УЫТК анализа было высказано предположение о локализации штамма Pestoides G8687 («полёвочий» штамм из Грузии) между var. antiqua и var. mediaeva-lis. И это несколько отличается от выводов предыдущей работы. По другим данным, согласно результатам анализа DFR-локусов, от возбудителя псевдотуберкулёза сначала отщепился клон var. antiqua, давший начало клонам родоначальникам классических форм чумного микроба и некоторым группам «полё-вочьей» разновидности (в оригинальной работе «группам Pestoides А, В и D»), а затем другие группы «полёвочьих» штаммов (Pestoides E, G, F) и другие разновидности [28]. Пока ещё трудно составить окончательное мнение о ступенях эволюции возбудителя чумы с учётом всех известных вариантов Ypestis. Однако всё чаще высказывается мнение о том, что «по-лёвочьи» штаммы кавказского региона, впервые обнаруженные в зоне высокогорья Армении, находятся на промежуточной позиции между классическими вариантами Y.pestis и Y.pseudotuberculosis и являются отражением первого этапа становления бактерий возбудителя чумы как вида. При рассмотрении этого этапа эволюции иерсиний возникает вопрос, каким образом и какие исторические катаклизмы «забросили» возбудителя псевдотуберкулёза в высокогорные альпийские зоны для контакта с полёвками? Как он там встретился с возбудителем брюшного тифа, кишечного иерсиниоза и другими энтеробактериями, у которых «позаимствовал» некоторые фрагменты генома для превращения в бактерии чумы? Если же всё это произошло в умеренно-равнинных местах обычного сосуществования этих микроорганизмов, то каким образом природный рекомбинант попал к полёвкам высокогорья, а потом «спустился» оттуда уже в виде возбудителя чумы людей? Может быть, это самостоятельное ответвление на пути эволюционного развития вида или определённый тупик, малоопасный для людей. Решение этих вопросов, если оно возможно, - дело будущего. Но сейчас, на данном этапе, совершенно очевидна разнородность вида Y.pestis и обособленность штаммов, выделенных от полёвок и пищух. Это в значительной мере определяется существенными отличиями геномной структуры.
В связи с «избирательной» вирулентностью «по-лёвочьих» штаммов интересен вопрос об их вирулентности для людей, а также корректная оценка их роли как этиологического агента классической чумы людей, имеющей эпидемиологическую значимость. По имеющимся сведениям [13], в Закавказье не зарегистрировано ни одного заболевания людей, вызванного штаммами, по совокупности свойств относящихся к «полёвочьим». Аналогичное сообщение сделано об алтайских «полевочьих» (пищуховых) штаммах [29]. Имеется также сообщение об отсутствии заболевания людей в «полёвочьих» очагах Китая [30]. Нами были исследованы 50 штаммов Y.pestis, выделенных
от людей в разное время в различных очагах мира. Не обнаружено ни одного штамма со свойствами, характерными для «полевочьей» разновидности чумного микроба [21, 31]. Недавно были опубликованы результаты опытов на добровольцах по исследованию вирулентности штаммов, выделенных от полевок Брандта в Монголии [32]. Показано, что эти штаммы, вирулентные для мышей, но не для морских свинок, неспособны вызывать чуму у людей. Авторы полагают, что «полевочьи» штаммы эпидемически безопасны, а поэтому нецелесообразно проводить эпидмеро-приятия и истребработы в зонах, где распространены подобные штаммы. Эта проблема требует детального исследования, и для нашего южного региона она не утрачивает своей актуальности, поскольку очаги подобного типа активны на территории Дагестана, и нам необходимо знать о них больше, поскольку контроль над чумой очень важен в наше сложное и беспокойное время.
Всё изложенное выше определяет необходимость дифференциального подхода к виду Y.pestis и требует продолжения углублённых исследований в этом плане для решения вопроса о правомерности отнесения оригинальных рамнозопозитивных штаммов, выделенных в очагах, где обитают полёвки, лесные мыши, пищухи и другие мелкие чувствительные грызуны, к виду бактерий, вызывающих классическую чуму людей, способную к эпидемическому распространению.
Литература
1. Achtman М. et al. И PNAS. 1999. Vol. 96. № 24. P. 14043-14048
2. Кучерук B.B. // Фауна и экология грызунов. М., 1965. Вып. 7. С. 5-86.
3. Петров ПЛ., Эйгелис Ю.К., Адамян А.О. II Особо опасные инфекции на Кавказе. Ставрополь, 1966. С. 143-146.
4. Слудский А.А. Природные очаги чумы полевочьего типа (структура и функционирование): Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Саратов, 1998.
5. Ананян Е.Л., Юндин Е.В. II Особо опасные инфекции на Кавказе. Ставрополь, 1966. С. 25-26.
6. Скородумов А.М. // Очерки по эпидемиологии чумы в Забайкалье и Монголии. Верхнеудинск, 1928.
7. Клец Э.И. // Изв. Иркутск, противочумн. ин-та Сибири и ДВ. 1934. Т. 1.С. 41-42.
8. Некипелов Н.В. Эпизоотология чумы в Забайкалье и Монголии // Докл., представлен. на соискание учен. степ. д-ра биол. наук по совокупности опубликов. работ. Иркутск, 1962.
9. Леей МИ. и др. // Тр. Ростовск. н/Д науч.-исслед. противочумн. ин-та. 1961. Т. 18. С. 3-23.
10. Туманский В.М. Микробиология чумы (Микробиологические основы диагностики чумы). 2-ое изд., дополн. М.,
1968.
11. Devignat R. // Bull. Wld. Hlth Org. 1951. Vol. 4. № 2. P. 839.
12. Zhou D. et al. // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186. № 15. P. 5147 -5152.
13. Мартиневский И.Л. Биология и генетические особенности чумного и близкородственных ему микробов. М.,
1969.
14. Темиралиева Г.А., Казакбаева Р.А., Давлетов Н.Д. // Тез. науч. конф. противочумного учреждения Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1979. С. 161-165.
15. Тимофеева Л.Ф. и др. // Особо опасн. инф. в Сибири и на ДВ. Кызыл, 1966. С. 112.
16. Гвозденко НА. и др. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1992. № 11-12. С. 8-10.
17. Гольдфарб Л.М. и др. // Генетика и микробиология при-родно-очаговых инфекций. Саратов, 1984. С. 10-13.
18. Балахонов С.В. и др. // Актуальные аспекты природно-очаговых болезней: Материалы межрегион, науч.-практ. конф. к 80-лет. Омского НИИПИ. Омск, 2001. С. 170-172.
19. Golubov F. et al. II Infect. Immun. 2004. Vol. 72. № 10. P. 5613-5621.
20. Балахонов С.В. // Молекулярная генетика, микробиол., вирусол. 1989. №4. С. 39-42.
21. Иванова B.C. и др. // Молекулярная генетика, микробиол., вирусол. 1990. № 3. С. 16-18.
22. Филиппов А.А. и др. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1992. № 3. С. 10-13.
23. Меринов С.П., Рудник В.С., Миронова Л.П. // Проблемы природной очаговости чумы. Иркутск, 1980. Ч. 2. С. 66-67.
24. Куклева Л.М. и др. // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 2001. № 1(81). С. 105-110.
25. Горшков О.В. Геномный полиморфизм коллекционных штаммов Yersinia pestis.: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Саратов, 2000.
26. Сучков ИЮ. и др. //Молекулярная генетика, микробиол. и вирусол. 2002. №4. С. 18-21.
27. Pourcel М.В. et al. И ВСМ Microbiology. 2004. Vol. 4. №22. P. 1-17.
28. Radnedge L. et al. // Appl. Environment. Microbiol. 2001. Vol. 67. № 8. P. 3759-3762.
29. Тарасова B.E. // Проблемы природной очаговости чумы. Иркутск, 1980. Ч. 1. С. 36-38.
30. Dongzheng Yu. Zhang Wei, Ma Ye // Ned.Tijdschrift Voor Medische Microbiologie. 1998. Vol. 6. Suppl. II: Abstr.7th In-tern.Congr. on Yersinia. S. 42. P-127.
31. Лебедева С.А. и др. // Актуальные проблемы эпидемиол. безопасности: Материалы юбил. конф., посвящ. 50-летию Ставропольского противочумн. ин-та. Ставрополь, 2002. С. 147-149.
32. Zhenya F. et al. // Ned. Tijschrift Voor Medische Microbiologie. 1998. Vol. 6. Suppl. II: Abstr. 7th Intern. Congr. on Yersinia. S. 42. P-127.
Ростовский научно-исследовательский противочумный институт_12 декабря 2006 г.
