CC BY
38
•УДК 616.981.452:636.91 , '
Д.В.Печенкин1, А.А.Бывалов2, И.В.Маракулин’уБ-А.Шабалин1, К.Е.Гаврилов1
ВЛИЯНИЕ КАПСУЛЫ YERSINIA PESTIS НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МОРСКОЙ СВИНКИ
'Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ, Киров; Институт физиологии Коми
НЦ УрО РАН, Сыктывкар
Изучались процессы фагоцитоза перитонеальными макрофагами морских свинок бактерий возбудителя псевдотуберкулеза, геном клеток которых различался лишь наличием (штамм 164/84 pBR328-Fra) или отсутствием (штамм 164/84 pBR328) fra-оперона Y. pestis, ответственного за признак капсулообразования. Наличие у Yersinia pseudotuberculosis капсулы чумного микроба является 'ингибирующим фактором в отношении фагоцитарной активности макрофагов как интактных, так и иммунизированных чумной вакциной EV животных. Наиболее интенсивно фагоцитоз протекает при использовании фагоцитов иммунных животных с бактериями рекомбинантного штамма возбудителя псевдотуберкулеза, не синтезирующими капсульный антиген F1 чумного микроба. ..
Активность макрофагов играет ведущую роль в развитии и исходе многих инфекционных заболеваний. В связи с этим культура макрофагов применяется in vitro как экспериментальная модель для решения широкого ряда микробиологических, иммунологических, химиотерапевтических вопросов [1]. Исход взаимодействия клеток возбудителя Y. pestis с фагоцитами зависит от степени бактерицидной активности макрофагов и наличия антифагоцитар-ных факторов у микробов. К антифагоцитарным субстанциям Y. pestis относят в первую очередь капсульный антиген F1 [2, 5].
Целью работы являлось изучение процессов фагоцитоза перитонеальными макрофагами морских свинок микробов рекомбинантных штаммов Y. pseudotuberculosis в зависимости от их способности продуцировать капсульный антиген FI возбудителя чумы.
Материалы и методы
Объектом исследования были популяции изо-генных рекомбинантных штаммов Y. pseudotuberculosis. Fra-оперон резидентной плазмиды чумного микроба, детерминирующий биосинтез капсульного антигена F1, был передан в составе рекомбинантной плазмиды pBR328-Fra в клетки псевдотуберкулезного микроба штамма 164/84 методом трансформации [31]. Референс-вариантом являлись клетки указанного выше реципиента, содержащие рекомбинантную плазмиду pBR328 и не продуцирующие капсульного антигена F1 чумного микроба.
Наличие рекомбинантных плазмид в бактериях полученных трансформантов подтверждено методом электрофореза очищенных препаратов плаз-мидной ДНК: на электрофореграммах выявлялись полоски, соответствующие по электрофоретической подвижности контрольным препаратам ДНК pBR328-Fra (-9,2 мД) или pBR328 (-3,2 мД).
Определение продукции антигена F1 культурами рекомбинантного штамма Y. pseudotuberculosis 164/841 (pBR328-Fra) осуществляли с помощью реакции диффузионной преципитации в агаре (РДП). Содержание антигена F1 в исследуемых культурах составляло 1024^t096 антигенных единиц (АЕ). Численное значение этого показателя соответствует
обратной величине титра искомого антигена, определенного с помощью РДП в суспензии, которая содержит в 1 мл 10"м.к. по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
При постановке РДП использовали специфическую кроличью сыворотку против антигена F1.
Наличие капсулы у бактерий рекомбинантного штаммац Y. pseudotuberculosis 164/84 (pBR328-Fra) выявляли микроскопическим методом тушевого контрастирования. В качестве контроля использовали бактерии вакцинного штамма EV Y. pestis и бактерии штамма 164/84 (pBR328), выращенные при температуре 36-38 °С. Вокруг бактерий рекомбинантного штамма 164/84 (pBR328-Fra) Y. pseudotuberculosis и контрольного штамма EV Y. pestis выявлялась. специфическая капсула, сформированная, как предполагается, F1-антигеном чумного микроба. Бактерии рекомбинантного штамма 164/84 (pBR328) такой капсулы не имели.
Микроорганизмы выращивали в течение 48 ч при температуре 36-38 °С на плотной питательной среде, приготовленной на основе перевара Хоттин-гера (pH 7,2). Фагоцитоз изучали in vitro в культуре перитонеальных макрофагов, полученных от интактных I морских свинок и иммунизированных подкожно однократно живой чумной вакциной EV (ли-ния НИИЭГ) в дозе 106 м.к. [1, 4].
Для:;получения макрофагов животным вводили внутрибрюшинно 10 мл мясопептонного бульона. Через 3 |'Дня, когда популяция клеток экссудата в брюшной полости на 80-90 % состояла из макрофагов, животных умерщвляли хлороформом, брюшную полость промывали 20 мл жидкости специального состава: 80 % раствора Хэнкса с гепарином (5 ед/мл) и 20 % инактивированной нагреванием сыворотки крови кроликов. Макрофаги культивировали на покровных стеклах (18x18 мм) при температуре 36-38 °С в течение 30 мин. Посевная доза перитонеальных макрофагов составляла 4 млн клеток. Покровные стекла с осевшими на них макрофагами переносили в бюксы и наслаивали на них суспензию бактерий Y. pseudotuberculosis (100 млн м.к. в 0,5 мл раствора Хэнкса). Таким образом, в опытах с фагоцитами нагрузка составляла 25 м.к. на макрофаг. Бюксы инкубировали при температуре 36-38 °С в течение 1,5 ч. В мазках, окрашенных по Ро-
мановскому-Гимза, определяли количество бактерий, фагоцитированных одним макрофагом (фагоцитарное число - ФЧ) и количество макрофагов, фагоцитировавших тест-микробы (индекс фагоцитоза-ИФ) [6].
Результаты и обсуждение
В результате проведенных экспериментов установлено, что в опытах с бактериями 164/84 (рВЯ328-Рга) У. рхеис1о1и.Ьегси1о.ч1з, продуцирующими капсульный антиген Р1 чумного микроба, значения ФЧ и ИФ (р<0,05) были достоверно ниже, чем с микробами рекомбинантного штамма 164/84 (рВ 11328), не имеющими капсулы У. Такая
закономерность выявлялась в опытах с макрофагами и интактных, и иммунизированных морских свинок. Так, количество фагоцитированных микробов штамма рВ11328-Рга макрофагами интактных морских свинок составляло 2,28±0,72, не продуцирующих капсульного антигена И1 - (6,411,07) клеток на один фагоцит; в опытах с макрофагами иммунных животных - (2,99±0,52) и (8,83±]*14) м.к. соответственно. Схожие результаты наблюдаются и при анализе фагоцитарного индекса (таблица).
Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов в отношении клеток У. ряеиёоШЬегси^з, способных и не способных продуцировать капсульный антиген И чумного микроба
Наличие (+)■ или отсутствие (-) fra-оперона в клетках Y. pseudo-tuberculo-■ sis Фагоцитарное число - количество микробных клеток на один фагоцит, ^апиАм. 195» Л = 10 Фагоцитарный индекс - % фагоцитирующих клеток, Харифм, i Iy5i П = 10
Макрофаги интактных животных Макрофаги иммунизированных животных Макрофаги интактных животных Макрофаги иммунизированных животных
(+) 2,28±0,72‘ 2,99±0,52‘ 71,74+9,66"' 81,97±5,19*
(-) б,40±1,07". 8,83+1,14 ' 95,38±7,15 ' 100
Примечания: ‘ различие достоверно (р<0,05) по сравнению с микробами, не имеющими капсулы; " различие достоверно (р<0,05) по сравнению с перитонеальными макрофагами иммунизированных морских свинок.
Полученные данные свидетельствуют об ингибирующей роли капсулы У. резйз на фагоцитарную активность макрофагов в отношении клеток 164/84 (рВЯ328-Рга) У. рзеис1о1иЬегси1о.ч1з, а именно на звено захвата бактерий.
Более высокие значения фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов иммунизированных морских свинок по отношению к клеткам интактных животных служат доказательством эффективной иммунологической перестройки макроорганизма.
Наиболее интенсивно фагоцитировались перитонеальными макрофагами иммунизированных животных бактерии рекомбинантного штамма 164/84 (рВЯ328) псевдотуберкулезного микроба, не продуцирующие капсульного антигена Р1: ФЧ составляло (8,83±1,14) м.к. на один фагоцит, ФИ - 100 %. Этот факт можно объяснить как отсутствием ингибирующего действия капсулы у микробов названного
штамма, так и стимулирующим действием иммунизации живой чумной вакциной EV на процессы фагоцитоза.
Роль капсульного антигена в процессах фагоцитоза, по данным литературы, неоднозначна. Кроме того, реализация патогенных свойств У. pestis требует присутствия у возбудителя чумы целого набора факторов патогенности различной функциональной направленности. Механизм антифагоци-тарной активности F1 на модели in vitro может заключаться в экранировании им пептидогликана или липополисахарида бактериальной клетки, где располагаются рецепторы адгезии [7].
Выводы
Включение в клетки У. pseudotuberculosis fra-оперона чумного микроба, ответственного за синтез капсульного антигена, существенно влияет на процессы фагоцитоза перитонеальными макрофагами морской свинки. Наличие у У. pseudotuberculosis капсулы чумного микроба является ингибирующим признаком в отношении фагоцитарной активности (процесс захвата) перитонеальных макрофагов как интактных, так и иммунизированных чумной вакциной EV животных. Специфическая иммунизация животных приводит к интенсификации захвата макрофагами псёвдотуберкулезных микробов, в большей степени лишенных fra-onepoHa У. pestis.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Васильева Г.И., Пустовалов B.JI.//Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1977. - Вып. 6 (58). - С. 34-37. -
2.Гребцова Н.Н., Чернявская А.С., Лебедева С.А., Иванова B.C. // ЖМЭИ. - 1990. - № 5. - С. 7-11. -
3. Дармов И.В., Маракулин И.В., Янов С.Н. и др. // Биотехнология. - 1992. - №6. - С. 59-62. - 4. Кроткова М.Р. // Лаб. дело. - 1971. - № 7. - С. 421-423. - 5. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И .Г: Иммунология чумы. - Саратов, 1992. - 173 с. - 6. Пустовалов В.Л., Васильева Г.И., Киселева А.К.//Патол. физиол., иммунитет и аплергол. особо опасных инф. - Саратов, 1984. - С. 8-12. -7.Du Y<", Rosqvist R., Forsberg A. // Infect. .Immun. -2002. - Vol. 70, N 3. - P. 1453-1460.
D.V.Pechenkin, A.A.Byvalov, I.V.Marakulin, B.A.Shabalin, K.E.Gavrilov
Effect of Yersinia pestis Capsule upon Phagocytic Activity of Peritoneal Macrophages in Guinea Pigs
Microbiology Research Institute of the Russian Federation, Kirov;
Physiology Institute of Komi SC, UD of RAS, Syktyvkar
The authors studied the processes of phagocytosis by Guinea-pig peritoneal macrophages of Yersinia pseudotuberculosis bacteria whose genomes differed from each other only by the presence (strain 164/84 pBR328-Fra) or absence (strain 164/84 pBR328) of Y. pestis fra operon responsible for capsule formation. The presence in Y. pseudotuberculosis of the plague-agent capsule was,found to be a factor inhibiting the macrophage phagocytic activity both in intact animals and those immunized with EV plague vaccine. The most intensive phagocytosis was observed when the phagocytic cells were taken from immune animals and used with recombinant Y. pseudotuberculosis bacteria incapable of synthesizing Y. pestis FI capsular antigen.
A
Поступила 25.07.05.
