CC BY
90
удк 616-092.4
в.и. Дубровина, Г.Б. Мухтургин, С.В. Балахонов, С.А. Витязева, Т.П. Старовойтова,
Т.А. Иванова, Ж.А. Коновалова, А.М. Владимирова
изучение иммунофизиологических свойств штаммов чумного микроба с различным пллзмидным составом
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Иркутск
В статье представлены данные о влиянии плазмидного состава чумного микроба на его адгезивные свойства и фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов вусловиях in vitro. Показано, что штаммы чумного микроба разных подвидов, отличающиеся по плазмидному профилю, в частности отсутствию одной из плазмид (pYP, pYV), обладают низкой адгезивной активностью и способствуют повышению поглотительной способности фагоцитов лабораторных животных.
Ключевые слова: возбудитель чумы, адгезия, фагоциты
sTuDYiNG oF iMMuNopHYsioLoGiCAL pRopERTiEs oF YERsiNIA PEsTis sTRAINs wiTH various plasmid composition
V.I. Dubrovina, G.B. Mukhturgin, S.V. Balakhonov, S.V. Vityazeva, T.P. Starovoytova,
T.A. Ivanova, Zh.A. Konovalova, A.M. Vladimirova irkutsk antiplague research institute of siberia and Far east of rospotrebnadzor, irkutsk, russia
Data of Yersinia pestis plasmid structure influence on its adhesive properties and phagocytic activity of peritoneal macrophages in vitro are represented. It is shown that Y. pestis strains of diverse subspecies differing by a plasmid profile, particularly by one of the plasmids (pYP, pYV) lacking, possess low adhesive activity and promote the increase of laboratory animal phagocyte absorbing capacity.
Key words: Yersinia pestis, adhesion, phagocyte
Актуальным направлением в изучении патогенеза чумы является исследование особенностей иммунофизиологических процессов и механизмов адаптации, возникающих у возбудителя чумы Yersinia pestis с различным плазмидным составом при взаимодействии с организмом хозяина. Одним из признаков вирулентности чумного микроба является способность бактериальных клеток при помощи ряда белков (адгезин, инвазин, Ail, YadA, YadB, YadC, Pla, and pH 6) фиксироваться на поверхности эритроцитов и проникать внутрь фагоцитов с последующей дезорганизацией их мембран, вызывая, как следствие, уменьшение кислородной емкости крови и интоксикацию [1, 2, 5-7, 14]. При инфекционном процессе, вызванном Y. pestis, происходит нарушенние окислительного фосфорилирования и транспорта электронов в ферментной цепи за счет торможения энзиматической активности дегидрогеназ. Активность ферментов гликолиза (гексокиназы, фосфогексоизомеразы, альдолазы, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы) у чумного микроба значительно выше активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы и транскетолазы. Из перечисленных энзимов апотомического пути наиболее низкой активностью обладает Г6ФДГ [8]. Антимикробный потенциал фагоцитирующих клеток, способный определять развитие типовых патологических процессов, является физиологической основой клеточной защиты макроорганизма от возбудителя чумы. В настоящее время фагоцитарная система макроорганизма рассматривается как важнейший
эффектор структурного гомеостаза, направленный на уничтожение микробов [1, 8].
В связи с этим, проведение экспериментальных исследований по установлению патогенных эффектов возбудителя на макроорганизм является актуальной проблемой патологической физиологии, поскольку большая часть патогенного потенциала чумного микроба, циркулирующего в природных очагах, для людей остается неизвестной.
Цель работы - оценить адгезивные свойства штаммов чумного микроба с разным плазмидным составом и их влияние на поглотительную способность фагоцитов в условиях in vitro.
материалы и методы
В работе использовали 5 штаммов Y. pestis subspecies altaica и Y. pestis subsp. pestis из коллекции музея ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (табл. 1).
Штаммы чумного микроба культивировали на агаре Хоттингера рН 7,2 при 28 °С 48 часов, смывали
0,9 % ЗФР. Бактериальную взвесь (1-109 КОЕ/мл по ОСО 10 ед.) раститровывали до концентрации 1-107 КОЕ/мл. Работа с материалом, зараженным ПБА I-II группы патогенности, проводилась в соответствии с Санитарными правилами «Безопасность работы с микроорганизмами I-II группы патогенности (опасности)» СП 1.3.1285-03.
Эксперименты выполнены на 60 морских свинках (200-250 г) и 10 беспородных белых мышах (18-20 г) обоих полов. Животных выводили из эксперимента в соответствии с «Правила лабораторной практики»,
Таблица 1
Характеристика тестируемых штаммов чумного микроба
Штамм Место выделения Плазмидный состав Вирулентность для белых мышей ^О50), м.к.
Y. pestis subsp. pestis И-2638 Тувинский природный очаг чумы pYP+pYV+pTP33+pYT+ 10/высоковирулентный
Y. pestis subsp. pestis И-3479 Иркутский противочумный институт pYP+pYV-pTP33+pYT+ Авирулентный
Y. pestis subsp. pestis И-3480 Иркутский противочумный институт pYP-pYV-pTP33+pYT+ Авирулентный
Y. pestis subsp. altaica И-2359 Горно-алтайский природный очаг чумы pYP+pYV+pYT+ 4104/слабовирулентный
Y. pestis EV НИИЭГ о. Мадагаскар pYP+pYV+pYT+ 3108/остаточная вирулентность
утвержденных Приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 г.; Принципы надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 534342009).
Материалом для получения эритроцитов служила венозная кровь клинически здоровых лабораторных животных. Адгезивную активность выявляли по методу В.И. Брилис с соавт. (1986) [6] в собственной модификации [9] по коэффициенту адгезии (КА). Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов (ПМ) определяли по поглотительной способности фагоцитов (фагоцитарный индекс поглощения, ФИП, %), примированных чумным микробом с разным плазмидным составом в течение 30 минут при 37 °С. Контролем служили интактные фагоциты. Анализ полученных результатов осуществляли стандартными статистическими методами и выражали как среднее (М) и стандартное отклонение ^). Для сравнения средних из выборок использовали и-критерий Манна - Уитни. Для выяснения общего характера распределения вычисляли показатели асимметрии и эксцесса. Различия считали достоверными при р < 0,05.
результаты и обсуждение
Показано, что чумной микроб, независимо от его фенотипических свойств, проявляет высокую способность реагировать с эритроцитами белых мышей. Максимальные значения коэффициента адгезии (табл. 2) зарегистрированы для штамма Y. pestis subsp. pestis И-2638. У штамма Y. pestissubsp. altaica И-2359, а также у Y. pestis subsp. pestis И-3479, и Y. pestis subsp. pestis И-3480 показатели адгезивной способности в отношении эритроцитов белых мышей были ниже по сравнению с Y. pestis И-2638 (в 4,3; 6,6 и 8,4 раза, соответственно).
Таблица 2 Значения коэффициента адгезии
Возбудитель чумы, циркулирующий на территории природных очагов Сибири, отличается по плазмидному составу, питательным потребностям, ферментативной активности и вирулентности для различных видов диких и лабораторных животных. Так, имеются сведения о различиях биохимических свойств у штаммов алтайского и основного подвидов [3, 4]. Для их дифференциации рядом исследователей предложен тест для определения Г6ФДГ активности чумного микроба [13].
Известно, что чумной микроб, в зависимости от его фенотипических свойств, обладает разным уровнем Г6ФДГ активности [10]. Так, у Y. pestis subsp. pestis И-2638 содержание этого фермента в среднем в 2,0-2,3 раза ниже по сравнению с остальными клетками чумного микроба (р = 0,017), взятых в эксперимент. У двух изогенных вариантов вирулентного штамма Y. pestis subsp. pestis И-2638 -Y. pestis subsp. pestis И-3479 и Y. pestis subsp. pestis И-3480 и Y. pestis 8ііЬ8р. altaica существенных различий Г6ФДГ активности не выявлено (табл. 3).
Таблица 3
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная активность Y. pestis
Штаммы Уровень активности Г6ФДГ
Y. pestis subsp. altaica И-2359 0,34 ± 0,90
Y. pestis subsp. pestis И-2638 0,15 ± 2,30
Y. pestis subsp. pestis И-3479 0,30 ± 0,68
Y. pestis subsp. pestis И-3480 0,32 ± 1,73
Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о наличии корреляционной связи между каталитической способностью Г6ФДГ чумного микроба и его адгезивной активностью (г = -0,85). У вирулентного штамма Y. pestis И-2638 при наличии низкой активности Г6ФДГ отмечается высокая адгезивная способность. Показано, что при повышении показателей Г6ФДГ происходит заметное снижение способности чумного микроба фиксироваться на поверхности эритроцита. Предположительно, изменения в адгезивных и ферментативных свойствах Y. pestis связаны с особенностями его плазмидного профиля. Результаты, полученные в ходе исследования, подтверждают данные других авторов [13] о низкой способности вирулентных
Штаммы Значение КА (%)
Y. pestis EV 15,2 ± 0,8
Y. pestis subsp. altaica И-2359 21,0 ± 0,9
Y. pestis subsp. pestis И-2638 92,0 ± 2,3
Y. pestis subsp. pestis И-3479 14,0 ± 0,7
Y. pestis subsp. pestis И-3480 11,0 ± 1,7
штаммов экспрессировать активную форму Г6ФДГ из-за миссенс-мутаций (замена пролина на серин в аминопозиции 155).
Установлена высокая поглотительная способность (ФИП: М = 9,4; s = 0,4) фагоцитов морской свинки (табл. 4) в отношении Y. pestis subsp. altaica И-2З59 (pYP+pYV+pYT+). Наименьшие значения индекса поглощения (М = 4,7; s = 0,5) выявлены у фагоцитов, примированных Y. pestis subsp. pestis И-26З8 (pYP+pYV+pTP33+pYT+), что, на наш взгляд, может быть связано с наличием в геноме штамма, выделенного в Тувинском природном очаге чумы, плазмиды рТРЗЗ, опосредованно влияющей на ингибирование механизмов фагоцитоза. В настоящее время значение этой криптической плазмиды в определении биологических свойств чумного микроба до конца не выяснено. Высказано предположение, что плазмида рТРЗЗ является продуктом рекомбинационного контегративного взаимодействия плазмид pYP и pYT Y. pestis [4].
Таблица 4
Поглотительная способность (ФИП) фагоцитов морской свинки
заключение
В результатах проведенных опытов показаны различия в адгезивной активности штаммов чумного микроба с разным плазмидным составом, выделенных в Горно-Алтайском и Тувинском природных очагах. Штаммы чумного микроба разных подвидов, отличающиеся по плазмидному профилю, в частности отсутствию одной из плазмид (pYP, pYV), обладают низкой адгезивной активностью и способствуют повышению поглотительной способности фагоцитов лабораторных животных. Можно предположить, что важную роль в этих процессах играет плазмида кальцийзависимости, которая может обуславливать способность бактерий вирулентных штаммов ингибировать активность клеток иммунофагоцитарной системы. Вероятно, плазмида пестициногенности также может опосредовано участвовать в этом процессе. Полученные в ходе исследования данные указывают, что штаммы Y. pestis И-З479, Y. pestis И-З480, утратившие плазмиды pYP и pYV, обладают низкими показателями адгезивной активности, имеют высокие показатели активности Г6ФДГ по сравнению с Y. pestis subsp. pestis И-26З8 (pYP+pYV+pTP33+pYT+).
Выявленные в ходе экспериментов данные о различиях в поглотительной способности ПМ в отношении Y. pestis subsp. altaica И-2З59, Y. pestis subsp. pestis И-З479, Y. pestis subsp. pestis И-З480 по сравнению с Y. pestis subsp. pestis И-26З8, вероятно
обусловлены их плазмидным профилем, в частности наличием плазмиды pYV или рТР33.
Данное обстоятельство, на наш взгляд, может опосредованно влиять на ингибирование механизмов фагоцитоза.
Полученные в ходе экспериментов данные могут быть использованы при изучении молекулярногенетических основ патогенеза инфекционного процесса, направлений его развития и определения действия эффективных форм вакцинных препаратов.
литература
1. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов // Журн. молекул. генетика, микробиология и вирусология. -2002. - № 3. - С. 3-4.
2. Афанасьева Г.А., Чеснокова Н.П., Дальвадянц С.М., Кутырев В.В. Эндотоксин Yersinia pestis: особенности структуры, рецепции и механизмов индукции цитопатогенных эффектов (обзор) // Проблемы особо опасных инфекций - Саратов -2008. - № 4 (98) - С. 43-48.
3. Балахонов С.В. Геномные маркеры возбудителей чумы, псевдотуберкулеза, холеры, бруцеллеза : дисс. ... докт. мед. наук. - Саратов, 2000. - 263 с.
4. Балахонов С.В., Вержуцкий Д.Б., Корзун В.М. и др. Современное состояние природных очагов чумы Сибири // Журнал инфекционной патологии. - 2009. -Т. 16, № 3. - С. 16-20.
5. Бахтеева И.В. Исследование функциональной активности рН 6 антигена Yersinia pestis с помощью наборов изогенных мутантов: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 2008. - 28 с.
6. Брилис В.И. и др. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лаб. дело. - 1986. - № 4. - С. 210-212.
7. Варивода Т.Ю., Каграманов В.С. Изучение влияния антигенов чумного микроба на возникновение гипоксического состояния у экспериментальных животных // Сборник материалов международной научной конференции. Проблемы биологической и экологической безопасности. 22-25 мая. - 2000. -Оболенск. - С. 23-24.
8. Домарадский И.В. Чума: современное состояние, гипотезы, проблемы. - Саратов: Изд-во Саратовского медицинского ин-та, 1993. - 130 с.
9. Иванова Т.А. и др. Методические рекомендации по использованию показателей адгезивной активности Yersinia pestis для оценки вирулентности. -Иркутск, 2012. - 8 с.
10. Коновалова Ж.А. Мухтургин Г.Б., Дубровина В.И., Иванова Т.А. и др. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы чумного микроба Yersinia pestis с разным плазмидным профилем и взаимодействующих с ним перитонеальных макрофагов морских свинок // Известия Иркутского государ. ун-та. - 2011. - Серия «Биология. Экология». - Т. 4, Вып. 4. - С. 53-57.
11. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иер-синий // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2002. - Т. 4, № 3. - С. 248-266.
Штаммы ФИП (%)
Y. pestis EV 6,81 ± 0,8
Y. pestis subsp. altaica И-2359 9,21 ± 0,9
Y. pestis subsp. pestis И-2638 4,71 ± 0,5
Y. pestis subsp. pestis И-3479 7,11 ± 0,3
Y. pestis subsp. pestis И-3480 7,63 ± 0,5
12. Bearden S.W., Sexton J.P. et al. Attenuated enzootic (pestoides) isolates of Yersinia pestis express active aspartase // C. Microbiology. - 2009. - Vol. 155, Part 1. -P. 198-209.
13. Mikula K.M., Kolodziejczyk R., Goldman A. Yersinia infection tools - characterization of structure and function of adhesions // Front. Cell. Infect. Microbiol. - 08 January 2013 | doi: 10.3389/fcimb.2012.00169.
REFERENCES
1. Anisimov A.P. Factors of Yersinia pestis, providing circulation and preservation of plague pathogen in ecosystems of nature foci // Zhurn. molekul. genetika, mikrobiologija i virusologija. - 2002. - № 3. - S. 3-4.
2. Afanas'eva G.A., Chesnokova N.P., Dal'vadjanc S.M., Kutyrev V.V. Endotoxin Yersinia pestis: features of structure, reception and mechanisms of induction of cytopathogenic effects (review) // Problemy osobo opasnyh infekcij - Saratov - 2008. - № 4 (98) - S. 43-48.
3. Balahonov S.V. Genomic markers of plague, pseudotuberculosis, cholera and brucellosis pathogens : diss. ... dokt. med. nauk. - Saratov, 2000. - 263 s.
4. Balahonov S.V., Verzhuckij D.B., Korzun V.M. i dr. Modern conditions of nature foci of plague in Siberia // Zhurnal infekcionnoj patologii. - 2009. - T. 16, № 3. - S. 16-20.
5. Bahteeva I.V. Research of functional activity of rN 6 antigene Yersinia pestis with use of sets of isogenic mutants: avtoref. dis. . kand. med. nauk. - M., 2008. - 28 s.
6. Brilis V.I. i dr. Method of study of adhesive process of mictoorganisms // Lab. delo. - 1986. - № 4. - S. 210-212.
7. Varivoda T.Ju., Kagramanov V.S. Study of influence of antigens of plague microbe on the appearance of hypoxic condition in experimental animals // Sbornik materialov mezhdunarodnoj nauchnoj konferencii. Problemy biologicheskoj i jekologicheskoj bezopasnosti. 22-25 maja. - 2000. - Obolensk. - S. 23-24.
8. Domaradskij I.V. Plague: modern condition, hypothesis, problems. - Saratov: Izd-vo Saratovskogo medicinskogo in-ta, 1993. - 130 s.
9. Ivanova T.A. i dr. Guideline on the use of indices of adhesive activity of Yersinia pestis for evaluation of virulence. - Irkutsk, 2012. - 8 s.
10. Konovalova Zh.A. Muhturgin G.B., Dubrovina V.I., Ivanova T.A. i dr. Activity of glucose-6-phosphatedehydrogenase of plague microbe Yersinia pestis with different plasmide profile and interacting with it peritoneal macrophages of guinea pigs // Izvestija Irkutskogo gosudar. un-ta. - 2011. - Serija «Biologija. Jekologija». - T. 4, Vyp. 4. - S. 53-57.
11. Ceneva G.Ja., Solodovnikova N.Ju., Voskresenskaja E.A Molecular aspects ofvirulence of Yersinia pestis // Klinicheskaja mikrobiologija i antimikrobnaja himioterapija. - 2002. - T. 4, № 3. - S. 248-266.
12. Bearden S.W., Sexton J.P. et al. Attenuated enzootic (pestoides) isolates of Yersinia pestis express active aspartase // C. Microbiology. - 2009. - Vol. 155, Part 1. -P. 198-209.
13. Mikula K.M., Kolodziejczyk R., Goldman A. Yersinia infection tools - characterization of structure and function of adhesions // Front. Cell. Infect. Microbiol. - 08 January 2013 | doi: 10.3389/fcimb.2012.00169.
сведения об авторах
Дубровина Валентина Ивановна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией патофизиологии ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: dubrovina-valya@mail.ru)
Мухтургин Геннадий Борисович - младший научный сотрудник лаборатории экспериментальных животных ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзорател
Балахонов Сергей Владимирович - доктор медицинских наук, директор ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Витязева Светлана Александровна - кандидат медицинских наук, научный сотрудник отдела микробиологии чумы ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Старовойтова Татьяна Пантелеевна - научный сотрудник лаборатории патофизиологии ФКУЗ Иркутский научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Иванова Татьяна Александровна - заведующая лабораторией экспериментальных животных ФКУЗ Иркутский научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Коновалова Жанна Анатольевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник научно-производственного отдела ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Владимирова Алена Михайловна - младший научный сотрудник лаборатории патофизиологии ФКУЗ Иркутский научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
information about the authors
Dubrovina Valentina ivanovna - doctor of biological sciences. MD. chief scientific officer, head of laboratory of pathophysiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor (Irkutsk, Trilissera str., 78, 664047; tel. (3952) 22-01-35, fax: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: dubrovina-valya@mail.ru)
Mukhturgin Gennadiy Borisovich - junior scientific officer of laboratory of experimental animals of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor
Balakhonovsergey Vladimirovich - doctor of medical sciences, MD, professor, director of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor
Vityazeva svetlana aleksandrovna - candidate of medical sciences, scientific officer of the department of microbiology of plague of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor
starovoytova tatiana Panteleevna - scientific offiecer of pathophysiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor
ivanova tatianaaleksandrovna - head of the laboratory of experimental animals of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor
Konovalova Zhannaanatolievna - candidate of medical sciences, chief scientific officer of research-and-production department of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor
Vladimirovaalena Mikhaylovna - junior scientific officer of laboratory of pathophysiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor
