CC BY
23
Серия «Биология. Экология» И З В Е С Т И Я
2011. Т. 4, № 4. С. 53-57 Иркутского
Онлайн-доступ к журналу: государственного
http://isu.ru/izvestia университета
УДК 616.981.452:612-015
Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы чумного микроба Yersinia pestis с разным плазмидным профилем и взаимодействующих с ним перитонеальных макрофагов морских свинок
Ж. А. Коновалова, Г. Б. Мухтургин, В. И. Дубровина, Т. А. Иванова,
С. А. Белькова, С. В. Балахонов
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Иркутск E-mail: [email protected]
Аннотация. Определена активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) чумного микроба алтайского и основного подвидов с разным плазмидным составом и вирулентностью. Установлено, что все использованные в эксперименте штаммы Yersinia pestis проявляли Г6ФДГ активность, тем не менее, у вирулентного штамма чумного микроба содержащего плазмиды pPst, pCad, pTP33, pFra показатели были ниже по сравнению с Y. pestis, дефектными по плазмидному профилю. Проведены исследования активности Г6ФДГ перитонеальных макрофагов морских свинок при контакте с чумным микробом с разным плазмидным составом в условиях in vitro. Установлено, что активность Г6ФДГ перитонеальных макрофагов при фагоцитозе чумного микроба зависит от его плазмидного спектра, фенотипическое проявление которого выражается вирулентностью для лабораторных животных.
Ключевые слова: возбудитель чумы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, фагоцит.
Введение
Известно, что возбудитель чумы, циркулирующий на территории природных очагов Сибири, отличается по плазмидному составу, питательным потребностям, ферментативной активности и вирулентности для различных видов диких и лабораторных животных [1; 7]. Так, имеются сведения о различиях биохимических свойствах штаммов алтайского и основного подвидов чумного микроба Yersinia pestis [6]. Для их дифференциации рядом исследователей предложен тест определения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной (Г 6ФДГ)
активности чумного микроба [8]. Однако активность этого фермента изучена не у всех штаммов Y. pestis, выделенных на территории сибирских природных очагов чумы.
В связи с тем что при взаимодействии фагоцита с микробом происходит повышение окисления глюкозы через гексозомонофосфат-ный шунт и значительное увеличение метаболической активности клеток, сопоставление реакции макрофагов на Y. pestis, имеющего разный набор плазмид, в частности на активность Г6ФДГ, вызывает несомненный интерес [2; 4; 5].
Цель исследования - определить уровень Г6ФДГ-активности Y. pestis и перитонеальных
макрофагов морских свинок при фагоцитозе чумного микроба разного плазмидного состава в условиях in vitro.
Материал и методы
В работе использовали штаммы чумного микроба, хранящиеся в коллекции музея живых культур ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ: Y. pestis ssp. pestis И-2638 (выделен в Тувинском природном очаге чумы); Y. pestis ssp. pestis И-3479 (И-2638 pCad-, выделен трёхкратным пассированием на среде ВМ [1]); Y. pestis ssp. pestis И-2638 pPst-pCad- (И-3480, выделен XIV пассажем на среде Луриа-Бертани при температуре 4-5 °С [1]); Y. pestis ssp. altaica И-2359 и Y. pestis ssp. altaica И-2996 (выделены в Горно-Алтайском природном очаге чумы) (табл.).
Эксперименты выполнены на 10 сертифицированных (НПО «Вектор», г. Новосибирск) стандартных по условиям содержания и кормления морских свинках весом 200-250 г. Активность Г6ФДГ определяли в перитонеальных макрофагах (2-107 кл./мл) экспериментальных животных (контроль), в клетках чумного микроба (5• 109 кл./мл), а также при взаимодействии Y. pestis с макрофагами (50:1) в условиях in vitro [3].
Таблица
Характеристика вирулентности и плазмидного состава штаммов чумного микроба У. рвіііі', использованных в экспериментах
№ Штамм Вирулентность (м. к.) Плазмидный
п/п б/м м/св состав
1 Y. pestis ssp. altaica И-2359 LD50=41780 авирулентен pPst+pCad+pFra+
2 Y. pestis ssp. altaica И-2996 LD50=4014 авирулентен pPst-pCad+pFra+
3 Y. pestis ssp. pestis И-2638 DCL 102 DCL 102 pPst+pCad+pTP3 3+pFra+
4 Y. pestis ssp. pestis И-3480 авирулентен в дозе 107 авирулентен в дозе 109 pPst-pCad-pTP3 3+pFra+
5 Y. pestis ssp. pestis И-3479 авирулентен в дозе 107 авирулентен в дозе 109 pPst+pCad-pTP33+pFra+
Для получения фагоцитарно-микробной взвеси к 20 млн фагоцитов (в 1 мл среды 199) добавляли 0,2 мл 5• 109 взвеси бактерий. Фагоциты инкубировали с чумным микробом в течение 60 мин при 37 °С. Активность Г6ФДГ в фагоцитирующих перитонеальных макрофагах оценивали по формуле:
АЕОП=ЕОП(мф+у.р.)-ЕОП(у.р), где ЕОП - условные единицы оптической плотности; мф+ У.р. - макрофагально-микробная взвесь; У.р. - У. pestis. Эксперименты проведены в трёх повторностях. Животных выводили из эксперимента в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77). Статистический анализ полученных результатов осуществляли стандартными методами и выражали в виде условных единиц оптической плотности как среднее (Х) и стандартное отклонение (8). Для сравнения средних из выборок использовали и-критерий Манна - Уитни. Различия считали
достоверными при Р < 0,05. Статистический анализ данных проводили с помощью пакета стандартных программ STATISTICA 6.
Результаты
Г6ФДГ-активность Y. pestis с разным плазмидным спектром. Все исследованные штаммы чумного микроба в экспериментах экспрессируют биологическую активную Г6ФДГ (рис. 1).
При сравнении активности Г6ФДГ чумного микроба разных подвидов наименьшие уровни фермента зарегистрированы в клетках вирулентного штамма Y. pestis ssp. pestis И-2638 (pPst+pCad+pTP33+pFra+), которые были ниже в среднем в 2,1-2,4 раза по сравнению с другими (Р = 0,016704). Для двух изогенных вариантов - Y. pestis ssp. pestis И-3479 и Y. pestis ssp. pestis И-3480 вирулентного штамма (Y. pestis ssp. pestis И-2638) и клеток Y. pestis ssp. altaica существенных различий Г6ФДГ активности не выявлено.
T
■Él т
■ ■ ш
т
\W\WWW\
I II III IV V
Штаммы Y. pestis
Рис. 1. Характеристика активности Г6ФДГ чумного микроба разных подвидов. I - Y. pestis ssp. altaica И-2996; II - Y. pestis ssp. altaica И-2359; III -Y. pestis ssp. pestis И-3479; IV - Y. pestis ssp. pestis И-3480; V- Y. pestis ssp. pestis И-2638
0,4
0,35
0,3
^ 0,25
0,2
0,15
ш 0,1
0,05
0
Активность Г6ФДГ у фагоцитов экспериментального животного при контакте с чумным микробом. Показано, что при контакте фагоцитов с Y. pestis ssp. altaica И-2996 (pPst-pCad+pFra+) и Y. pestis ssp. pestis И-3480 (pPst-pCad-pTP33+pFra+) происходит достоверное (Р = 0,016502) повышение активности Г6ФДГ в фагоцитах по сравнению с интактными клетками в 1,3 раза. В случае Y. pestis ssp. pestis И-3479 (pPst+pCad-pTP33+pFra+) показатели Г6ФДГ фагоцитов незначительно отличались от контрольных. Y. pestis ssp. pestis И-2638 (pPst+pCad+pTP33+pFra+) в 1,6 раза (Р = 0,0495) ингибировал активность Г6ФДГ фагоцитирующих макрофагов, по сравнению с контролем (рис. 2).
Таким образом, в ходе эксперимента получены данные, свидетельствующие о различиях тестируемых штаммов по активности одного из возможных маркеров вирулентности чумного микроба - фермента Г6ФДГ, что, вероятно, связано с особенностями плазмидного профиля клеток возбудителя. Так, у Y. pestis ssp. рestis И-2638 (pPst+pCad+pTP33+pFra+) отмечены наименьшие по сравнению с остальными тестируемыми штаммами показатели активности Г6ФДГ, что подтверждает данные других ис-
следователей о низкой способности экспрессировать активную форму этого фермента вирулентными штаммами из-за миссенс-мутаций (замена пролина на серин в аминопозиции 155) [8].
Как известно, отличительными признаками некоторых тувинских штаммов чумного микроба является наличие в геноме дополнительной четвёртой плазмиды рТР33 с молекулярной массой 22 МД [1]. В настоящее время значение этой криптической плазмиды в определении биологических свойств чумного микроба до конца не выяснено. Высказано предположение, что плазмида рТР33 является продуктом рекомбинационного контегративного взаимодействия плазмид pPst и pFra Y. pestis [1]. В связи с этим наличие в геноме тувинских штаммов плазмиды рТР33, на наш взгляд, может опосредованно влиять на ингибирование механизмов микробицидности фагоцитов, связанных с «респираторным взрывом», в частности Г6ФДГ.
Повышение активности этого фермента у фагоцитов при контакте с Y. pestis (pPst-), по сравнению с pPst+ вариантами, может указывать на участие этой плазмиды в экспрессии Г6ФДГ.
0,6
0,4
0,2
і
Штаммы Y. pestis
'МФ, стимулированные Y. pestis
п
Интактные МФ
Рис. 2. Активность Г6ФДГ макрофагов (МФ) экспериментального животного при контакте с чумным микробом разных подвидов. I - Y. pestis ssp. altaica И-2996; II - Y. pestis ssp. altaica И-2359; III -Y. pestis ssp. pestis И-3479; IV - Y. pestis ssp. pestis И-3480; V- Y. pestis ssp. pestis И-2638
0,5
0,3
0,1
IV
V
Анализ полученных данных свидетельствует о том, что в условиях in vitro высокие значения активности Г6ФДГ у фагоцитирующих бактерии изогенного штамма Y. pestis И-3480 макрофагов по сравнению с исходным Y. pestis И-2638 (pPst+pCad+pTP33+pFra+), что, возможно, связано с отсутствием у мутанта плазмид pCad и pPst.
Таким образом, характер взаимодействия «паразит - фагоцит» связан с наличием генных детерминант, обусловливающих экспрессию факторов, ингибирующих ферментативные процессы макрофагов.
Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования определения активности Г6ФДГ чумного микроба как биохимическим методом, так и с применением молекулярно-генетических методов, в том числе у изогенных (Г6ФДГ-) вариантов.
Выводы
1. Все использованные в эксперименте штаммы Y. pestis проявляли активность Г6ФДГ.
2. Наименьшие значения Г6ФДГ активности зарегистрированы у вирулентного Y. pestis ssp. pestis И-2638 (pPst+pCad+pTP33+pFra+).
3. В перитонеальных макрофагах морских свинок при фагоцитозе Y. pestis ssp. altaica И-2996 (pPst-pCad+pFra+), Y. pestis ssp. pestis И-3480 (pPst-pCad-pTP33+pFra+) происходит активация Г6ФДГ в 1,3 раза (Р = 0,016502) по сравнению с интактными макрофагами.
4. Y. pestis ssp. pestis И-2638 (pPst+pCad+pTP33+pFra+), являющийся виру-
лентным для морских свинок, ингибировал Г6ФДГ активность фагоцитаршактивных клеток.
Литература
1. Балахонов С. В. Геномные маркеры возбудителей чумы, псевдотуберкулёза, холеры, бруцеллёза : дис. ... д-ра мед. наук : 03.00.07 - микробиология; 14.00.07 - эпидемиология / С. В. Балахонов. - Саратов, 2000. - 263 с.
2. Голубинский Е. П. Дыхательный аппарат и окислительный метаболизм чумного микроба : дис. ... д-ра мед. наук : 03.00.04 - биол. биохимия / Е. П. Голубинский. - Саратов, 1973. - 417 с.
3. Голубинский Е. П. Активность бактерицидных систем фагоцитов у интактных и иммунизированных против туляремии морских свинок / Е. П. Го-лубинский, И. С. Бойкова, В. И. Дубровина // Журн. микробиологии. -1995. - № 2. - С. 77-79.
4. Домарадский И. В. Чума: современное состояние, гипотезы, проблемы / И. В. Домарадский. -Саратов : Изд-во Саратов. мед. ин-та, 1993. - 130 с.
5. Иммунология : в 3 т. : пер. с англ. / под ред. У. Пола. - М. : Мир,1989. - Т. 3. - 360 с.
6. Куклева Л. М. Сравнительная характеристика биохимических свойств штаммов разных подвидов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis / Л. М. Куклева, И. А. Кузьмиченко, О. А. Проценко // Проблемы особо опасных инфекций. - 2001. - Вып. 81. - С. 105-110.
7. Современное состояние природных очагов чумы Сибири / С. В. Балахонов [и др.] // Журн. ин-фекц. патологии. - 2009. - Т. 16, № 3. - С. 16-20.
8. Attenuated enzootic (pestoides) isolates of Yersinia pestis express active aspartase / S. W. Bearden [et al.] // Microbiology. - 2009. - Vol. 155, Part 1. -P. 198-209.
Glucose-6-phosphate dehydrogenase activity of Yersinia pestis and phagocytes of guinea pigs in their contact with plague microbe of different plasmid compound
Zh. А. Konovalova, G. B. Muchturgin, V. I. Dubrovina, T. A. Ivanova,
S. А. Bel’kova, S.V. Balakchonov
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor, Irkutsk
Abstract. The glucose-6-phosphate dehydrogenase (Zwf) activity in Yersinia pestis subsp. pestis и Yersinia pestis subsp. altaica with different plasmid specrtrum was evaluated. Different levels of Zwf activity was observed in all strains of Y. pestis that were taken to experiment. Virulent Yersinia pestis subsp. pestis possess minimal index Zwf activity. The dynamics of Zwf activity in peritoneal macrophages of guinea pigs in contact with Yersinia pestis subsp. pestis и Yersinia pestis subsp. altaica was investigated in vitro. Increasing activity of Zwf at peritoneal macrophages are phagocytising plague agent was depending of plasmid compound of Yersinia pestis.
Keywords: Plague agent, glucose-6-phosphate dehydrogenase, phagocytes
Коновалова Жанна Анатольевна Konovalova Zhanna Аnatolyevna
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский FKUZ Irkutsk Antiplague Research Institute
противочумный институт Роспотребнадзора of Rospotrebnadzor
664047, Иркутск, Трилиссера, 78 кандидат биологических наук, старший научный сотрудник тел. (3952)22-13-12
Мухтургин Геннадий Борисович
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский
противочумный институт Роспотребнадзора
664047, Иркутск, Трилиссера, 78
младший научный сотрудник
тел. (3952)22-13-12
E-mail: [email protected]
Дубровина Валентина Ивановна
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский
противочумный институт Роспотребнадзора
664047, Иркутск, Трилиссера, 78
доктор биологических наук, заведующий
лабораторией патофизиологии
тел. (3952)22-13-12
E-mail: [email protected]
Иванова Татьяна Александровна
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский
противочумный институт Роспотребнадзора
664047, Иркутск, Трилиссера, 78
заведующий лабораторией экспериментальных
животных
тел. (3952)22-13-12
E-mail: [email protected]
Белькова Светлана Анатольевна
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский проти
вочумный институт Роспотребнадзора
664047, Иркутск, Трилиссера, 78
кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
тел. (3952)22-13-12
E-mail: [email protected]
Балахонов Сергей Владимирович
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский
противочумный институт Роспотребнадзора
664047, Иркутск, Трилиссера, 78
доктор медицинских наук профессор,
директор института
тел. (3952)22-13-12
E-mail: [email protected]
78 Trilissera St, Irkutsk, 664047
Ph.D. in Biology, senior research scientist
phone: (3952)22-13-12
Мuchturgin Gennagiy Borisovich FKUZ Irkutsk Antiplague Research Institute of Rospotrebnadzor 78 Trilissera St, Irkutsk, 664047 junior research scientist phone: (3952)22-13-12 E-mail: [email protected]
Dubrovina Valentina Ivanovna
FKUZ Irkutsk Antiplague Research Institute
of Rospotrebnadzor
78 Trilissera St, Irkutsk, 664047
D. Sc. in Biology, Head of laboratory
phone: (3952)22-13-12 E-mail: [email protected]
Ivanova Tatyana Aleksandrovna
FKUZ Irkutsk Antiplague Research Institute
of Rospotrebnadzor
78 Trilissera St, Irkutsk, 664047
Head of laboratory
phone: (3952)22-13-12 E-mail: [email protected]
Bel’kova Svetlana Anatolyevna
FKUZ Irkutsk Antiplague Research Institute
of Rospotrebnadzor
78 Trilissera St, Irkutsk, 664047
Ph.D. in Biology, senior research scientist
phone: (3952)22-13-12 E-mail: [email protected]
Balahonov Sergeiy Vladimirovich
FKUZ Irkutsk Antiplague Research Institute
of Rospotrebnadzor
78 Trilissera St, Irkutsk, 664047
D. Sc. in Medicine, Prof., Director of institute
phone: (3952)22-13-12 E-mail: [email protected]
