CC BY
28
Журнал фундаментальной медицины и биологии оригинальные статьи
УДК 576.8:612.017.1
М.Е. Морозов, Н.А. Воронина, С.Ю. Тюкавкина, А.В. Лабушкина, Г.Г. Харсеева
ВЛИЯНИЕ НЕЙТРОФИЛОКИНОВ НА АПОПТОГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ НЕДИФТЕРИЙНЫХ КОРИНЕБАКТЕРИЙ
Ростовский государственный медицинский университет, кафедра микробиологии и вирусологии №2
Цель: определить способность Corynebacterium non diphtheriae к индукции апоптоза макрофагов и оценить регуляторное влияние нейтрофилокинов, индуцированных Corynebacterium non diphtheriae, на данные процессы.
Материалы и методы: исследовали способность Corynebacterium non diphtheriae, выделенных из верхних дыхательных путей, кожи и урогенитального тракта, индуцировать апоптоз макрофагов мышей до и после добавления нейтрофилокинов, индуцированных Corynebacterium non diphtheriae.
Результаты: все исследованные виды коринебактерий индуцировали апоптоз макрофагов, наиболее выраженное апоптогенное действие было выявлено у C.pseudotuberculosis, выделенного из урогенитального тракта. Воздействие нейтрофилокинами приводило к снижению апоптогенного эффекта почти всех видов Corynebacterium non diphtheriae вне зависимости от места выделения.
Выводы: способом реализации патогенного действия Corynebacterium non diphtheriae является их выраженное апоптогенное действие. Возможно использовать нейтрофилокины для иммунокоррекции им-мунодефицитных состояний, развивающихся на фоне заболеваний, обусловленных Corynebacterium non diphtheriae.
Ключевые слова: Corynebacterium non diphtheriae, нейтрофилокины, апоптоз, фагоцитоз.
M.E. Morosov, N.A. Voronina, S.J. Tukavkina, A.V. Labushkina, G.G. Kharseeva
THE INFLUENCE OF NEUTROPHILOUS ON APOPTOGENIC ACTIVITY OF CORYNEBACTERIUM NON DOPHTHERIAE
Rostov State Medical University, Microbiology and Virology Department № 2
Purpose: To estimate the ability of C. non diphtheria to induce the apoptosis of macrophages and to evaluate the regulatory action of NpK induced by C. non diphtheria.
Metrialsa and Methods: It was investigated the ability of C. non diphtheria taken from UAP (upper air passage), skin and (UGT) urogenital tract to induce apoptosis of mice Mp before and after the addition of NpK induced by C. non diphtheria.
Results: All investigated types of Corynebacterium were able to induce apoptosis of Mp, the most strong apoptogenic action was at C. pseudotuberculosis taken from UGT. NpK increased the PC in all corynebacterias taken from all investigated byotopes, IPC — only in corynebacterias taken from skin. Npk decreased the apoptogenic action almost in all types of C. non diphtheria whatever place of isolation.
Summary: C. non diphtheria realized its pathogenic action via expressed apoptogenic action induced by Corynebacterium. NpK potentially may be used for immunocorrection of immune deficiency developing at diseases induced by C. non diphtheria.
Key words: Corynebacterium non diphtheria, neutrophilokines, apoptosis.
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
Введение
Недифтерийные коринебактерии (Coryne-bacterium xerosis, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium bovis, Corynebacterium striatum, Corynebacterium riegelii, и др.), являются одними из основных представителей нормальной микрофлоры [1-5]. Однако они могут участвовать в развитии заболеваний человека [1]. Наиболее часто Corynebacterium non diphtheriaе в диагностически значимом количестве выделяются от лиц с имму-носупрессией или мультиорганной патологией, онкологических и гематологических больных, наркоманов, ВИЧ-инфицированных и пожилых людей [2-4, 6].
Повреждающее воздействие Corynebacterium non diphtheriaе на организм в целом и на клетки иммунной системы в частности является важнейшим механизмом реализации их патогенного действия и способом выживания и распространения в организме [7, 8]. Патогенное действие недифтерийных коринебактерий связано с их способностью снижать фагоцитарную активность и активизировать процессы апоптоза в клетках хозяина [7], что может быть опосредовано наличием поверхностных антигенов, cord-фактора, нейраминидазы, высокой уреазной активности. Индукция микроорганизмами апоптоза макрофагов защищает бактерии от фагоцитоза, способствуя их выживанию.
Известно, что нейтрофилы, наряду с макрофагами и лимфоцитами, способны осуществлять регуляторную функцию, опосредованную продуцируемыми ими низкомолекулярными пептидами — нейтрофилокинами (НфК) [8, 9]. В связи с этим представляет интерес изучить характер воздействия НфК на процесс апоптоза макрофагов (Мф), индуцированных Corynebacterium non diphtheriaе, что может быть использовано для коррекции апоп-тоза.
Цель исследования - определение способности Corynebacterium non diphtheriaе к индукции апоптоза Мф, а также оценка регуляторного влияния НфК, индуцированных Corynebacterium non diphtheriaе, на данный процесс.
Материалы и методы
Объектом исследования послужили Corynebacterium non diphtheriaе, выделенные за период с 2010 по 2013 гг. из верхних дыхательных путей (ВДП) от больных острым и хроническим тонзиллитом, острым ринитом ^.pseudotuberculosis, C.pseudodiphtheriticum); с поверхности кожи от больных с аллергическими заболеваниями и дерматитами ^.pseudotuberculosis, C.pseudodiphtheriticum, C.xerosis); из урогениталь-ного тракта (УГТ) от пациентов с острым и хроническим пиелонефритом, острым кольпитом и лиц, проходивших профилактическое обследование (C.pseudotuberculosis, C.amycolatum, C.xerosis). Штаммы Corynebacterium non diphtheriaе идентифицировали общепринятыми методами [1].
В работе использовали белых беспородных мышей массой 19-21 г, полученных из вивария ФКУЗ «Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт Роспо-требнадзора».
Для получения НфК мышам вводили внутри-брюшинно 2 мл 0,1% раствора гликогена на стерильном забуференном изотоническом растворе натрия хлорида (рН 7,2). Умерщвление животных осуществляли методом цервикальной дислокации после предварительной наркотизации с помощью тиопентала натрия в дозе 5мг/кг через 4 часа после введения препарата. Перитонеальный экссудат, содержащий до 90% нейтрофилов, получали путем вымывания из брюшной полости мышей средой 199 (10 мл), содержащей 20% инактивированной (+560С, 30 мин.) сыворотки крупного рогатого скота, 5 ед/мл гепарина и пенициллин (100 мг/л). В качестве индуктора синтеза нейтрофилокинов использовали микробные клетки Corynebacterium non diphtheriaе густотой 0,5 ОЕ (500 млн.м.т./мл). Контролем служил 0,15 М раствор натрия хлорида. Длительность примирования клеток указанными препаратами составила 4 часа при +370С в атмосфере 5% СО2. После окончания срока инкубации супернатанты получали центрифугированием культуральных жидкостей при 1000 об/мин в течение 10 мин. и изучали регуляторное влияние полученных НфК на фагоцитарную активность макрофагов (Мф) и их устойчивость к апоптогенному действию исследованных штаммов Corynebacterium non diphtheriaе.
Апоптогенную активность штаммов Corynebacterium non diphtheriaе в отношении перитоне-альных Мф мышей изучали до и после добавления НфК in vitro по характерным морфологическим изменениям в клетках при окрашивании по Май-Грюнвальду и докрашиванием по Романовскому-Гимзе [7]. Для исследования использовали микробные взвеси культур коринебактерий густотой 0,5 ОЕ (500 млн.м.т./мл) в разведении 1/10, которые соединяли с перитонеальным экссудатом и НфК в равных объемах.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов «Microsoft Office 2007» и «Statistica 6,0» для Windows XP, а также с помощью статистических таблиц для экспресс-обработки экпериментально-го и клинического материала [10]. Достоверность полученных результатов оценивали при уровне значимости t>2 (Р>95%).
Результаты
Все исследованные виды Corynebacterium non diphtheriaе обладали способностью индуцировать апоптоз Мф (табл.1): количество клеток с апоп-тозом находилось в пределах от 42,8+6,7% до 70,0+6,4%. Никаких отличий при сравнении апоп-тогенной активности коринебактерий, выделенных из различных биотопов, не обнаружено. При сравнении способности различных видов корине-бактерий внутри биотопа индуцировать апоптоз Мф отличия были зарегистрировано только для
Журнал фундаментальной медицины и биологии
оригинальные статьи
Corynebacterium non diphtheriae, выделенных из УГТ. Так, процент Мф с признаками апоптоза, индуцированного С. pseudotuberculosis (70,0+6,4%), был достоверно (t>2, Р>95%) выше, чем вызываемый С. amycolatum (42,8+6,7%) и С. xerosis (45,3+6,8%), изолированных из этого же биотопа.
Добавление в реакционную смесь НфК приводило к повышению устойчивости Мф к апоптогенному воздействию Corynebacterium non diphtheriae. Об
этом свидетельствовало достоверное (&2, Р>95%) снижение средних показателей апоптоза Мф, индуцированного коринебактериями, выделенными из всех исследованных биотопов. При этом апоп-тогенная активность С.pseudotuberculosis, выделенных с кожных покровов (58,8+6,9%) и УГТ (48,4,0+6,6%), достоверно ^>2, Р>95%) превышала таковую других коринебактерий, выделенных из этих же биотопов.
Таблица 1
Апоптогенная активность Corynebacterium non diphtheriae
Процент макрофагов с признаками
Биотоп Вид апоптоза (%+m)
исходный при добавлении НфК
ВДП С.pseudotuberculosis 65,3+6,4 45,0+7,0*
(зев, нос) C.pseudodiphtheriticum 62,3+6,0 30,2+5,9*
Средний показатель 60,6+6,9 35,3+6,8*
С.pseudotuberculosis 69,9+6,5 58,8+6,9
кожа C.pseudodiphtheriticum 55,4+6,8 33,7+6,7* **
С.xerosis 60,1+6,4 31,0+6,6* **
Средний показатель 61,8+6,9 41,2+7,0*
УГТ С.pseudotuberculosis 70,0+6,4 48,4+6,6*
(влагалище, цер- С.атусо1аШт 42,8+6,7 .. 26,0+6,3 **
викальный канал, С.xerosis 45,3+6,8 .. 24,3+6,1* **
моча) Средний показатель 52,7+ 7,1 32,9+6,7*
Условные обозначения:
* - достоверность различий (1>2, Р>95%) между количеством клеток с апоптозом исходным и при добавлении НфК; „ - достоверность различий (1>2, Р>95%) внутри биотопа между количеством клеток с апоптозом, индуцированным С.р8еи^1иЬегси1о818 и другими видами коринебактерий.
Обсуждение
Наиболее выраженное апоптогенное действие было выявлено у С.pseudotuberculosis, выделенных из УГТ. Однако все исследованные виды коринебактерий индуцировали апоптоз Мф. С.pseudotuberculosis, помимо С.diphtheriaе и С.и1сегаш, является единственным известным на сегодняшний день видом коринебактерий, способным продуцировать токсин, имеющий активность фосфолипазы D, сфингомиелиназы и проникающего фактора (10). Однако способность к длительной персистенции в организме и антифагоцитарные свойства коринебактерий связаны не только с действием токсина, но и наличием у них со^-фактора, миколовых кислот, способности продуцировать каталазу и супероксиддисмутазу. По результатам исследований, С.pseudotuberculosis, по сравнению с другими видами коринебактерий, обладал наиболее выраженной способностью индуцировать процессы завершенного фагоцитоза, однако максимальной была и его способность вызывать программированную гибель Мф. По-видимому, высокая апоптогенная активность С.pseudotuberculosis,
обусловленная интерференцией действия его факторов патогенности, обладающих как токсической, так и антифагоцитарной функцией, является одним из способов защиты данного вида коринебактерий от фагоцитоза. Известно, что гибель клеток организма путем апоптоза благоприятна для бактерий, так как при этом не происходит запуска воспалительных реакций [8] и создаются условия для длительной персистенции возбудителя.
Учитывая данные о широком спектре иммуноре-гуляторной активности НфК [9], мы изучили возможность их использования для иммунокоррекции апоптоза Мф, индуцированных Corynebacterium non diphtheriaе. Известно, что одними из доминирующих микроорганизмов, выделяемых при патологии УГТ, являются коринебактерии (60-70%), причем доказана роль некоторых из них (С riegelii, С. urealyticum) в генезе воспалительных заболеваний нижних мочевых путей и уросепсиса [4]. При острых воспалительных заболеваниях ВДП недифтерийные коринебактерии выделяются реже -в 10-15% случаев. По нашим данным, несмотря на то, что фагоцитарная активность Мф была ниже относительно коринебактерий, выделенных
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
из УГТ, устойчивость Мф к апоптогенному действию Corynebacterium non diphtheriaе одинакова вне зависимости от места их выделения. При этом воздействие НфК приводило к снижению апопто-генного эффекта почти всех видов взятых в исследование Corynebacterium non diphtheriaе также вне зависимости от биотопа, из которого они были выделены.
Заключение
Одним из возможных способов реализации патогенного действия Corynebacterium non diphtheriaе является угнетающее влияние на клетки иммунной системы, обусловленное, прежде всего, выраженным апоптогенным действием. Это, по всей
видимости, способствует длительной персистен-ции коринебактерий в организме и, как следствие, развитию воспалительных заболеваний различной локализации.
Изученное влияние НфК, индуцированных недифтерийными коринебактериями, выделенными из различных биотопов, выявило существенное снижение апоптогенной активностикоринебакте-рий в отношении макрофагов.
Результаты исследований указывают на возможность использования НфК для иммунокор-рекции иммунодефицитных состояний, развивающихся на фоне заболеваний, обусловленных Corynebacterium non diphtheriaе, и связанных, вероятно, с их апоптогенным действием на клетки иммунной системы.
ЛИТЕРАТУРА
1. МР 4.2.00.20-11. Фенотипическая идентификация бактерий рода Corynebacterium; утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21.03.2011. - М., 2011. - 55с.
2. Случай раннего неонатального сепсиса, обусловленного C.amycolatum / В.А. Анохин, С.В. Халиуллина, О.А. Назарова [и др.] / Практическая медицина (Казань). - 2012. - №7. -С. 178-180.
3. Этиологическое значение Corynebacterium non diphtheriae у больных с различной патологией // Л.А. Краева, Ж.Н. Ма-нина, Г.Я. Ценева [и др.] / Журн. микробиологии. - 2007. -№ 5. - С. 3-7.
4. A fatal case of urosepsis due to Corynebacterium riegelii / G. Aygun, K. Midilli, H. Cilingir [et al.] / Braz. J. Microbiol. -2013. - Vol.44. - №.2 .-Р. 475-6.
5. Knox, K. Nosocomial endocarditis caused by Corynebacterium amycolatum and other nondiphtheriae Corynebacterium/ K. Knox, A. Nolmes / J. Emerg. Inf. Dis. - 2002. - 8(1) - Р. 97-99.
6. Corynebacterium endocarditis species-specific risk factors and outcomes / J. Belmares, S. Detterline, J.B. Pak [et al.] / BMC Infectious Diseases. 2007. - №6. - Р. 7-14.
7. Роль Corynebacterium non diphtheriae в индукции апоптоза макрофагов мышей / Г.Г. Харсеева, Н.А. Воронина, Э.Л. Алу-тина [и др.] / Иммунопатол., аллергол., инфектол. - Витебск,
2012. - №1. - С. 56-59.
8. Тюкавкина, С.Ю. Роль апоптоза в формировании иммунопатологических процессов, способствующих развитию инфекционных заболеваний / С.Ю. Тюкавкина / Иммунология. -
2013. - № 1. - С. 52-56.
9. Влияние нейтрофилокинов на синтез лимфокинов в процессе формирования противочумного иммунитета / Г.И. Васильева, В.Н. Козловский, А.К. Киселева [и др.] / Журн.микро-биол. - 2005. - №1. - С. 61-65.
10. Стрелков, Р.Б. Статистические таблицы для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала / Р.Б. Стрелков. - Обнинск, 1980. - 18 с.
