CC BY
17
ПРОЧИЕ ИНФЕКЦИИ
гриппа НШ1и H0N1, которые некоторыми исследователями относятся к дрейф-вариантам одного и того же возбудителя (Taubenberger J.K., 2006). По нашим результатам, людей с положительными сыворотками к вирусу H0N1 на 8 % больше, чем к H1N1.
Более трети иркутян имеют иммунитет к вирусу гриппа В, что свидетельствует о том, что вирус гриппа В наряду с вирусами гриппа А имеет большое значение в эпидемическом процессе гриппоподобных заболеваний.
Проведение сероэпидемиологических исследований на наличие антител к вирусу гриппа имеет большое значение, так как на их основании можно произвести оценку состояния популяционного иммунитета, проконтролировать и спрогнозировать эпидситуацию среди конкретных групп населения. И, безусловно, зная современное состояние проблем гриппа и коллективного иммунитета у людей, можно дать прогноз дальнейшего развития и помочь в противодействии вирусным угрозам.
АПОПТОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ КОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ В ОТНОШЕНИИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШЕЙ
Э.Л. Алутина, Г.Г. Харсеева
ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Целью работы явилось изучение апоптогенной активности токсигенных штаммов C.diphtheriae на ма-крофагальной модели беспородных белых мышей.
Материалы и методы. В работе были исследованы штаммы: C.diphtheriae gravis tox + №665 из коллекции ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича Минздравсоцразвития России, C.diphtheriae gravis tox+, выделенный от больного дифтерией в г. Ростове-на-Дону, штаммы S.aureus, S.epidermidis, S.pyogenes, P.aeruginosae, выделенные из верхних дыхательных путей в диагностически значимом количестве (10-5 и 10-6 ) от больных фарингитом, тонзиллитом и фолликулярной ангиной.
Апоптогенную активность исследованных штаммов микроорганизмов определяли на белых беспородных мышах (18-20 г) из питомника ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора. Умерщвление животных осуществляли методом цервикальной дислокации после предварительной наркотизации с помощью тио-пентала натрия в дозе 5 мг/кг. Объектом исследования служили перитонеальные макрофаги беспородных белых мышей. Клетки получали после создания асептического воспаления через 4 суток после внутрибрюшин-ного введения 1 % пептонной воды. Макрофаги собирали путем промывания брюшной полости мышей средой 199 (2 мл), содержащей гепарин 5 ед/мл, 20 %-ную ин-активированную сыворотку и пенициллин - 100 ед/мл. Далее в заданных объемах перитонеальный экссудат соединяли с микробными взвесями и выдерживали 1 и 3 часа, после чего покровные стекла с адгезированны-ми на них клетками промывали в физиологическом растворе, высушивали на воздухе. Мазки фиксировали 96 %-ным раствором этилового спирта и окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимзе. Стекла просматривали в микроскопе при увеличении 90x7. В мазках подсчитывали процент клеток с апоптозом. Средний показатель вычисляли по трем экспериментам.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов «Microsoft Office 2007» и «Statistica 6.0» для Windows XP. Достоверность полученных данных оценивали при уровне значимости t>2 (P>95 %).
Результаты исследования показали, что токсиген-ные штаммы коринебактерий, обладая широким спектром патогенных свойств, способны вызывать апоптоз перитонеальных макрофагов мышей. При исследовании апоптогенного действия штаммов Cdiphtheriae gravis tox + № 665 и Cdiphtheriae gravis tox+, выделенного от больного дифтерией, были обнаружены изменения в макрофагах, характерные для апоптоза: ядерное и цитоплазматическое уплотнение, сниженный тур-гор мембраны и формирование «апоптических тел», то есть фрагментация ядра.
Причем апоптогенная активность штамма Cdiphtheriae gravis tox+, выделенного от больного дифтерией (52,8±6,4 %), достоверно не отличалась от таковой штамма Cdiphtheriae gravis tox + № 665 (41,4±6,0 %) при культивировании их на плотной питательной среде - сывороточном агаре. Учитывая, что основным фактором вирулентности возбудителя дифтерии является экзотоксин, представляло интерес исследовать его воздействие на макрофаги. Для этого штаммы дифтерийных микробов культивировали на жидкой питательной среде - сывороточном бульоне и исследовали апопто-генное действие экзотоксина, содержащегося в над-осадочной жидкости. Результаты исследования показали, что показатели апоптоза макрофагов, индуцированные штаммом Cdiphtheriae gravis tox+, выделенным от больного дифтерией, (84,0±2,9 %), были достоверно (t>2) выше, чем у штамма Cdiphtheriae gravis tox + № 665 (55,4±3,9 %). Следует отметить, что апоптоген-ная активность двух исследованных штаммов возбудителя дифтерии была выше (t>2) при культивировании их в жидкой питательной среде, чем на плотной.
НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК
При исследовании апоптогенного воздействия циркулирующего штамма C.diphtheriae gravis tox+ в сочетании с S.pyogenes на макрофаги мышей было выявлено достоверное его увеличение (71 ±5,8 %). В то же время показатели апоптоза циркулирующего штамма C.diphtheriae gravis tox+ в сочетании с P.aeru-ginosae были достоверно (t>2) снижены (10,1±4,3 %). Апоптогенная активность токсигенных штаммов коринебактерий дифтерии с другими представителями микрофлоры верхних дыхательных путей -S.epidermidis (64,6±6,2 %), S.aureus (53,2±6,5 %) -не изменялась.
Обсуждение. Токсигенные штаммы возбудителя дифтерии обладают способностью индуцировать апоп-
тоз макрофагов, что обусловлено, по-видимому, действием дифтерийного экзотоксина. Причем, апопто-генное действие возбудителя дифтерии усугубляется в присутствии S.pyogenes. Данный факт может быть обусловлен их синергическими свойствами, связанными с массивной диффузией токсических веществ, выделяющихся в процессе жизнедеятельности стрептококков, и повышением проницаемости клеточных барьеров в зоне инокуляции возбудителя дифтерии. Такие межмикробные взаимодействия способствуют персистенции возбудителя дифтерии в присутствии S.pyogenes на слизистой миндалин и формированию затяжного бактерионосительства на фоне хронических тонзиллитов и ОРВИ.
РОЛЬ АПОПТОЗА, ИНДУЦИРОВАННОГО CORYNEBACTERIUM NON DIPHTHERIAE, В АЛЬТЕРАЦИИ МАКРОФАГОВ МЫШЕЙ
Г.Г. Харсеева, Н.А. Воронина, Н.И. Мамычева, Н.А. Голованова Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону
Цель работы - оценка патогенности штаммов Corynebacterium non diphtheriae по показателям апоптоза макрофагов белых мышей.
Материалы и методы. Исследованы штаммы Corynebacterium non diphtheriae (C.pseudotuberculosis, C.xerosis, C.amycolatum, C.striatum) (51 шт.), выделенные из влагалища, цервикального канала и мочи в бактериологических лабораториях ГУЗ «Областная детская больница» г. Ростова-на-Дону и МУЗ «Горбольница №1» г. Гуково Ростовской области от больных острым кольпитом, хроническим и острым пиелонефритом и беременных, а также лиц, проходивших профилактическое обследование за период с 2009 по 2011 г. Штаммы Corynebacterium non diphtheriae идентифицировали общепринятыми методами по морфологическим, тинк-ториальным, культуральным и биохимическим свойствам на питательных средах в соответствии с указаниями Н.Н. Костюковой (2002 г.).
Исследование апоптогенной активности штаммов Corynebacterium non diphtheriae проводили на белых беспородных мышах (18-20 г) из питомника ФГУЗ «Рос-товский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора. Умерщвление животных осуществляли методом цервикальной дислокации после предварительной наркотизации с помощью тиопентала натрия в дозе 5 мг/кг. Объектом исследования послужили перитонеальные макрофаги мышей. Клетки получали после асептического воспаления, вызванного внутрибрюшинным введением 1 % пептонной воды рН 7,2 (2 мл). Макрофаги получали через 4 суток после введения пептона. Взятие клеток проводили промыванием брюшной полости животных средой 199 (10 мл), содержащей 5 ед/мл гепарина, 20 % инактивированной (56 °С, 30 мин.) сыворотки крови человека и пенициллин - 100 ед/мл. Полученный экссудат смешивали со взвесями культур Corynebacterium
non diphtheriae в концентрациях 1:10 и 1:100 (0,1 мл) и подслаивали под покровное стекло, вложенное в стерильный пенициллиновый флакон. Флаконы, в которых покровные стекла находились на внутренней верхней стенке, инкубировали при +37 °С в течение часа. Контролем явилась культура макрофагов, к которой добавляли растворитель без микробной взвеси. Затем стекла промывали в 6 порциях стерильного раствора Хенкса, переносили в стерильные пенициллиновые флаконы с 2 мл среды 199 с 20 % инактивированной сыворотки и пенициллина - 100 ед/мл и вновь инкубировали при 37 °С 5 часов. После инкубации стекла подсушивали, фиксировали 20 минут и окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимзе. Мазки высушивали и на предметных стеклах с помощью иммерсионного масла просматривали в микроскопе при увеличении 90x7. В мазках подсчитывали процент клеток с апоптозом. Средний показатель вычисляли по трем экспериментам. Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов «Microsoft Office 2007» и «Statistica 6.0» для Windows XP. Достоверность полученных данных оценивали при уровне значимости t>2 (P>95 %).
Результаты. Штаммы Corynebacterium non diphtheriae (C.pseudotuberculosis, C.xerosis, C.amycolatum, C.striatum), выделенные из влагалища и цервикального канала, обнаруживали в количестве III-IV степени, из мочи - 105 и 106, что расценивали как диагностически значимый показатель, свидетельствовавший об этиологической роли данных микроорганизмов в инфекционном процессе. Установлено, что 55 % штаммов коринебактерий выделяли в ассоциации с другими микроорганизмами. Среди микробов-ассоциантов обнаруживали следующих представителей: E.faecalis, S.epidermidis, E.coli, P.mirabilis, K.pneumoniae и S.saprophyticus. Исследованы штаммы C.pseudotuberculosis и C.xerosis, выде-
