CC BY
38
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьев Е. В., Перевозчиков А. П. Исследование экспрессии гена аполипопротеина A-I на ранних стадиях эмбриогенеза человека методом гибридизации in situ // Онтогенез. 1992. Т. 23. № 5. C. 469-479.
2. Климов А. Н., Никульчева Н. Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. СПб.: Питер-Пресс, 1995.
3. Baroukh N. et al. Expression and secretion of human apolipoprotein A-I in the heart // FEBS Lett. 2004. № 557. P. 1-3.
4. Higuchi K. et al. Tissue-specific expression of apolipoprotein A-I (ApoA-I) is regulated by the 5'-flanking region of the human ApoA-I gene // J. Biol. Chem. 1988. № 263. P. 18530-18536.
5. Kardassis D. et al. Transcriptional regulation of the genes involved in lipoprotein transport. The role of proximal promoters and long-range regulatory elements and factors in apolipoprotein gene regulation // Hypertension. 1996. № 27. P. 980-1008.
6. Landry J.-R. et al. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes // Trends in Genetics. 2003. Vol. 19. № 11. P. 640-648.
7. Orlov S. V. et al. Effect of TNFalpha on activities of different promoters of human apolipoprotein A-I gene // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010. Vol. 398. № 2. P. 224-230.
8. Richardson B. et al. Human placental tissue expresses a novel 22.7 kDa apolipoprotein A-I-like protein // Biochemistry. 1996. № 35. P. 7580-7585.
РЕЗЮМЕ
Е. Г. Виленская, А. В. Туаева, А. М. Ефремов, Э. Б. Диже, И. А. Лапиков, Д. А. Могиленко, С. В. Орлов, А. П. Перевозчиков
Эффект бактериального липополисахарида на экспрессию гена аполипопротеина A-I мыши
Описано явление альтернативной транскрипции гена аполипопротеина A-I мыши. Найдено два альтернативных промотора - дистальный и проксимальный. Картирована дисталь-ная альтернативная точка инициации транскрипции данного гена с координатой -414-п.н. относительно канонической. Измерен уровень транскрипции гена апо A-I мыши с трех разных промоторов для различных органов животных при развитии в норме и под действием липополисахарида.
Ключевые слова: аполипопротеин A-I, альтернативный промотор, липополисахарид.
SUMMARY
E. G. Vilenskaya, A. V. Tuaeva, A. M. Efremov, E. B. Dizhe, I. A. Lapikov, D. A. Mogilenko, S. V. Orlov, A. P. Perevozchikov
Effect of lipopolysaccharide on murine apolipoprotein A-I gene expression
Alternative transcription of murine apolipoprotein A-I gene is presented. Two alternative promoters were found - distal and proximal. The distal transcription start point was found-414b.p. upstream of the canonical one. We analyzed the transcriptional level of murine apo A-I gene from three different promoters in various organs of animals under normal conditions and after systemic lipopolysaccharide injection.
Key words: apolipoprotein A-I, alternative promoters, lipopolysaccharid.
© Е. Е. Ларионова, А. Д. Денисенко, 2012 г. УДК 577.352:612.014:577.7
Е. Е. Ларионова, А. Д. Денисенко
ВЛИЯНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ И ЛИПО-ПРОТЕИНОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ НА АПОПТОЗ МАКРОФАГОВ
Отдел биохимии, лаборатория липопротеидов Научно-исследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург
ВВЕДЕНИЕ
Атеросклероз - это хроническое воспалительное заболевание, в развитии которого важную роль играют модифицированные липопротеины низкой плотности (ЛПНП). Ведущей модификацией ЛПНП в организме человека является перекисная модификация. Перекисно-модифицированные ЛПНП (оксЛПНП), проникая в сосудистую стенку, запускают цепь событий, приводящих
к формированию атеросклеротических поражений. Так, в ответ на поступление в интиму оксЛПНП эндотелиаль-ные клетки экспрессируют молекулы адгезии для моноцитов и лимфоцитов, которые, проникая в стенку, принимают участие в местном воспалительном ответе. Моноциты трансформируются в макрофаги, экспрессируют на своей поверхности скэвенджер-рецепторы, интенсивно фагоцитируют оксЛПНП, превращаются в пенистые клетки и активно секретируют провоспалительные цито-кины. Кроме того, оксЛПНП обладают цитотоксическим действием, вызывая апоптоз макрофагов в стенке артерий. Однако роль апоптотической гибели клеток в очаге атеросклеротического повреждения изучена не полностью. По мнению некоторых авторов, апоптоз клеток атеросклеротической бляшки уменьшает ее целлюляр-ность, что ведет к уменьшению размеров атеросклеротической бляшки; по мнению других авторов, апоптоз клеток и дальнейший фагоцитоз апоптотических телец ведет к вторичному некрозу макрофагов и формированию некротического ядра атеромы [7]. Также остается не до конца выясненным механизм передачи апоптозного сигнала в атеросклеротических поражениях.
Низкий уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) является одним из главных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний. Имеются сведения, что
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
ЛПВП могут обеспечивать выживание эндотелиальных клеток, уменьшая их гибель от апоптоза [5]. Однако эти свойства ЛПВП исследованы не полностью и требуют дальнейшего изучения. Исходя из этого, задачей настоящего исследования явилось изучение апоптоза первичных макрофагов человека, вызванных оксЛПНП, и влияние ЛПВП на этот процесс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Липопротеины (ЛП) были выделены методом последовательного ультрацентрифугирования [2]. Были получены ЛПНП (d=1,023-1,055) и ЛПВП (d=1,065-1,21ЛП диалиювсши i iporuH фосфатно-солевого буфера в течение 24 часов при 4 °С. ЛП стерилизовали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. ЛПНП модифицировали с помощью инкубации в стерильных условиях в присутствии кислорода в течение 5 суток. Степень перекисного окисления ЛППН определяли по содержанию малонового диальдегида. Концентрация белка была определена методом Лоури в модификации Марквелла [4].
Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) были выделены с помощью центрифугирования в течение 30 минут в градиенте плотности Фиколла (плотность -1,077 г/мл) («Био-лоТ») из цельной крови здорового донора. МКПК однократно отмывали стерильным фосфатно-солевым буфером при комнатной температуре и центрифугированы при 1500 об./мин в течение 10 минут. После удаления супернатанта МКПК были высеяны на 96 луночные планшеты (Sarstedt) плотностью 1,5x1с5 клеток/лунку в питательной среде RPMI-1640 («БиолоТ»), содержащей 10 % эмбриональной бычьей сыворотки HyClone. Клетки инкубировали 2 часа в атмосфере 5 % CO2 при 37 оС, двукратно отмывали стерильным раствором Хенк-са («БиолоТ») при комнатной температуре, затем в каждую лунку было добавлено 0,2 мл питательной среды. На 3-и сутки инкубации питательную среду меняли на свежую. На 5-е сутки клетки помещались в бессывороточную среду, к которой были добавлены на-тивные ЛПНП (нЛПНП) или оксЛПНП в концентрации 50 и 100 мкг/мл. ЛПВП добавляли в концентрации 400 мкг/мл. На 6-е сутки клетки двукратно отмывали 0,02 %-м раствором Версена («БиолоТ») комнатной температуры, затем обрабатывали раствором трипсина («БиолоТ»),
инкубировали 20 минут при 37 0С и переносили в пробирки с культуральной средой, содержащей FCS.
Цитотоксичекий эффект ЛПНП оценивался с использованием ФИТЦ-меченного аннексина V в комбинации с пропидий йодидом (Santa Cruz Biotechnology). Апопто-тическая клетка проходит ряд быстрых морфологических изменений, каждое из которых указывают на определенную стадию клеточной смерти. Показателем раннего апоптоза является быстрое перемещение фосфатидилсерина с внутреннего слоя цитоплазматической мембраны на наружный и накопление его на внешней поверхности кле-
[А] F11 INT / FW 5NT
: Ann-PI* ; 0,305t Дпп+Р1* ;
0,52?,
- ■ -■
_ Ann-Pl ■ : 97,50c= ■ ./. Агп"-Р1- :
1,39?»
ШшЩщМ
[A] FL1 IHT / FL4 INT
JAnn-PI* : 0,75=,
Ann-Я : 93,52": 1
«т
"Апп<-Р1- :
1С5
Gate
All
АПП*Р1-Ann+Ph АПП-PI -АШ1-Р1-
в
FL1IMT Number Mated
FL1 INT
10073 140 52 9851 30
1 ÖO,00 1,39 0,52 97,SO 0,30
Gate Number %Gated
AU 10135 100,00
Ann*PI 464 4,58
ДГП+PI- 117 1,15
Ann-Pl- 9478 93,52
АЛП PI- 76 0,75
Влияние окисленных липопротеинов низкой плотности и липопротеинов высокой плотности на выживаемость первичных макрофагов человека: а - первичные макрофаги человека, инкубация 24 часа с оксЛПНП 50 мкг/мл; б - первичные макрофаги человека, инкубация 24 часа с оксЛПНП 100 мкг/мл; в - первичные макрофаги человека. Контроль (инкубация в отсутствие ЛП); г - первичные макрофаги человека, инкубация 24 часа с оксЛПНП 100 мкг/мл и 400 мкг/мл ЛПВП
точной мембраны. Этот процесс может быть зафиксирован при использовании связывающей способности аннексию V, который является кальцийзависимым фосфолипид-связывающим белком, который преимущественно связывается с фосфатидилсерином. Таким образом, окрашивание клеток аннексином V свидетельствует о ранней стадии апоптоза. Когда же клетка проходит раннюю стадию апоптоза, нарушается целостность ее мембраны, что позволяет пропидий-йодиду проникать внутрь клетки. Это приводит к выраженной желто-красной флюоресценции цитоплазмы клеток, что позволяет оценивать такие клетки как находящиеся в позднем апоптозе или, преимущественно, в стадии некроза.
Для оценки цитотоксического эффекта ЛП клетки после трипсинизации и помещения в культуральную среду с FCS центрифугировали при 3000 об./мин 5 минут, аспи-рировали супернатант, затем двукратно промывали в PBS. Затем к клеткам добавляли 100 мкл буфера для анализа, содержащего 1 мкл аннексина V и 5 мкл пропидий-йоди-да, инкубировали 15 минут в темноте при комнатной температуре, добавляли по 300 мкл буфера для анализа в каждую пробирку и исследовали методом проточной цитоф-луориметрии.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При инкубации первичных макрофагов человека с нативными ЛПНП в концентрациях 50 и 100 мкг/мл в течение 24 часов количество клеток, окрашенных аннексином V (ранний апоптоз) или йодидом пропидия (поздний апоптоз), не отличалось от количества клеток с соответствующей окраской, инкубированных в отсутствие ЛПНП (данные не представлены). Иными словами, нативные ЛПНП не вызывали гибели клеток. В то же время добавление к инкубационной среде оксЛПНП в концентрациях 50 и 100 мкг/мл существенно увеличивало гибель макрофагов. Причем наблюдалось дозозависимое увеличение гибели клеток (рисунок). Так, при инкубации с оксЛПНП в концентрации 50 мкг/мл, количество клеток, имеющих ранние признаки апоптоза, увеличивалось в 3 раза (рисунок, а - Ann+PI-) по сравнению с контролем (рисунок, в -Ann+PI-) и составляло 4,5 %, против 1,4 % в контроле. При повышении концентрации оксЛПНП до 100 мкг/мл количество клеток с признаками раннего апоптоза возрастало в 5 раз (рисунок, б - Ann+PI-) по сравнению с контролем (рисунок, в - Ann+PI-) и достигало 7,8 %. Количество клеток, находящихся на поздних стадиях апоптоза (Ann+PI+), при инкубации с оксЛПНП в концентрациях 50 и 100 мкг/мл также возрастало по сравнению с контролем в 3 и 5 раз соответственно, и составляло 1,8 и 2,6 % против 0,5 % в контроле. Помимо этого, добавление в среду инкубации макрофагов оксЛПНП приводило к увеличению числа клеток, окрашивающихся иодитом пропидия (Ann-PI+), т. е. находящихся в стадии некроза или, возможно, терминальной стадии апоптоза: в контроле число таких клеток составляло 0,3 %, а при инкубации с оксЛПНП в различных концентрациях - 4,1 и 8,0 %.
Таким образом, окисленные ЛПНП обладают выраженным цитотоксическим действием на макрофаги, что соответствует полученным ранее сведениям [3].
Особый интерес представляют данные о влиянии ЛПВП на апоптоз первичных макрофагов вызванный оксЛПНП.
При совместной 24-часовой инкубации макрофагов с оксЛПНП и ЛПВП наблюдалось значительное уменьшение как раннего, так и позднего апоптоза, а также увеличение количества жизнеспособных клеток (рисунок, г). Добавление ЛПВП в концентрации 400 мкг/мл к инкубационной среде, содержащей оксЛПНП (100 мкг/мл), в значительной степени предупреждало индуцированную окисленными ЛПНП гибель макрофагов. Так, ранний и поздний апоптоз уменьшались примерно в 2 раза, а некроз - более чем в 10 раз. Это, естественно, сопровождалось увеличением количества жизнеспособных клеток.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ЛПВП способны предупреждать индуцированную оксЛПНП гибель первичных макрофагов человека in vitro.
ЛПВП являются гетерогенными по своей структуре, метаболизму и биологическим функциям частицами. Уменьшение цитотоксических эффектов оксЛПНП может быть связано со способностью аполипопротеина А I -основного аполипопротеина ЛПВП - превращать активные гидроперекиси ЛПНП в неактивные, а акцептировать молекулы липидных гидроперекисей из ЛПНП, уменьшая тем самым степень их окисления [8]. Также, по-видимому, параоксоназы, ассоциированные с ЛПВП, играют большую роль в уменьшении пероксидации ЛПНП и снижении их цитотоксичности [9]. Вполне возможно также, что ЛПВП могут активировать сигнальный путь, ведущий к активации белковой киназы AKT, которая, в свою очередь, инактивирует проапоптотический белок BAD, который участвует в активации каспаз 3 и 9 [5].
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что окисленные ЛПНП оказывают цитотоксическое воздействие на макрофаги, вызывая их апоптоз, а также некроз. ЛПВП обладают способностью уменьшать указанные эффекты оксЛПНП. Это позволяет предполагать, что судьба макрофагов в атеросклеротических поражениях артерий во многом зависит от соотношения концентраций проатерогенных оксЛПНП и антиатерогенных ЛПВП.
ЛИТЕРАТУРА
1. Blanco-Molina A. et al. High-density lipoproteins protect endothelial cells from apoptosis induced by oxidized low-density lipoproteins // Protoplasma. 2000. Vol. 211. № 3-4. P. 198-206.
2. HavelR. J., Eder H. A., Bragdon J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum // J. Clin. Invest. 1955. Vol. 34. P. 1345-1353.
3. Lee T-S., Chau L.-Y Fas/Fas ligand-mediated death pathway is involved in oxLDL-induced apoptosis in vascular smooth muscle cells // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2001. Vol. 280. P. 709-718.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
4. MarkwellM. A. K. et al. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples // Anal. Biochem. 1978. Vol. 87. P. 207-210.
5. Nofer J.-R. et al. Suppression ofEndothelial Cell Apoptosis by High Density Lipoproteins (HDL) and HDL-associated Lysosphi-ngolipids // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. Is. 37. P. 34480-34485.
6. Tabas I. Consequences and Therapeutic Implications of Macrophage Apoptosis in Atherosclerosis. The Importance of Lesion Stage and Phagocytic Efficiency // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2005. Vol. 25. P. 2255-2264.
7. Terasaka N. et al. High-density lipoprotein protects macrophages from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by promoting efflux of 7-ketocholesterol via ABCG1 // PNAS. 2007. Vol. 104. № 38. P. 15093-15098.
8. Zerrad-SaadiA.et al. HDL3-Mediated Inactivation of LDL-Associated Phospholipid Hydroperoxides Is Determined by the Redox Status of Apolipoprotein A-I and HDL Particle Sur-face Lipid Rigidity. Relevance to Inflammation and Atherogenesis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2009. Vol. 29. P. 2169-2175.
9. Zhang C. et al. Studies on protective effects of human paraoxonases 1 and 3 on atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice // Gene Therapy. 2010. Vol. 17. P. 626-633.
РЕЗЮМЕ
Е. Е. Ларионова, А. Д. Денисенко
Влияние модифицированных липопротеинов низкой плотности и липопротеинов высокой плотности на апоптоз макрофагов
Перекисно-модифицированные ЛПНП вызывали цитопатоген-ный эффект in vitro на первичные макрофаги человека, вызывая как апоптоз, так и некроз клеток. Этот эффект окисленных ЛПНП был дозозависимым. ЛПВП уменьшали индуцированную окисленными ЛПНП гибель клеток, находящихся как в раннем, так и в позднем апоптозе.
Ключевые слова: липопротеины низкой плотности, апоптоз, макрофаги, липопротеины высокой плотности.
SUMMARY
E. E. Larionova, A. D. Denisenko
The influence of modified low density lipoproteins and of high density lipoproteins on macrophage apoptosis
Oxidized low density lipoproteins induced in vitro apoptosis and necrosis in human monocyte-derived macrophages in a dose dependent manner. High density lipoproteins decreased both the initial and advanced macrophage apoptosis induced by oxidized low density lipoproteins.
Key words: low density lipoprotein, apoptosis, macrophages, high density lipoprotein.
© Коллектив авторов, 2012 г. УДК 616-008-841.5-08
Т. Ф. Субботина, М. О. Новак, Ю. В. Картышкина, А. С. Щурева, М. А. Думпис
ВЛИЯНИЕ ФУЛЛЕРЕНОЛА С60(ОН)24 НА ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА IN VITRO
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова
Фуллерены - молекулярные соединения, принадлежащие классу аллотропных форм углерода и представляющие собой выпуклые замкнутые многогранники, составленные из четного числа трехкоординированных атомов углерода. Фуллерены, а особенно их водорастворимые формы, рассматриваются как перспективные агенты в наномедицине. Интенсивно разрабатываются подходы, позволяющие использовать их в качестве фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии, антиоксидантов, противовирусных и бактерицидных агентов, а также в качестве векторов для адресной доставки лекарственных веществ [3]. Тем не менее сведения об их взаимодействии с биологическими структурами пока не полны. В частности, в доступной литературе практически отсутствуют сведения о влиянии полигидроксилированных фуллеренов (фуллерено-
лов) на показатели свертывающей системы и фибри-нолиза in vitro.
Целью настоящей работы являлось изучение влияния модифицированного фуллерена С60(0Н)24 на показатели системы плазменного гемостаза здоровых доноров.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проведено на пулах бедной тромбоцитами цитратной плазмы лиц без нарушений системы гемостаза, предоставленных центром лабораторной диагностики СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. Фуллеренол С60(0Н)24 был предоставлен НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН. В работе использованы фибриноген и тромбин человека («Технология-Стандарт», г. Барнаул), наборы реактивов для определения тромбинового времени, протромбина («Техпластин-тест») и активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) («Технология-Стандарт», г. Барнаул), а также тканевой активатор плазминогена (т-АП) (Actilyse, Boehringer-Ingelheim, Германия).
В клоттинговых тестах раствор фуллеренола в 0,9 %-й NaCl добавляли в тестовые системы за 1 минуту до инициации свертывания в количестве 0,01-0,1 мл; контрольные образцы содержали такое же количество растворителя - 0,9 %-й NaCl. Исходная концентрация фуллеренола (маточный раствор) составляла 1 мг/мл, или 870 мкМ.
Динамику фибринообразования и фибринолиза оценивали турбидиметрическим методом [2] с небольшими модификациями. В стандартном эксперименте свертывание и последующий фибринолиз инициирова-
