CC BY
44
УДК 577.125:577.112.856
Л.М. Поляков, Д.В. Суменкова, Г.С. Русских, И.Ф. Усынин, Т.В. Зуева
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ БЕЛКОВОГО И ЛИПИДНОГО КОМПОНЕНТА ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ РЕЗИДЕНТНЫМИ МАКРОФАГАМИ
НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
В работе показано участие резидентных макрофагов в метаболической деградации белкового и липидного компонента липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Обнаружено увеличение скорости электрофоретической подвижности ЛПНП-частиц к аноду в геле агарозы. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноэлектроблоттинга показано, что после инкубации ЛПНП с резидентными макрофагами печени наряду с основными формами аполипопротеина В (В-100; В-74; В-48) появлялось до 15 дополнительных, четко выраженных белковых полос с молекулярными массами от 10 до 100 кДа, что подтверждает участие макрофагов в протеолитическом расщеплении белкового компонента ЛПНП. Окисление липидного компонента ЛПНП макрофагами приводило к накоплению продуктов перекисного окисления липидов и появлению ярко выраженного пика с максимумом флуоресценции в области 460 нм.
Ключевые слова: резидентные макрофаги, липопротеины низкой плотности, аполипопроте-ин В, окисление липидов.
В Институте биохимии СО РАМН изучены молекулярные механизмы участия резидентных макрофагов в регуляции экспрессии генов в ге-патоцитах [1]. Они связаны с рецептор-опосредо-ванным эндоцитозом макрофагами липопротеинов различных классов. В связи с этим, нами было изучено влияние печеночных и перитонеальных макрофагов на метаболическую деградацию белкового и липидного компонента липопротеинов низкой плотности.
Методы исследования
Исследования выполняли на перитонеальных макрофагах мышей-самцов линии C57BL/6J 3-4 месячного возраста и на макрофагах печени (клетки Купфера) крыс-самцов линии Вистар массой 180-200 г. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу М3 СССР от 12.08.1977 г № 755).
Перитонеальные макрофаги получали из перитонеального лаважа мышей, примированных in vivo 4% раствором крахмала за 3-5 дней до взятия материала [2]. Клетки культивировали в 35 мм чашках Петри «Costar» (3х Ю6 клеток на чашку) в среде RPMI-1640 («Биолот», Россия), pH 7,4, содержащей 20 мМ HEPES («ICN Biomedicals, Inc», США), при 37 °С, в атмосфере, содержащей 5% С02 и 95% воздуха (С02-инкубатор, «Со1е-Рагтег», США). Липопротеины низкой плотнос-
ти добавляли к среде инкубации в концентрации
0,5 мг белка на 1 мл среды.
Резидентные макрофаги печени выделяли методом рециркуляторной ферментативной перфузии с использованием 0,03% раствора коллагена-зы [3] (активность > 125 ед/мг, «ICN Biomedicals, Inc», США) с последующей очисткой непаренхимных клеток с помощью противоточного центрифугирования в элютриаторном роторе JE-6 центрифуги J2-21 «Beckman» (США) [4]. Выделенные макрофаги инкубировали вышеописанным методом.
Выделение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) из плазмы крови человека проводили флотацией в растворах КВг [5] на ультрацентрифуге «Optima L-90K, Beckman-Coulter» (Австрия) с использованием ротора 70.1 Ti. Полученные ЛПНП диализовали в течение 24 ч против 0,05 М калий-фосфатного буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl при 4 °С. Анализ метаболической деградации липопротеинов осуществляли с помощью электрофореза в 1% геле агарозы с трис-барбитуратным буфером при pH 8,6 [6] и диск-электрофореза в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия [7]. Белковые полосы визуализировали 0,1% Кумасси G-250 в смеси метанола и 10% уксусной кислоты (1:1) и ионами серебра с использованием наборов «ДИА-АР» (Россия). В качестве маркеров использовали набор низкомолекулярных белков-стандартов (фосфорилаза — 94 кДа, альбумин — 67 кДа,
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 г.
49
овальбумин — 43 кДа, карбоангидраза — 30 кДа, лактальбумин 14,4 кДа и инсулин — 6 кДа).
Иммуноэлектроблотi н г ироводил 11 «полусухим» методом с использованием нитроцеллю-лозных мембран «Schleicher & Schuell» (ФРГ) с диаметром пор 0,45 мкм |8]. Специфические антитела против человеческого аполипопротеина В получали описанным нами ранее методом [9]. Флуоресцентную спектроскопию проводили на спектрофлуориметре MPF-4 «Хитачи» (Япония) при длине волны возбуждения 285 нм и эмиссии в диапазоне 300-600 нм.
Результаты исследования
Метаболическую деградацию липопротеинов низкой плотности перитонеальными макрофагами изучали через 2 п 24 ч инкубации с помощью электрофореза в геле агарозы. На рис. 1 видно, что через 2 ч инкубации подвижность фракции ЛПНП увеличивалась. Повышение скорости миграции к аноду было более выражено при длительной инкубации (24 ч) ЛПНП с макрофагами. Увеличение скорости миграции к аноду свидетельствует о метаболической деградации липопротеиновых частиц.
Для сравнительной оценки метаболической деградации липопротеинов макрофагами проведены аналогичные исследования с полиморфноядер-ными лейкоцитами — нейтрофилами. Известно, что нейтрофилы не только оказывают влияние на функцию макрофагов, но также проявляют цито-лнтический и цитостатический эффект на опухолевые клетки, действуют на систему комплемента. Нами не обнаружено влияние нейтрофилов на подвижность ЛПНП в геле агарозы при 2-ча-совой инкубации. Однако длительная инкубация в течение 24 ч приводила к повышению скорости миграции лииопротенновых частиц к аноду, что указывает на возможность участия нейтрофилов в метаболической деградации липопротеинов.
Следующая часть работы была выполнена на клетках Купфера — резидентных макрофагах печени. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле показано, что после инкубации ЛПНП с резидентными макрофагами печени наряду с основными формами аполипопротеина В (В-100: В-74; В-48) появляются белковые полосы с молекулярными массами от 10 до 100 кДа (Рис. 2). Отметим, что накопление дополнительных белковых продуктов зависело от времени инкубации. При инкубации в течение 2 ч появилось 15 дополнительных, четко выраженных полос белков. Это говорит о том, что в макрофагах происходит дезинтеграция ЛПНП и последующий лимитированный протеолиз входящих в их состав белков. Так, изданных литературы известно, что в метаболической деградации липопротеинов
макрофагами участвуют протеиназы (катепсин Е О и др.), способные гидролизовать аполипопроте пн В [10]. Данный механизм может реализоватьс и в среде инкубации макрофагов после секреції ими лизосомальных гидролаз.
В модельных системах Пиха и соавторов [11 установлено, что протеолиз ЛГІНП трнпсино\ химотрипсином или проназой приводит к образе ванию п высвобождению фрагментов аполипоп рогеина В из ЛПНП и запускает процесс слияни. частиц. При инкубации обработанных протеина зам и частиц ЛПНП с макрофагами только аг
1 2 3 4 5
Рис. 1. Исследование электрофоретической подвижности ЛПНП в 1 % геле агарозы после инкубации с перитонеальными макрофагами и нейтрофилами. Окраска Кумасси С-250.
1 — ЛПНП; 2 — ЛПНП + перитонеальные макрофаги (инкубация 2 ч); 3 — ЛПНП + перитонеальные макрофаги (инкубация 24 ч);4 — ЛПНП + нейтрофиль (инкубация 2 ч); 5 — ЛПНП + нейтрофилы (инкубация 24 ч)
12 3 4 апоВ-100
ш • f я *--1 — апоВ-74
\ 1 '1 _ апоВ-48
— 94кДа
— 67 кДа
Ц — 43 кДа
« —ЗОкДа —14кДа
——|-ЙЩИ-бкДа
Рис. 2. Электрофореграмма белков среды кондиционирования резидентных макрофагов печени после инкубации с ЛПНП.
Полиакриламидный гель (12%), окраска серебром.
1 — ЛПНП; 2 — среда кондиционирования макрофагов (1ч инкубации); 3 — среда кондиционирования макрофагов + ЛПНП (1ч инкубации); 4 — среда кондиционирования макрофагов (2 ч инкубации);
5 — среда кондиционирования макрофагов + ЛПНП (2ч инкубации)
— апоВ-100
— апоВ-74
— апоВ-48
— 94 кДа
— 67 кДа
-43 кДа
— 30 кДа
— 6 кДа
Рис. 3. Иммуноэлектроблоттинг белковых фракций ЛИНII с использованием специфических антител против апоВ человека.
1 — ЛИНИ; 2 — среда кондиционирования резидентных макрофагов печени после инкубации (2 ч) с ЛИНН:
3 — ЛИНН + трипсин
регированные частицы ЛПНП захватывались с помощью «скевенджер» рецепторов и подвергались дальнейшей метаболической деградации. Следовательно, протеолитическая модификация ЛПНП может влиять на их взаимодействие с макрофагами.
В качестве такой модели метаболической деградации липопротеииов макрофагами мы изучали влияние на ЛПНП иротеолитическогофермента трипсина. На рис. 3 представлены результаты
электрофоретического переноса на ннтроцеллю-лозную мембрану белков ЛПНП, проинкубированных с резидентными макрофагами, где количество дополнительных полос было не менее 10 (дорожка 2), а также после гидролиза ЛПНГІ трипсином в концентрации 10 мкг/мл среды, где также отмечены дополнительные фракции, проявляющие иммунореактивность к антителам против аполииопротеииа В (дорожка 3). На обеих дорожках картины были схожими. Отчетливую иммунореактивность проявляли белковые фрагменты с молекулярными массами от 10 до 100 кДа (до 15 фракций). Следует отметить, что картина распределения белков, сохраняющих пммунореактивные эпитопы, в целом соответствовала электрофоретическому разделению ЛГ1НП, а также продуктов их метаболической деградации после инкубации с резидентными макрофагами (Рис. 2).
Роль макрофагов в метаболической трансформации липопротеииов не ограничивается только белковым компонентом, т.е. аполипопротеинами. Макрофаги могут принимать участие и в метаболизме липидного компонента липопротеииов. Окисление липидов в липопротеиновых частицах макрофагами — сложный многоступенчатый и еще не до конца изученный процесс. Какие из окислительных агентов участвуют в окислении липидов также до конца не выяснено.
Одним из наиболее информативных методов изучения конформационных изменений белков и липидов является флуоресцентная спектроскопия. С помощью данного метода (Рис. 4 А. кривая 1) показано, что в спектре ЛПНП присутствует
333-336 нм
460 нм
333-336 нм
'/Л
460 нм
4
\
Рис. 4. Спектрофлуориметрический анализ ЛПНП.
А - спектр флуоресценции свежевыделенных ЛПНП (кривая 1) и ЛПНП после длительного хранения (кривая 2);
Б — спектр флуоресценции среды кондиционирования перитонеальных макрофагов без ЛПНП (нижняя кривая) и после инкубации в течение 2ч с ЛПНП (верхняя кривая)
один ярко выраженный пик белковой (триптофа-новой) флуоресценции с максимумом в области 333-336 нм. Длительное хранение ЛПНП не приводило к накоплению липидных перекисей, имеющих максимум флуоресценции при 460 нм (рис.
4 А, кривая 2), хотя пик белковой флуоресценции изменялся и носил двугорбый характер.
При добавлении ЛПНП в инкубационную среду с перитонеальными макрофагами уже через
2 часа в спектре флуоресценции появлялся ярко выраженный пик с максимумом флуоресценции в области 460 нм, соответствующий продуктам пе-рекисного окисления липидов (Рис. 4 Б, верхняя кривая). Это хорошо согласуется с современными представлениями о том, что макрофаги могут генерировать активные формы кислорода, которые приводят к окислительной модификации липидного компонента ЛПНП и накоплению 4-гидрок-синоненала — основного продукта перекисного окисления липидов с максимумом флуоресценции в области 460 нм [12,13]. На рис. 4 Б (нижняя кривая) видно, что и в отсутствии ЛПНП макрофаги синтезировали и секретировали в среду инкубации продукты перекисного окисления липидов с максимумом флуоресценции 460 нм.
Таким образом, увеличение скорости электрофоретической подвижности ЛПНП-частиц к аноду в геле агарозы и повышение электроотрицательности заряда частиц свидетельствует о метаболической деградации липопротеинов макрофагами. Наличие дополнительных низкомолекулярных фрагментов аполипопротеина В, по данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноэлектроблоттинга, подтверждает участие макрофагов в протеолитичес-ком расщеплении белкового компонента ЛПНП. Возможна также окислительная модификация белка под влиянием образовавшихся продуктов перекисного окисления липидов, накопление которых в среде инкубации макрофагов с ЛПНП показано в настоящем исследовании.
METABOLIC DEGRADATION OF PROTEIN AND LIPID COMPONENTS OF LOW DENSITY LIPOPROTEINS BY RESIDENT MACROPHAGES
L.M. Polyakov, D.V. Sumenkova, G.S. Russkih,
I.F. Usynin, T.V. Zueva, L.E.Panin
In present study it was shown that resident macrophages participate in metabolic degradation of protein and lipid components of low density lipoproteins (LDL). The rate of LDL mobility to the anode was increased during an electrophoresis in agarose gel. Using immunoblotting and electrophoresis in polyacrylamide gel it was found, that incubation of
resident macrophages with LDL lead to formation about 15 protein bands with molecular weights from 10 up to 100 kD in addition to the basic forms of apo-lipoprotein В (B-100; B-74; B-48). The data indicate that macrophages participate in proteolytic degradation of protein component LDL. Oxidation of LDL by macrophages led to accumulation of lipid peroxidation products and appearance of marked fluorescence peak with a maximum at 460 nanometers.
Литература
1. Панин, Jl.E. Молекулярные механизмы регуляции клеточной пролиферации и опухолевого роста / Л.Е. Панин // Бюл. СО РАМН. - 2002. - № 2. -С. 8-14.
2. Лимфоциты. Методы / Под редакцией Дж. Клауса. - М., 1990. - С. 36-39.
3. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells / P. Seglen // Meth.Cell Biol. - 1976. - Vol. 13. -P. 29-83.
4. Knook, D.L. Separation of Kupffer and endothelial cells of the rat liver by centrifugal elutriation / D.L. Knook, E.C. Sleyster // Exp. Cell. Res. — 1976. — Vol. 99.
- № 2. - P. 444-449.
5. Hatch, F.T. Practical method for plasma lipoprotein analysis / F.T Hatch, R.S. Less // Adv. Lipid Res. — 1968.
- Vol. 6. - P. 2-68.
6. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование / Л.А. Остерман. — М., 1981. — 288 с.
7. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.
8. Tovey, E. Comparison of semi-dry add conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes / E. Tovey, A. Baldo // Electrophoresis. — 1987. — Vol. 8. — P. 384-387.
9. Панин, Jl.E. Обнаружение иммунореактивности к аполипопротеинам А-I, В и Е в ядрах клеток тканей крыс / Л.Е. Панин, Г.С. Русских, Л.М. Поляков // Биохимия. - 2000. - Т. 65. - № 12. - С. 1684-1689.
10. Процессы модификации липопротеинов, физиологическая и патогенетическая роль модифицированных липопротеинов / Л.А. Белова, О.Г. Оглоблина, А.А. Белов, В.В. Кухарчук // Вопросы медицинской химии. — 2000. — Т. 46. — В.1. — С. 12-19.
11. Piha, М. Fusion of proteolyzed low-density lipoprotein in the fluid phase: a novel mechanism generating atherogenic lipoprotein particles / M. Piha, L. Lindstedt, P.T. Kovanen // Biochemistry. — 1995. — Vol. 34. — P. 10120-10129.
12. Radu, A. 4-Hydroxynonenal reduces junctional communication between endothelial cells in culture / A. Radu, N. Moldovan // Experimental Cell Research. — 1991.-Vol. 196.-P. 121-126.
13. Steinbrecher, Urs.P. Role of superoxide in endothelial-cell modification of low-density lipoproteins / Urs.P. Steinbrecher // Biochimica et Biophysica Acta. — 1988.
- Vol. 959. - P. 20-30.
