CC BY
11Р.И. Лукашов, Д.В. Моисеев
влияние комплекса биологически активных веществ
ЦВЕТКОВ РУДБЕКИИ ШЕРШАВОЙ НА пОКАЗАТЕЛИ ТИМУСА КРЬ1С Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет
Установлено тимусопротекторное действие комплекса биологически активных веществ, экстрагируемых спиртом Р (50%, об/об) из цветков рудбекии шершавой (Rudbeckia L.), в модели инволюции тимуса, вызванной острым иммобилиза-ционным стрессом. Интрагастральное введение комплекса биологически активных веществ в течение четырех дней крысам положительно влияло на морфологические характеристики, восстановление абсолютной массы, индекса и клеточности тимуса, нарушенных в результате инволюции. Максимальный положительный эффект на изучаемые показатели тимуса проявил комплекс биологически активных веществ в дозе 400 мг/кг.
Ключевые слова:рудбекия шершавая (Rudbeckia hirta L.), акцидентальная инволюция, тимусопротекторное действие.
ВВЕДЕНИЕ
Центральным звеном стресс-реакции организма является адренало-кортикаль-ный механизм. Главное следствие данного механизма - это усиление продукции глюкокортикоидных гормонов (кортизола, гидрокортизона и др.). В условиях длительного воздействия факторов стресса на организм происходит постоянное выделение этих гормонов в кровь, что сопровождается развитием и прогрессированием различных заболеваний: язвенных поражений желудка и кишечника, аритмии, мигрени, артериальной гипертензии, аллергических, инфекционных и опухолевых заболеваний [1].
Тимус - центральный орган иммунной системы, обеспечивающий антигеннеза-висимый Т-лимфопоэз [2,3]. Тимус считается одним из наиболее чувствительных к стрессу органов. Стрессогенные факторы, изменяя естественные процессы селекции, дифференцировки и созревания Т-клеток в тимусе, приводят к дисбалансу между Т-киллерами и Т-хелперами, в результате чего повышается восприимчивость организма к инфекционным агентам и нарушается протекание цитотоксических реакций отторжения генетически чужеродных элементов (прежде всего, раковых клеток) [4-6].
Реакция тимуса на стресс сопровождается не только функциональными нарушениями, но морфологическими изменениями со стороны органа. При этом
происходит массовый выброс в кровь Т-лимфоцитов, лимфоцитолиз в самом органе, разрастание пула эпителиоретику-лоцитов и формирование между клетками фолликулов, содержащих гликопротеиды. Наиболее выраженное снижение количества клеток происходит в корковом слое, в результате чего практически неразличимой становится граница между корковой и медуллярной зоной [7-9].
Исходя из вышесказанного, актуальной задачей становится поиск субстанций, способных снижать проявления тимической атрофии, вызванной влиянием стресса.
Целью настоящей работы является изучение влияния комплекса биологически активных веществ цветков рудбекии шершавой на показатели тимуса крыс.
МА териалы и методы
Настойку цветков рудбекии шершавой получали методом мацерации. Для этого в стеклянную емкость помещали навеску цветков рудбекии шершавой массой 20,0 г Добавляли 200,0 мл спирта Р (50%, об/об). Систему настаивали в течение 7 суток и сливали извлечение. Сырье отжимали под прессом. К отжатому сырью добавляли небольшой объем спирта Р (50%, об/об), перемешивали, сливали извлечение и отжимали сырье. Полученные извлечения объединяли, отстаивали в течение 2-х суток при температуре не выше 100С, фильтровали через складчатый бумажный фильтр
и при необходимости доводили до объема 200,0 мл спиртом Р (50%, об/об).
Для получения сухого остатка, содержащего комплекс биологически активных веществ цветков рудбекии шершавой, спирт Р отгоняли. Полученный сухой остаток растворяли в воде Р с целью получения доз 400, 200 и 100 мг/кг.
Исследование проводили на беспородных крысах-самцах, полученных из питомника «Рапполово» РАМН (Ленинградская область, Всеволожский район). Масса крыс составила 180 - 220 г. Животные содержались в соответствии с установленными требованиями [10-12] в помещении вивария при температуре 20 - 22°С и влажности воздуха 45 - 50%. Рацион питания животных был сбалансированным и соответствовал установленным требованиям [13]. Все животные получали необходимое количество воды.
Комплекс биологически активных веществ цветков рудбекии шершавой (сухой остаток, растворенный в воде) вводили с помощью металлического зонда, представляющего собой изогнутую инъекционную иглу с напаянной на конце оливой.
Формировали следующие группы животных: одна интактная группа (животные не подвергались воздействию стресса), одна контрольная группа (животные получали эквивалентный объем воды Р, затем подвергались воздействию стресса), три исследуемые группы (животные получали следующие дозы: 100, 200 и 400 мг сухого остатка, полученного после удаления спирта Р, на один кг массы животного, затем подвергались воздействию стресса). Количество животных в каждой группе составляло десять особей. На протяжении эксперимента животных взвешивали дважды: до начала и по окончании эксперимента.
Животным на протяжении четырех дней интрагастрально вводили комплекс биологически активных веществ цветков рудбекии шершавой в возрастающих дозах 100, 200 и 400 мг/кг или эквивалентный объем воды Р натощак (один раз в день). На четвертый день животным за один час до воспроизведения стресса последний раз вводили комплекс биологически активных веществ в указанных дозах. Острый иммобилизационный стресс воспроизводили путем фиксации крыс в положении «на спине» в течение четырех часов. Затем
животных умерщвляли путем декапитации под местной анестезией шейной области. У декапитированных животных извлекали тимусы и взвешивали. Относительную массу (индекс) тимуса определяли как отношение абсолютной массы органа к массе животного.
В работе соблюдены требования гуманного обращения с экспериментальными животными, содержащиеся в «Положении о порядке использования лабораторных животных в научно-исследовательских работах и педагогическом процессе Витебского государственного медицинского университета и мерах по реализации требований биомедицинской этики» [12].
Постановка экспериментального исследования с использованием лабораторных животных осуществлена в соответствии с рекомендациями Конвенции Совета Европы по охране позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях [14], Директивой Совета ЕЭС [15], Надлежащей лабораторной практикой [16] и рекомендациями FELASA Working Group Report (1994 -1996).
Для определения клеточности органа тимусы измельчали и проводили разведение полученной после измельчения гомогенной массы кислотой хлористоводородной Р в соотношении 1: 200. Количество ядросодержащих клеток подсчитывали в камере Горяева и рассчитывали по формуле:
К = А • 5 • 104 • 200,
где К - количество ядросодержащих клеток (ЯСК) тимуса; 200 - фактор разведения клеток тимуса; А - количество клеток, подсчитанных в пяти больших квадратах камеры Горяева.
Для исследования морфологии тимусов материал фиксировали в течение 48 часов в растворе 100 г/л буферного раствора формалина Р (рН 7,4). После фиксации материал обрабатывали по общепринятой гистологической методике. Окраску препаратов проводили гематоксилином и эозином. Исследование окрашенных препаратов проводили на микроскопе Leica PFC 295 (Германия) со встроенной фотокамерой при собственном увеличении объектива 63х. Фотографии обрабатывали при помощи компьютерной программы Leica application Suite LAS Version 3.6.0.
результаты и обсуждение
Для оценки адекватности используемой модели сравнивали абсолютную, относительную массу и клеточность тимуса в интактной и контрольной группах животных. Установлено, что абсолютная и относительная масса тимуса животных в контрольной группе по сравнению с интактными крысами уменьшилась на 42,05±0,04% и 42,44±0,06%, соответственно. Под действием острого иммобилиза-ционного стресса происходило резкое (на 40,39±4,90%) снижение количества ЯСК в тимусе (таблица 1). Практически одинаковый процент снижения абсолютной, относительной массы и резкое снижение кле-точности тимуса указывали на то, что под действием острого иммобилизационного стресса развилась акцидентальная инволюция тимуса.
При макроскопическом изучении тимусов крыс исследуемых групп не обнаружено отклонений по размерам, внешнему виду и консистенции от тимусов крыс ин-тактной группы. Тимус крыс исследуемых и интактной групп представлял собой розовато-серое железистое образование, раз-
Рисунок 1 - Препарат тимуса крыс контрольной группы (63х)
деленное на правую и левую доли. Ткань тимуса разделена на дольки при помощи пучков соединительной ткани. Тимус крыс контрольной группы - орган меньших размеров и более мягкой консистенции (по сравнению с тимусом интактных крыс), желтовато-розового цвета, дольчатое строение сохранялось.
При проведении микроскопического исследования окрашенных препаратов тимуса животных контрольной группы выявили ряд признаков, характерных для ак-цидентальной инволюции (рисунок 1).
Из рисунка 1 видно, что окрашенная гематоксилином и эозином ткань тимуса становилась более светлой, что указывало на уменьшение количества Т-лимфоцитов в органе, практически не различимой становилась граница коркового и мозгового вещества тимуса. Уменьшалась плотность расположения лимфоцитов, что особенно было заметно в подкапсулярной зоне, где наиболее активно происходили процессы Т-лимфопоэза. Происходило размывание границ телец Гассаля.
На рисунке 2 представлен окрашенный препарат тимуса крыс, которые интрага-стрально получали дозу 400 мг экстракта из
Рисунок 2 - Препарат тимуса животных, которые получали дозу 400 мг/кг (63х)
Таблица 1 - Значения абсолютной массы, индекса и числа ЯСК тимуса в интактной,
контрольной и исследуемых группах
Параметр Исследуемые группы Контрольная группа Интактная группа
Доза 400 мг/кг Доза 200 мг/кг Доза 100 мг/кг
Абсолютная масса (г) 1,69±0,17 1,43±0,07 1,06±0,08 0,92±0,05 1,59±0,05
Индекс 0,0079±0,0008 0,0069±0,0003 0,0051±0,0005 0,0042±0,0003 0,0075±0,0004
Число ЯСК • 106 58,2±2,3 43,9±2,8 35,6±2,4 33,6±2,5 56,5±2,0
цветков рудбекии шершавой на 1 кг массы животного (исследуемая группа).
На рисунке 2 видно, что четко различалось корковое (более темная зона по краю) и мозговое (более светлая зона в центре) вещество. Тельца Гассаля имели четкую границу и резко отличались от окружающих лимфоцитов. При микроскопическом исследовании тимусов крыс, получавших дозу 400 мг/кг, не обнаружено морфологических отличий от тимусов крыс интакт-ной группы.
Проценты прироста абсолютной, относительной массы и числа ЯСК тимуса крыс исследуемых групп (дозы 100, 200 и 400 мг/кг) по сравнению с тимусами животных контрольной группы составляли 16,23±12,47, 57,11±11,88 и 86,32±24,69%; 19,84±17,92, 61,44±12,66 и 85,06±27,99% и 7,0±1,1%, 32,0±12,6% и 74,9±14,0%, соответственно (табл. 1).
Прирост абсолютной, относительной массы и числа ЯСК тимуса носил дозозависимый характер. При этом максимальный эффект по всем исследуемым показателям
проявился при дозе высокого уровня - 400 мг/кг. Введение данной дозы приводило к восстановлению абсолютной, относительной массы и клеточности тимуса до нормальных значений животных интактной группы (р>0,05). Т.е. экстракты из цветков рудбекии шершавой оказывали выраженное тимусопротекторное действие и ослабляли проявления тимической инволюции, вызванной острым иммобилизационным стрессом (таблица 1).
Положительное влияние экстрактов из цветков рудбекии шершавой на абсолютную, относительную массу и клеточность тимуса крыс можно объяснить усилением выработки интерлейкина-7 в тимусе и одновременным подавлением продукции глюко-кортикоидных гормонов в надпочечниках.
С целью количественной оценки фармакологического эффекта и определения селективности действия экстрактов из цветков рудбекии шершавой на показатели тимуса крыс целесообразно представить графическую зависимость доза - эффект в логарифмической форме (рисунки 3, 4 и 5).
Рисунок 3 - Зависимость абсолютной массы тимуса (г) от натурального логарифма дозы (lnD)
Зависимость абсолютной массы тимуса (г) от натурального логарифма (1п) дозы (О) являлась строго прямой и носила линейный характер (Д2=1,0000). Уравнение линейной зависимости имело вид у=0,43х-0,87. При этом обнаружили достаточно высокую крутизну дозовой зависимости эффекта. ED50= 55 мг/кг, где ED50
- эффективная доза экстракта из цветков рудбекии шершавой, которая вызывала по-лумаксимальный эффект.
Зависимость индекса тимуса от на-
турального логарифма дозы являлась сильной, прямой и носила практически линейный характер ^2=0,9820). Уравнение линейной зависимости имело вид у=0,002х-0,005. При этом крутизна дозо-вой зависимости эффекта несколько сглаживалась. ED50=90 мг/кг.
Зависимость числа ЯСК тимуса от натурального логарифма дозы являлась сильной, прямой и носила практически линейный характер ^2=0,9885). Уравнение линейной зависимости имело вид
у=16,1х—39,7. При этом обнаружили средне выраженную крутизну дозовой зависимости эффекта. ED50=67 мг/кг.
Для определения селективности действия экстрактов из цветков рудбекии шершавой сравнивали эффективные дозы, рассчитанные по уравнениям линейной зависимости, для каждого изучаемого показателя тимуса крыс. Установлено, что наи-
большая фармакологическая активность экстрактов из цветков рудбекии шершавой проявилась в отношении восстановления абсолютной массы тимуса крыс. Экстракты из цветков рудбекии шершавой в 1,2 и 1,6 раза менее активно влияли на восстановление индекса и клеточности тимуса соответственно в сравнении с восстановлением абсолютной массы изучаемого органа.
Рисунок 4 - Зависимость относительной массы тимуса (индекса тимуса) от натурального логарифма дозы
Рисунок 5 - Зависимость числа ЯСК тимуса от натурального логарифма дозы ВЫВОДЫ
Впервые изучено влияние экстрактов из цветков рудбекии шершавой на показатели тимуса крыс при моделировании острого иммобилизационного стресса.
Используемая экспериментальная модель обладала адекватной разрешающей способностью для оценки защитных свойств растительных экстрактов по классическим показателям острой реакции на-
пряжения тимуса (изменение морфологии, снижение абсолютной массы, индекса и клеточности тимуса у животных контрольной группы в сравнении с животными ин-тактной группы).
При макро- и микроскопическом изучении тимусов крыс исследуемых групп не обнаружено отклонений по внешнему виду, размерам, консистенции, морфологическим характеристикам от нормальных показателей тимусов крыс интактной группы.
Установлено положительное влияние интрагастрального введения в течение четырех дней экстрактов из цветков рудбе-кии шершавой на абсолютную массу, индекс и клеточность тимуса крыс, подвергшихся воздействию иммобилизационного стресса в течение четырех часов. При этом интрагастральное введение комплекса биологически активных веществ цветков рудбекии шершавой привело к восстановлению изучаемых показателей тимуса до нормальных значений, характерных для интактных животных.
Прирост абсолютной, относительной массы и числа ЯСК тимуса носил дозозависимый характер. При этом максимальный эффект по всем исследуемым показателям проявился в дозе высокого уровня
- 400 мг/кг.
Наиболее селективно проявилось действие экстрактов из цветков рудбекии шершавой по отношению к восстановлению абсолютной массы органа.
SUMMARY
R.I. Lukashov, D.V. Moiseev THE INFLUENCE OF THE COMPLEX OF BIOLOGICALLY ACTIVE
SUBSTANCES FROM RUDBECKIA COARS FLOWERS ON THE INDICATORS OF THE RATS’ THYMUS
The thymus protective effect of the complex of biologically active substances, extracted from Rudbeckia coars (Rudbeckia hirta L.) flowers by 50% alcohol, in the model of the thymus involution, caused by the sharp immobilized stress, was determined. Intragastric introduction of complex of biologically active substances into rats for four days positively influenced on the morphological characteristics, the restoration of the absolute mass, the index and the cellularity of thymus, violated as a result of involution. The maximum positive effect on the indicators of the thymus showed a complex of biologically active substances in dose of 400 mg/kg.
Keywords: Rudbeckia coars, Rudbeckia hirta L., accidental involution, thymus protective action.
ЛИТЕРАТУРА
1. Нормальная физиология: курс лекций / В.И. Кузнецов [и др.], под ред. В.И. Кузнецова. - Витебск: ВГМУ 2007. - 611 с.
2. Ярилин, А.А. Цитокины в тимусе. Биологическая активность и функции ци-токинов в тимусе / А.А. Ярилин // Цитокины и воспаление. - 2003. - №2. - С. 25-32.
3. Ярилин, А.А. Тимус как орган эндокринной системы / А.А. Ярилин, ИМ. Беляков // Иммунология. - 1996. - №3. - С. 4-10.
4. Фрейдлин, И.С. Загадки тимуса. Возраст и иммунитет / И.С. Фрейдлин // Соросовский образовательный журнал. -1997. - №5. - С. 26-29.
5. Роль цитокинов и других метаболических факторов в механизме инволюции тимуса / Е.П. Киселева [и др.]. - СПб., 2002. - 74 с.
6. Полякова, В.О. Экспрессия ключевых регуляторных белков апоптоза и их роль в возрастной инволюции тимуса человека / В.О. Полякова, В.В. Бенберин // Успехи геронтологии. - 2006. - Вып. 19. -С. 28-32.
7. Бугаева, И.О. Кинетика клеточных популяций тимуса под влиянием инфракрасного лазерного излучения / И.О. Бугаева, А.В. Егорова, О.В. Злобина // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2010.
- Том 6, №1. - С. 23-26.
8. Морфологические изменения тимуса при острой интоксикации 2,3,7-трих-лордибензопара-диоксином / В.И. Стахо-вич [и др.] // Современные проблемы токсикологии. - 2007. - №1. - С. 9-14.
9. Весовые, морфометрические и цитологические характеристики лимфоидных органов мышей при воздействии производного индолилтиоалканкарбоновой кислоты (соединения вл-11-02) / В.Л. Лимонов [и др.] // Бюллетень СО РАМН. - 2005. -№2 (116). - С. 55-58.
10. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте / И.П. Западнюк [и др.]. - Киев: Вища школа, 1983. - 383 с.
11. Устройство, оборудование и содержание экспериментально-биологических клиник (вивариев): Постановление №131 от 31.10.2006 г. об утверждении Санитарных правил и норм 2.1.2.12-18.
12. Юденко, О.А. Положение о порядке использования лабораторных животных в научно-исследовательских работах и педагогическом процессе Витебского государственного медицинского университета и мерах по реализации требований биомедицинской этики / О.А. Юденко, Т.В. Буйнова. - Витебск: ВГМУ, 2010. - 36 с.
13. Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения: Приказ МЗ СССР №1179 от 10.10.1983 г.
14. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals for Experimental and Other Scientific Purposes. - Strasbourg, Council of Europe. - 18.03.1986. - 51 p.
15. Council Directive on the Approximation of Laws, Regulations and Administrative Provisions of the Member States Regarding the Protection of Animal Used for Experimental and Other Scientific Purposes.
- 24.11.1986.
16. Надлежащая лабораторная практика: Технический кодекс установившейся практики (ТКП) 125-2008 (02040). Ут-
вержден постановлением Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 28.03.2008 г. №56.
Адрес для корреспонденции:
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27,
УО «Витебский государственный
ордена Дружбы народов
медицинский университет»,
кафедра стандартизации лекарственных
средств с курсом ФПК и ПК,
тел. раб. 8(0212)370006,
тел. моб. +375292948511,
e-mail: r_lukashov@mail.ru.
Лукашов Р.И.
Поступила 14.02.2013 г.
