CC BY
28
Известия ТИНРО
2003 Том 133
ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 664.95:593.96
Т.Н.Слуцкая, Г.Н.Тимчишина; Н.В.Плаксен, Н.С.Хильченко
(ТИНРО-центр; ВГМУ)
ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ "ТИНГОЛА-2" В КАЧЕСТВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ
К ПИЩЕ
Экспериментально установлено физиологическое действие экстракта из голотурии Cucumaria japonica "ТИНГОЛ-2", а также возможность использования его в качестве биологически активной добавки к пище. На основании экспериментальных работ выявлено, что экстракт обладает низкой токсичностью, о чем свидетельствуют LD-50 = 7,2 мл/кг и данные, полученные при введении животным 10-кратной (аггравированной) дозы 2 мл/кг. Результаты исследований показывают определенное положительное воздействие препарата на физическую и поведенческую стороны жизнедеятельности подопытных животных. Сделано заключение, что "ТИНГОЛ-2" может быть рекомендован как средство, повышающее физическую работоспособность. При этом происходит снижение гипертрофии надпочечников, почек, предотвращается инволюция тимуса, уменьшаются дистрофические изменения в миокарде.
Slutskaya T.N., Timchishina G.N., Plaksen N.V., Khilchenko N.S.
Substantiation of "TINGOL-2" application as biologically active food additive // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 133. — P. 313-317.
The physiological action of the extract "TINGOL-2" from holothurian Cucu-maria japonica and also opportunity of its use as the biologically active additive to food is experimentally established. There is revealed on the base of experiments that the extract "TINGOL-2" has low toxicity, which is confirmed by LD-50 = 7.2 ml/kg and by the result of introduction of tenfold doze 2 ml/kg. The extract made the certain positive influence on physical and behavioral aspects of vital activity of experimental animals. The conclusion is made, that "TINGOL-2" can be recommended for rising of physical capacity for work. It decreases adrenals and kidneys hypertrophy, prevents a thymus involution, and decreases of dystrophic changes in myocardium.
Гидробионты, особенно беспозвоночные, отличаются разнообразием метаболитов, среди которых доминируют функциональные соединения. К соединениям такого типа относят каротиноиды, фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты, сапонины, проявляющие антиоксидантную, иммуномодулирующую, радиопротекторную, противоопухолевую и другие активности (Тутельян, 1996; Conde, 1997; Ohshima, 1998). Голотурии известны тем, что их мышечная ткань и внутренние органы содержат значительное количество тритерпеновых гликозидов, проявляющих широкий спектр биологического действия (Elyakov, 1990; Калинин и др., 1994; Лебская и др., 1998; Стоник и др., 1999). Введение мышам этих гликозидов способствовало восстановлению клеточной популяции тимуса и селезенки после 24-часового иммобилизационного стресса, как полагают, за счет
адъювантного и неспецифического протективного действия (Преображенский и др., 1991). Показана перспективность использования гликозидов голотурии Cucu-maria japónica в качестве средства, усиливающего протективное действие вакцин и естественную резистентность организма к инфекциям (Седов и др., 1990).
В ветеринарии рекомендован препарат из кукумарии, содержащий тритер-пеновые гликозиды, для профилактики и лечения заболеваний животных, в частности алеутской болезни норок (Пат. РФ 2036654).
В ТИНРО-центре разработана технология получения экстракта из голотурии Cucumaria japónica "ТИНГОЛ-2", который характеризуется высоким содержанием тритерпеновых гликозидов (не менее 500 мкг/мл). Препарат показал свою эффективность при употреблении его больными-добровольцами с ярко выраженной астенией. Отмечено повышение аппетита, общего тонуса, быстрая нормализация диспептических симптомов, клиническое улучшение переваривания пищи (Тимчишина, 1999). Вышесказанное позволило предположить наличие физиологического действия экстракта и возможность использовать его в качестве биологически активной добавки при условии, что препарат будет проявлять антистрессовую способность и обладать низкой токсичностью.
Для достижения этой цели были поставлены задачи: определить острую токсичность препарата и найти эффективную терапевтическую дозу; выявить наличие противострессового действия.
"ТИНГОЛ-2" получали по способу, разработанному в ТИНРО-центре.
Среднюю смертельную дозу (LD-50), мл/кг, определяли на беспородных мышах-самцах массой 18-25 г.
Препарат вводили в желудок специальным шприцом с оливой на конце иглы. Токсичность определяли по Керберу (Зориков, 1999). В каждой группе находилось по 6-8 животных.
Расчет LD-50 делался по формуле:
LD-50 = LD-100 - X(Zd)n, где LD-100 — доза изучаемого препарата, которая вызывала учитываемый эффект у всей группы животных, мл/кг; Z — среднее арифметическое из числа животных, у которых наблюдалась учитываемая реакция под влиянием каждых двух смежных доз; d — интервал между каждыми смежными дозами; n — число животных в каждой группе.
Для изучения антистрессорного действия "ТИНГОЛа-2" применили стандартные модели экстремального состояния (повышенная физическая нагрузка, гиподинамия) согласно методическим указаниям (МУК 2.3.2.721-98) для БАД, а также создавали стресс-реакцию иммобилизацией мышей в течение 15 мин с изучением исследовательского компонента поведения животных в "открытом поле" сразу и через один час после стресса (Дардымов, Хасина, 1993). В данных экспериментах использовали беспородных лабораторных мышей-самцов массой 22-24 г. "ТИНГОЛ-2" вводили в рекомендуемых дозах 0,2 мл/кг и в 10-кратной (аггравированной) дозе — 2 мл/кг. Контрольным животным вводили экви-объемное количество экстрагента — разведенного спирта (концентрация 50 %); количество животных в каждой группе было не менее 6 шт.
В исследованиях кроме контрольных групп использовались интактные. Экспериментами установлено, что спирт оказывает протекторное воздействие на подопытных животных при физической нагрузке, что определено путем морфологического исследования внутренних органов, а также временем вынужденного плавания. Поэтому в качестве контроля служили мыши, получающие этиловый спирт в эквивалентных количествах.
У животных после декапитации под легким эфирным наркозом выделяли и взвешивали внутренние органы: надпочечники, тимус, селезенку, печень, почку, сердце.
После фиксации органов в 10 %-ном растворе формалина готовили микропрепараты, после окрашивания которых в системе гематоксилин—эозин изу-
Ha.H MOp^O^OrHHeCKHe H3MeHeHHa nOA B03AeHCTBHeM CTpeCCa y KOHTpO.bHHX H OnHTHHX rpynn «HBOTHHX.
nO^yneHHHe AaHHHe nOABepra.H CTaTHCTHHeCKOH O6pa6OTKe C HCn0.b30BaHH-eM t-KpHTepHH CTbroAeHTa. ,fl,0CT0BepH0CTb SKCnepHMeHTa^bHHx AaHHHx npHHaTa
Ha 95 %-hom ypOBHe 3HaHHM0CTH (OeAOpOB, n.ecKaHOC, 1980).
3KCTpaKT KyKyMapHH npeACTaB.aeT co6oh «HAKOCTb ot co.noMeHHoro ao «e^-Toro uBeTa co BKycoM h 3anax0M, CBOHCTBeHHbiMH AaHHOMy BHAy Ao6aBKH, C0Aep«HT 45-50 % 3TH^0B0r0 cnHpTa, He MeHee 500 MKr/M. TpHTepneHOBHx r.HK03HA0B, no n0Ka3aTe^HM 6e30nacH0CTH — tokchhhhm a.eMeHTaM, necTHUHAaM, paAHOHyK-^HAaM — C00TBeTCTByeT Tpe6oBaHHaM h HopMaM CaHnHH 2.3.2.1078-01.
OnpeAe^eHHe o6m,eH tokchhhocth, K0T0paa cocTaB.a.a no LD-50 7,2 M./Kr, bhhbh^o cpaBHHTe^bHyro 6e30nacH0CTb aKCTpaKTa H3 BHyTpeHHOCTen KyKyMapHH ("THHrO^-2"). CTHMynHpyrom.ee AeHCTBHe "THHrO^a-2" HCC.neA0Ba.n0Cb npH bh-Hy«AeHH0M nnaBaHHH «hbothhx KOHTpo.bHHX h OnHTHHX rpynn, npHHeM Ka«Aaa cocToana H3 10 MHrnefi (Ta6.. 1).
Ta6.Hua 1
B.HaHHe "THHrO^a-2" Ha np0A0nxHTenbH0CTb n.aBaHHa Mbimen
Table 1
Influence of "TINGOL-2" on duration of navigation of mice
XapaKTepHCTHKa £03a "THHrO^a-2", npoAO.xHTe.bHOCTb n.aBaHHa,
rpynnH «HBOTHHX M./Kr mhh; cpeAHee ± o
KoHTpo.bHaa 0,2* 26,1 ± 1,2
OnHTHaa 0,2 70,3±0,9
KoHTpo.bHaa 2,0* 24,5± 1,8
OnHTHaa 2,0 75,8± 1,7
* B KOHTponbHHx rpynnax BMecTO "THHTO^a-2" Hcn0.b30Ba.nca 50 %-Hbift 3TH.0BHH cnHpT.
nonyneHHHe pe3ynbTaTH n0Ka3HBaroT, hto OAHOKpaTHHH npHeM "THHrO^a-2" b A03ax ot 0,2 ao 2,0 m./ Kr cym,ecTBeHH0 B.HaeT Ha ^H3HHecKyro pa6oT0cnoco6-HOCTb «hbothhx. Ha AOCTaTOHHyro mHpoTy TepaneBTHHecKoro AeHCTBHa npenapaTa yKa3HBaeT a^eKTHBHOCTb ao3h 0,2 m./Kr, K0T0paa cocTaB.aeT 1/36 ot LD-50.
HccneAOBaHHe ncHxocTHMy.Hpyrom,ero AeHCTBHa "THHrO^a-2" noKa3ano, hto Hepe3 1 h nocne CTpeCCa (A.HTe.bHOH rHn0KHHe3HH) npH A03Hp0BKax npenapaTa 0,2-2,0 m./Kr b OnHTHHX rpynnax "ropH30HTa.nbHHH" K0Mn0HeHT noBeAeHHa «hbothhx HH«e h cym,ecTBeHH0 BHme "BepTHKa.bHHH" no cpaBHeHHro c kohtpo-.eM (Ta6.. 2).
Ta6.Hua 2
noBeAeHHe «hbothhx b otkphtom no.e, cpeAHee ± o
Table 2
Behaviour of animals in open field, average
XapaKTepHCTHKa rpynnH «HBOTHHX ^03a "THHrO^a-2", M./Kr BHAH TecTHpoBaHHa nepeceHeHHe BcTaBaHHe .HHHH
KoHTpo.bHaa 0,2* 31,0± 1,4 0,5±0,04
OnHTHaa 0,2 23,0±2,2 1,0±0,2
KoHTpo.bHaa 2,0* 39,0±4,0 2,2±0,3
OnHTHaa 2,0 36,0±4,0 4,5±0,6
* Hcn0.b30Ba.ca 50 %-hhh sth.obhh cnHpT.
no.yneHHHe pe3y.bTaTH n0Ka3HBaroT onpeAe.eHHoe no.o«HTe.bHoe B03Aen-CTBHe "THHrO^a-2" Ha ^H3HHecKyro h noBeAeHHecKyro ctopohh «H3HeAeaTe.bH0-cth noAonHTHHx 06teKT0B. H3yHeHHe B.HaHHa npenapaTa Ha BHyTpeHHHe opraHH noc.e nepeHeceHHoro CTpeCCa noKa3a.o, hto, HecMOTpa Ha 6o.ee BHCOKyro no cpaB-HeHHro c KOHTpo.eM Harpy3Ky, rHnepTpo^Ha HaAn0HeHHHK0B, ce.e3eHKH h noHeK y OnHTHOH rpynnH «HBOTHHX AOCTOBepHO HH«e, HeM y KOHTpO.bHHX (Ta6.. 3).
Таблица 3
Влияние "ТИНГОЛа-2" на массу внутренних органов после стресса (истощающая физическая нагрузка), мг, среднее ± о
Table 3
Influence of "TINGOL-2" on relative weight internal bodies after stress (emaciated physical loading), mg, average
Характеристика Доза "ТИНГОЛа-2", / Надпочечник Селезенка Почка
группы животных мл/кг
Контрольная 0,2* 18,0± 1,5 970± 15 678,0±8,0
Опытная 0,2 16,3±0,7 680±57 578,0± 12,0
Контрольная 2,0* - 1226± 50 684,0±39,0
Опытная 2,0 - 1192 ±91 617,0±32,0
* Использовался 50 %-ный этиловый спирт.
При воздействии истощающей физической нагрузки на животных наблюдается инволюция тимуса во всех группах по сравнению с интактными, однако установлено, что в опытных группах уменьшение относительной массы этого органа в 2-3 раза ниже, чем в контрольных, при испытанных дозировках препарата. Напряженность стресс-реакции под влиянием "ТИНГОЛа-2" существенно снижалась при длительной гипокинезии: установлено, что в группе опытных животных меньше инволюция тимуса и ниже гипертрофия надпочечников, не наблюдается существенных изменений массы почек, селезенки, печени, сердца (табл. 4).
Таблица 4
Влияние "ТИНГОЛа-2" в дозе 0,2 мл/кг на относительную массу (масса органов, мг/масса животных, г) внутренних органов мышей после длительной гипокинезии, среднее ± о
Table 4
Influence of "TINGOL-2" in a doze of 0.2 ml/kg on relative weight (weight of bodies, mg/weight of animals, g) internal bodies of mice after long hypokinezia, average
Характеристика группы животных Сердце Почка Селезенка Тимус Печень Надпочечники
Контрольная Интактная Опытная 4,0±0,2* 4,4±0,2 4,3±0,1 5,8±0,5 6,3±0,4 5,5±0,3 4,2±0,3 5,2±0,5 3,9±0,2 1,2 ±0,1 1,7 ± 0,1 1,6 ±0,2 49± 1,7 57 ±3,1 47± 1,7 0,14±0,02 0,13 ±0,05 0,12 ±0,02
* Использовался 50 % -ный этиловый спирт.
Морфологические исследования ткани селезенки, сердца и тимуса у животных, получавших "ТИНГОЛ-2" в дозах 0,2-2,0 мл/кг, выявили следующее. В тканях селезенки контрольной и опытной групп сразу после вынужденного плавания в течение соответственно 24-26 и 70-76 мин определены по сравнению с нормой схожие у обеих групп изменения в виде повышенного полнокровия красной пульпы, обнаружены также мелкие, чаще подкапсульные, кровоизлияния. Белая пульпа представлена лимфоидными фолликулами с широкими, бледно окрашенными центрами размножения. Через час после стрессорного воздействия в опытных группах, несмотря на то что время плавания у них было почти в три раза дольше, установлены значительные улучшения по сравнению с контролем: существенно уменьшились полнокровие красной пульпы и количество подкапсульных кровоизлияний.
Морфологическая структура тимуса в обеих группах практически не имеет различий: дольки представлены широким корковым полем, содержащим большое количество лимфоцитов, и узкими, с ветвистыми очертаниями, мозговыми зонами, в которые включены тельца Гассаля. Сосудистая сеть умеренно наполнена.
Сходство морфологической структуры тимуса в исследуемых группах животных можно рассматривать как положительное явление, если учесть значительно более длительный срок вынужденного плавания опытной группы.
В миофибриллах сердца контрольной группы определяются небольшие дистрофические изменения по типу зернистой дистрофии, менее выраженные изменения отмечены в миокарде мышей, получавших "ТИНГОЛ-2".
Обобщая вышесказанное, можно сделать следующие выводы.
"ТИНГОЛ-2" обладает низкой токсичностью, что подтверждено LD-50 = = 7,2 мл/кг и данными, полученными при введении 10-кратной (аггравирован-ной) дозы — 2 мл/кг.
"ТИНГОЛ-2" оказывает достоверное стимулирующее действие при стрес-сорных воздействиях (истощающая физическая нагрузка, длительная гипокинезия) и в дозах 0,2-2,0 мл/кг может быть рекомендован как средство, повышающее физическую и умственную работоспособность.
Применение "ТИНГОЛа-2" не приводит к увеличению гипертрофии надпочечников, почек, предотвращает инволюцию тимуса, защищает от дистрофических изменений в миокарде.
Литература
Алексеева И.А., Батраков С.Г., Сакаиделидзе О.Г. и др. Стимуляция три-терпеновыми гликозидами голотурий неспецифической антибактериальной резистентности мышей к условно-патогенному грамотрицательным микроорганизмам // Антибиотики и химиотерапия. — 1990. — Т. 35, № 1. — С. 23-26.
Дардымов И.В., Хасина Э.И. Элеутерококк: тайны "панацеи". — СПб.: Наука,
1993. — 115 с.
Зориков П.С. Биологическая активность экстрактов из дальневосточных и интро-дуцированных растений: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — Владивосток, 1999. — 40 с.
Калинин В.И., Левин В.С., Стоник В.А. Химическая морфология: тритерпено-вые гликозиды голотурий (Holothurioidea, Echinodermata). — Владивосток: Дальнаука,
1994. — 284 с.
Лебская Т.К., Двинин Ю.Ф., Константинова Л.Л. и др. Химический состав и свойства гидробионтов прибрежной зоны Баренцева и Белого морей. — Мурманск: ПИНРО, 1998. — 185 с.
МУК 2.3.2.721-98 Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище. — М.: Минздрав России, 1999. — 87 с.
Пат. РФ 2036654 (1995), Б.И. № 16 (1995). Средство для профилактики и лечения алеутской болезни норок / Ю.И.Гришин, А.М.Ковалевская, В.А.Стоник и др. Заявлено 13.12.1990; Опубл. 9.06.1995.
Преображенский А.Б., Рубцов Б.В., Шарова Л.В., Седов А.М. Исследование адаптивных свойств в кукумариозида при выживании мышей в экстремальных условиях // Тез. докл. Всесоюз. совещ. "Биологически активные вещества гидробион-тов — новые лечебные, лечебно-профилактические и технические препараты". — Владивосток, 1991. — С. 96.
Стоник В.А., Авилов С.А., Калинин В.И. Успехи в изучении природных соединений. — Владивосток: Дальнаука, 1999.
Тимчишина Г.Н. Перспективы использования ТИНГОЛа-1 и ТИНГОЛа-2 (из кукумарии) в качестве лечебно-профилактических добавок // Мат-лы междунар. сим-поз. "Сознание и здоровье". — Владивосток, 1999. — С. 89-92.
Тутельян В.А. Стратегия разработки, применения и оценки эффективности биологически активных добавок к пище // Вопр. питания. — 1996. — № 6. — С. 3-11.
Федоров В.Г., Плесконос А.К. Планирование и реализация экспериментов в пищевой промышленности. — М.: Пищ. пром-сть, 1980. — 180 с.
Conde J.E. Ahres les bebes phoq ues les concombres de mer // Ecoloqie. — 1997. — Vol. 304. — P. 60-64.
Elyakov G.B., Stonik V.A., Levina E.V. Marine Tetcacyclic Isoprenoids: Structure and B iosynthesis // Pure and Appl. Chem. — 1990. — Vol. 62, № 7. — P. 1259-1262.
Ohshima T. Recovery and use of nutraceutical products from marine sources // Food Technology. — 1998. — Vol. 52, № 6. — P. 50-54.
Поступила в редакцию 3.06.03 г.
