Пептидная регуляция репаративных процессов в органах иммунной системы при ускоренном старении Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 613.98, 612.67/68, 612.017.1.

ПЕПТИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В ОРГАНАХ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ УСКОРЕННОМ СТАРЕНИИ

Проведено исследование влияния пептида Т-38 на процессы пострадиационного восстановления ключевых органов иммунной системы — тимуса и селезенки крыс в модели ускоренного старения. Показано, что иммуногеро-протекторный эффект пептида Т-38 выражался в восстановлении структуры сосудистого русла иммунных органов и усилении пролиферативной активности клеток тимуса и селезенки.

Ключевые слова: тимус, селезенка, ускоренное старение, пролиферация, пептиды.

В.Х. Хавинсон, Н.С. Линькова И.М. Кветной, В.О. Полякова А.В. Трофимов, Н.Н. Севостьянова Р.И. Абдулрагимов

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и Геронтологии,

СЗО РАМН

e-mail: [email protected]

Основной задачей современной иммунобиогеронтологии является изучение ме-ханимзов старения важнейших органов иммунной системы — тимуса и селезенки, а так же поиск путей коррекции возрастной инволюции указанных органов [5]. Известно, что старение тимуса начинается с момента полового созревания, а в пожилом и старческом возрасте его функциональная активность резко снижается [1]. Возрастная атрофия тимуса приводит к снижению иммунологической активности селезенки, что проявляется в снижении Т-хелперной активности [2]. Многолетний опыт применения коротких пептидов в терапии стресс-индуцированных иммунодефицитов, преждевременного старения и возрастной патологии показал, что пептидергическая регуляция гомеостаза организма может являться одним из перспективных направлений практической геронтологии и гериатрии [3-4, 6-7]. В связи с этим представляется важным исследование репаративной способности тимуса и селезенки в модели ускоренного старения под действием пептидов.

Материалы и методы исследования Исследования выполнены на 20 самцах крыс линии Вистар в возрасте 2,5 месяцев с массой тела 140-150 г. Животные были разделены на 4 группы: 1 группа — контроль, 2 группа — у-облучение, 3 группа — у-облучение с последующим введением контрольного пептида Т-34 (Н-С!и-Аэр-С!у-ОН, хонлутен) в дозе 20 нг/ мл и 4 группа — у-облучение с последующим введением опытного пептида Т-38 (Н-Ьуз-С!и-Азр-ОН, везуген) в дозе 20 нг/ мл.

Общее однократное облучение животных 2, 3 и 4 групп в дозе 7 Гр. выполнено на кобальтовом аппарате ЛУЧ при мощности 32 сГр/мин.

В качестве опытного пептида был выбран Т-38, поскольку он оказывает влияние на сосудистую систему, которая наиболее подвержена радиационному старению. В качестве контрольного (сравнительного) пептида был выбран Т-34, имеющий сродство к дыхательной системе и не влияющий на сосудистый компонент. Исследуемые пептиды вводили животным внутрибрюшинно через 2 часа после облучения по 0,5 мкг в течение 5 дней. Крысам 1 группы по той же схеме вводили физраствор. Выделение тимуса и селезенки проведено под нембуталовым наркозом в дозе 50 мг/кг на 7 сутки после облучения.

Кусочки тимуса и селезенки объемом 1 см3 фиксировали и обезвоживали, а затем заключали в парафин. Срезы толщиной 3-5 мкм помещали на предметные стекла и окрашивали гематоксилином и эозином.

Изучение пролиферативной активности тканей тимуса и селезенки крыс методом иммуногистохимии проводили с применением мышиных моноклональных антител к маркеру пролиферации клеток PCNA (1:50, Оако) согласно стандартному протоколу.

Морфометрическую оценку данных выполняли на микроскопе Olimpus CX41 с цифровой камерой Nikon Coolpix 4500 с помощью системы анализа микроскопических изображений Analysis 5.0. Индекс пролиферации PCNA рассчитывали в процентах как отношение количественной плотности иммуноокрашеных ядер к количественной плотности ядер клеток, окрашенных гематоксилином. Статистическая обработка результатов выполнялась в программе Statistica 6,0.

Результаты исследования В 1 группе (контроль): внешний вид и внутренние органы животных соответствовали норме. Весовой диапазон для селезенки составил 570-870 мг, для тимуса — 400-550 мг.

Тимус. На гистологических срезах тимус интактных крыс имел дольчатое строение. В дольках отчетливо различалось более темное, расположенное снаружи корковое вещество и более светлое центрально расположенное мозговое вещество (рис. 1А). Основная популяция пролиферирующих клеток в тимусе интактных животных по индексу PCNA составила 23,6 ± 1,4% (рис. 3) и располагалась в слое коркового вещества с тенденцией концентрироваться в периферической зоне долек.

Селезенка. У крыс контрольной группы гистологический рисунок селезенки соответствовал вариантам нормы (рис. 2А). Соединительно-тканная капсула органа была относительно тонкой и содержала многочисленные коллагеновые волокна.

Белая пульпа была представлена совокупностью лимфоидных периартериаль-ных муфт и фолликулов округлой формы. В центрах размножения фолликулов выявлялись делящиеся клетки и отдельные лимфоциты, погибающие путем апоптоза. Красная пульпа состояла из тяжей и венозных синусов, заполненных форменными элементами крови. В субкапсулярной зоне красной пульпы и вдоль трабекул располагались небольшие очаги экстрамедуллярного кроветворения.

На препаратах, иммуноокрашенных на PCNA, пролиферирующие клетки были сконцентрированы, в основном, в центрах размножения лимфоидных фолликулов и зонах гемопоэза, где индекс пролиферативной активности составил 35,4±1,0% (рис. 4).

У облученнъх животнъх (2 группа) внутренние органы были умеренно анемичны, мезентериальные лимфоузлы имели темный цвет. Тимус и селезенка были уменьшены в размерах. Масса селезенки варьировала от 220 до 400 мг, тимуса — от 90 до 140 мг.

Тимус. На гистологических срезах размеры долек были значительно уменьшены. Деление на корковое и мозговое вещество стиралось, а в некоторых дольках исчезала граница между слоями (рис. 1Б). Похожие инволютивные изменения выявляются и при естественном старении тимуса у лиц старше 60 лет. Клеточность коркового вещества снижалась, однако пролиферативная активность тимоцитов по индексу PCNA возрастала по сравнению с контролем (рис. 3), что свидетельствует о пострадиационном восстановлении ткани тимуса.

В мозговом веществе деструктивные изменения были менее выражены. Соотношение между паренхимой и стромой нарушалось в сторону увеличения последней. Отмечался отек сосудов соединительно-тканных перегородок. Строма была набухшая, отечная, с жировой инфильтрацией по периферии долек.

Селезенка. После облучения в ткани селезенки отмечалось сокращение белой пульпы и атрофия периартериальных муфт. На месте лимфоидных фолликулов были видны центральные артерии, окруженные узким ободком перифолликулярной ретикулярной ткани, в которой можно было обнаружить единичные скопления распадающихся лимфоцитов, плазматических и ретикулярных клеток (рис. 2Б). Стенки кровеносных сосудов белой пульпы и соединительно-тканных трабекул были отечными и частично гомогенизированными за счет плазматического пропитывания. Периферические синусы в селезенке переполнялись кровью, а строма в субкапсулярной зоне была практически оголена. Клеточность в субкапсулярной зоне снижалась более чем в 2 раза, однако по периферии селезенки пролиферативная активность клеток по PCNA возрастала до 58,3±3,0% (рис. 4).

Рис. 1. Корковое и мозговое вещество долек тимуса, окрашивание гематоксилином и эозином, х 120: А — 1 группа (контроль), Б —2 группа (облучение), В — 4 группа (облучение + пептид Т-38)

А Б В

Рис. 2. Лимфатический фолликул селезенки, окрашивание гематоксилином и эозином, х480: А — 1 группа (контроль), Б —2 группа (облучение), В — 4 группа (облучение + пептид Т-38)

г

и

Рм

и

■л

и

Ч

60

50

40

30

20

10

0

*

1

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

Рис. 3. Пролиферативная активность в корковой зоне тимуса по индексу Р0ЫА:

* — р < 0.05 по сравнению с 1 группой (контроль), 2 группой (облучение) и 3 группой (облучение + пептид Т-34).

70

г

У 60 Рм

I 50

40

30

20

10

0

* —ш—

|-Е-| X

I

1 1 1

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

Рис. 4. Пролиферативная активность в субкапсулярной зоне селезенки по индексу Р0ЫА:

* — р < 0.05 по сравнению с 1 группой (контроль) и 3 группой (облучение + пептид Т-34)

У облученных животных на фоне введения пептида Т-34 (3 группа)

в тимусе и селезенке отмечались деструктивные изменения, характерные для тех, которые были описаны во 2 группе. Однако, индекс пролиферативной активности в тканях обоих исследуемых иммунных органов снижался по сравнению со 2 группой (рис. 3, 4). Полученные данные свидетельствуют, что контрольный пептид Т-34, не обладающий тканеспецифичностью к иммунным клеткам и сосудистой системе, не оказывает репаративного эффекта в модели ускоренного старения тимуса и селезенки.

У облученных животных на фоне введения пептида Т-38 (4 группа) ткани тимуса и селезенки не имели признаков анемии, характерных для животных 2 и 3 групп.

Тимус. Пострадиационное введение пептида Т-38 способствовало восстановлению дифференциации долек тимуса на корковое и мозговое вещество (рис. 1В). По периферии коркового вещества наряду с увеличением клеточности появлялись крупные лимфобласты. В мозговом веществе были видны скопления крупных клеток, формирующих эпителиальную сеть. Кровеносные капилляры были сужены, без выраженных признаков периваскулярного отека.

Р0ЫА+ клетки верифицировались по всей площади коркового вещества. Индекс пролиферативной активности возрастал почти на 50% относительно контроля и был выше, чем в других исследуемых группах (рис. 3).

Селезенка. Под действием пептида Т-38 после облучения в селезенке определялось относительное увеличение содержания белой пульпы и появление крупных ге-мопоэтических островков. В лимфатических фолликулах и парафолликулярной зоне повышалось содержание крупных лимфобластов, многие из которых находились в состоянии митотического деления, что косвенно предполагает активацию процессов ре-паративной регенерации в селезенке (рис. 2В). Группы Р0ЫА+ клеток были верифицированы по всей паренхиме селезенки, причем в зонах гемопоэза они формировали обширные скопления. Индекс Р0ЫА имел тенденцию к повышению по сравнению с группой облученных животных и достоверно возрастал по сравнению с контролем (рис. 4).

Заключение. Облучение вызывает ряд патологических процессов в тимусе и селезенке, которые на уровне органов выражаются в снижении их массы, а на уровне тканей проявляются в деструкции сосудистого русла, отеке, снижении клеточности иммунных органов. Все перечисленные изменения на органном и тканевом уровнях сходны с проявлениями естественной инволюции иммунной системы при старении.

Эффекты пептидов в модели ускоренного старения определяются их тканеспе-цифичностью. Так, пептид Т-34, тропный к тканям дыхательной системы, не влиял на состояние облученных тканей, а в некоторых случаях даже способствовал замедлению их восстановления. Однако под действием пептида Т-38, эффекты которого направлены на сосудистое русло, наблюдалась репарация тканей тимуса и селезенки и усиление пролиферативной активности иммунных клеток в них, при этом патология сосудистого русла, индуцированная облучением, полностью отсутствовала.

Полученные данные показали, что пептид Т-38, воздействуя на сосудистый компонент, восстанавливает структуру и функциональную активность органов иммунной системы при их ускоренном старении, что позволяет рекомендовать его в качестве геропротекторного средства при развитии иммунодефицитных состояний.

1. Кветной, И.М. Нейроиммуноэндокринные механизмы регуляции пролиферативной активности тимоцитов в постнатальном онтогенезе / И.М. Кветной и др. // Мед. акад. журнал. — 2004. - Т. 47. - № 4. - С. 52-58.

2. Полякова В.О. Тимус и старение / В.О. Полякова и др. // Успехи геронтол. - 2001. -Вып. 8. - С. 50-57.

3. Хавинсон, В.Х. Пептидная регуляция старения/ В.Х. Хавинсон. - СПб.: Наука, 2009. - 50 с.

4. Хавинсон, В.Х. Пептидная регуляция старения: 35-летний опыт исследований / В.Х.Хавинсон, В.Н. Анисимов // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2009. - Т. 148. - № 7. - С. 108-113.

5. Хавинсон, В.Х. Пептидная регуляция иммунобиологических механизмов старения / В.Х. Хавинсон, В.В. Малинин / / Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9. - № 4. - С. 443-444.

6. Хавинсон, В.Х. Пептиды эпифиза и тимуса в регуляции старения/ В.Х. Хавинсон, В.Г. Морозов. - СПб.: Фолиант, 2001. - 160 с.

7. Anisimov, V.N. Peptide bioregulation of aging: results and prospects / V.N. Anisimov, V.Kh. Khavinson // Biogerontology. - 2010. - Vol. 11. - P. 139-149.

PEPTIDE REGULATION OF REPARATIVE PROCESSES IN IMMUNE SYSTEM'S ORGANS

AT ACCELERATED AGEING

Литература

V. Kh. Khavinson, N. S. Linkova I.M. Kvetnoy, V.O. Polyakova A.V. Trofimov, N.N. Sevostianova R.I. Abdulragimov

Effect of peptide T-38 has been studied in model of accelerated ageing of the main immune organs - thymus and spleen. Immu-nogeroprotective effect of peptide T-38 was connected with reparation of bloodstream in thymus and spleen and increase proliferative activity immune cells.

Institute of bioregulation and gerontology,

Russian Academy of Medical Sciences

peptides.

Key words: thymus, spleen, accelerated ageing, proliferation,

Saint-Petersburg

e-mail: [email protected]