CC BY
29
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2004 Биология Вып. 2
УДК 612.017.1.018
ИЗМЕНЕНИЕ ЧИСЛА ЛИМФОЦИТОВ, МАССЫ И КЛЕТОЧНОСТИ ОРГАНОВ ЛИМФОМИЕЛОИДНОГО КОМПЛЕКСА ПРИ ОСТРОМ СТРЕССЕ И БЛОКАДЕ Р-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ
Ю. И. Шилов111, Е. Г. Орлова*
а Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15 ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13
Установлено, что изменение числа лимфоцитов периферической крови при общем адаптационном синдроме носит двухфазный характер. Наряду с ранней лимфопенией, наблюдающейся в течение первых 24 ч после стрессорного воздействия, выявлено развитие лимфоцитоза, регистрируемого через 168 ч. Блокада Р-адренорецепторов нивелировала развитие ранней лимфопении, приводила к увеличению числа лимфоцитов только через 24 и 48 ч. Показано участие (3-адренергических механизмов в увеличении клеточности костного мозга и снижении массы тимуса в поздние сроки общего адаптационного синдрома.
Лимфопения, уменьшение массы лимфоидных органов и гипертрофия надпочечников под действием глюкокортикоидов являются классическими проявлениями общего адаптационного синдрома (Горизонтов и др., 1983; Бе1уе, 1937; МсЕ\уеп е1 а1., 1997). Однако эти изменения регистрируются преимущественно в ранний период - в первые 24-48 ч от начала стрессорного воздействия - и совпадают по времени со стадией тревоги. Динамика изменений числа лимфоцитов и клеточности органов лимфомиелоидного комплекса в более поздние сроки общего адаптационного синдрома, в частности в стадию повышенной резистентности по классификации Н. 8е1уе, практически не изучена. В условиях экспериментальной механической травмы выявлено развитие гиперплазии тимуса и увеличение числа Т-лимфоцитов в селезенке на 5-е, 15-е и 30-е сут (Черешнев и др., 1997). Не до конца ясны и механизмы регуляции изменения массы и клеточности органов лимфомиелоидного комплекса при стрессе. В частности, установлено, что адре-налэктомия и гипофизэктомия у крыс не устраняет миграции Т-лимфоцитов из лимфоидных органов в костный мозг, следовательно, этот процесс не контролируется кортикостероидами (Горизонтов и др., 1983). Напротив, блокада р-адренорецепторов полностью отменяет миграцию Т-лимфоцитов в костный мозг (Зимин, 1979; 1980; 1983; Горизонтов и др., 1983) и модулирует процесс синтеза интерлейкина-3 клетками костного мозга (Хлусов и др., 1993). Поскольку авторами ранее было показано, что действие глюкокортикоидов опосредова-
но модуляцией экспрессии Р-адренорецепторов на клетках-мишенях, представлялось целесообразным исследовать участие адренергических механизмов в изменениях числа лимфоцитов крови, массы и клеточности органов лимфомиелоидного комплекса при стрессе.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на крысах-самцах популяции Wistar массой 169,8±6,05 г. Животные 1-й группы (12 крыс) были подвергнуты острому 6-часовому иммобилизационному стрессу в сочетании с дозированной кровопотерей (по 0,5 мл крови из сосудов хвоста до начала иммобилизации и спустя 30 мин, 1, 3, 6 ч, 1, 3, 5, 7 и 12 сут). Крысы 2-й группы (10 животных) подвергались аналогичному воздействию в условиях блокады Р-адренергических рецепторов пропранололом гидрохлоридом по ранее описанной схеме (Горизонтов и др., 1983). Пропранолола гидрохлорид (обзидан, производство GERMED, Германия) вводили подкожно двукратно в разовой дозе 5 мг/кг массы тела с интервалом 3 ч; первая инъекция - за 30 мин до начала иммобилизации. В каждом образце крови определяли показатели лейкоформу-лы общепринятыми методами. Для характеристики выраженности кровопотери оценивали изменения числа эритроцитов и концентрации гемоглобина ге-миглобинцианидным методом. Выраженность стрессорного воздействия определялась по изменению уровня глюкозы крови стандартным глюкозок-сидазным методом. Животных 1-й и 2-й опытных
© Ю.И. Шилов, Е.Г. Орлова, 2004
групп забивали на 7-е или 12-е сут эксперимента (по половине в каждой группе) методом декапитации под эфирным наркозом. Массу и клеточность лимфоидных органов (тимус, селезенка, костный мозг одной бедренной кости, всех паховых лимфатических узлов) оценивали общепринятыми методами после приготовления клеточных суспензий. Рассчитывали относительную массу органов в пересчете на 100 г массы тела. Определяли массу тела животных и надпочечников. В качестве контроля при оценке изменений массы и клеточности органов использовали 3-ю группу интактных животных (8 крыс). Контролем для всех исследований крови служили показатели объединенного исходного фона.
Статистическую достоверность различий оценивали с помощью непарного /-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Использованная в работе модель стресса является комбинацией действия двух этиологических факторов: 6-часовой иммобилизации в пластиковых клетках в положении животных на спине, что создает условия для развития эмоционального стресса и чрезмерного мышечного напряжения, и дозированной кровопотери. Поскольку подобное сочетание этиологических факторов использовано г/л 250 |
200
150
100
50
К Р 0,5
3 6 24
72 120168 288 час.
Рис. 1. Изменение концентрации гемоглобина при комбинации 6-часовой иммобилизации с дозированной кровопотерей (1-я группа) и при тех же стрессорных воздействиях на фоне блокады р-адренорецепторов (2-я группа).
По оси ординат: концентрация гемоглобина в крови (г/л). Здесь и на рис. 2-5 по оси абсцисс: К - показатели контроля (объединенный исходный фон); Р -черёз 30 мин после введения пропранолола; 0.5, 1, 3, 6, 24,. 48, 72, 120, 168, 288 - время от начала иммобилизации (часы). * - р<0,05 по непарному /-критерию Стьюдента к объединенному исходному фону. Здесь и на рис. 2 светлые столбики - 1-я группа животных, темные столбики - 2-я группа
впервые, представлялось необходимым охарактеризовать изменения гематологических параметров и выраженность стрессорных изменений. Установлено, что в результате кровопотери развивается умеренная постгемморагическая анемия (рис. 1, 2). Выявлено снижение количества эритроцитов и концентрации гемоглобина (начиная с 60-й мин; /КО,05). Наименьшее значение числа эритроцитов отмечено в 1 -й группе на 2-е сут, во 2-й группе - на 1-е сут. К 12-м сут указанные показатели восстанавливаются и практически не отличаются от исходных. Блокада Р-адренореце'пторов существенно не влияет на динамику параметров красной крови. Различия между 1-й и 2-й группами недостоверны. Поэтому развитие умеренной постгеморрагиче-ской анемии можно рассматривать лишь как фактор, усиливающий стрессорное воздействие иммобилизации, но не определяющий различия других показателей в разных группах.
8
ч
*
Г
* і *
К Р0,5 1 3 6 24 48 72 120168288 час.
Рис. 2. Изменение количества эритроцитов при 6-ча-совой иммобилизации с дрзированной кровопотерей (1-я группа) и при тех же стрессорных воздействиях на фоне блокады Р-адренорецепторов (2-я группа).
По оси ординат - число эритроцитов (х 106) в 1 мкл крови
Стресс вызывает мобилизацию энергетических ресурсов организма, регистрируемую по изменению концентрации глюкозы (рис. 3). Через 6 и 24 ч от начала иммобилизации наблюдается развитие стрессорной гипергликемии с последующим снижением концентрации глюкозы ниже фоновых значений на 3-й и 7-е сут эксперимента. Блокада р-адренорецепторов полностью отменяет развитие гипергликемии, а через 30 мин и 1 ч после первой инъекции р-адреноблокатора отмечается выраженная гипогликемия.
Как видно из рис. 4, параллельно выявляется изменение числа лимфоцитов в крови. Абсолютная лимфопения в 1-й группе отмечается уже к 30-й мин. Через 24 ч число лимфоцитов не отличается
от такового в контроле, а в последующем развивается абсолютный лимфоцитоз, максимум которого приходится на 7-е сут. На 12-е сут эксперимента число лимфоцитов возвращается к исходному уровню. При введении p-адреноблокатора абсолютная лимфопения возникает только через 3 ч, а через 24 ч наблюдается абсолютный лимфоцитоз, сохраняющийся только в течение 48 ч. Обращает на себя внимание то, что динамика общего числа лейкоцитов у крыс преимущественно зависит от изменений количества лимфоцитов, которые у этих животных составляют 70,0±1,8% всех лейкоцитов крови (объединенный исходный фон). Подобные видовые особенности отмечены и другими авторами (McEwen et al., 1997). Через 6 и 24 ч в увеличение общего числа лейкоцитов вносит свой вклад и развитие нешрофильного лейкоцитоза (Shilov, Orlova, 2003).
Рис. 3. Изменение концентрации глюкозы при 6-часовой иммобилизации с дозированной кро-вопотерей (1-я группа - сплошная линия) и при тех же стрессорных воздействиях на фоне блокады Р-адренорецепторов (2-я группа - пунктирная линия).
По оси ординат - концентрация глюкозы, ммоль/л. а - р<0.05 по непарному /-критерию Стьюдента между 1-й и 2-й группами
Установлено, что у животных 1-й группы данная модель стресса приводит к снижению абсолютной и относительной массы тимуса на 12-е сут эксперимента, тогда как на 7-е сут изменения этих показателей недостоверны (рис. 5). Блокада Р-адренорецепторов у животных 2-й группы в условиях стресса предотвращает снижение массы тимуса, при этом показатели относительной массы тимуса становятся
достоверно выше, чем у животных в 1-й группе (р<0,05). Таким образом, Р-адренергические механизмы, по-видимому, принимают участие в снижении массы тимуса при стрессе. Высказанное предположение согласуется с данными литературы: предварительная блокада Р-адренорецепторов про-пранололом препятствует увеличению числа Т-лим-фоцитов в костном мозге (Зимин, 1979; 1983). Однако введение а-адреноблокатора дигидроэрготоксина не отменяет вызванных адреналином изменений в костном мозге и тимусе на фоне стресса (Горизонтов и др., 1983).
Наряду с инволюцией тимуса характерным проявлением реакции организма на стресс является развитие гиперплазии костного мозга. Как видно из рис. 5, использованная модель стресса приводит к выраженной гиперплазии костного мозга
Рис. 4. Изменение абсолютного числа лейкоцитов (1) и абсолютного числа лимфоцитов (2) при 6-часовой иммобилизации с дозированной кровопоте-рей (1-я группа - сплошная линия) и при тех же стрессорных воздействиях на фоне блокады Р-адренорецепторов (2-я группа - пунктирная линия). По оси ординат: число клеток в 1 мкл крови; а -р<0,05 по непарному /-критерию Стьюдента между 1-й и 2-й группами
на 12-е сут эксперимента. Подобные изменения наблюдали и в более ранние сроки в условиях 9-или 10-часового иммобилизационного стресса без кровопотери (Гольдберг и др., 1991; Сафонова и др., 2001). Их механизм связан с миграцией в костный мозг Т-лимфоцитов, которые повышают продукцию за счет элементов микроокружения костного мозга интерлейкина-1 (на 1-е и 4-е сут стресса), фактора некроза опухолей (со 2-х по 6-е сут), интерлейкина-3 (на 1-5-е сут) и колониести-
120
400 *Ю *
300
200
100
К 712712 К 712712 К 712712
I
It
III
К 7 12 Г 12 К 7 12 7 12
IV V
Рис. 5. Изменение показателей массы и клеточности органов лимфомиелоидного комплекса, массы надпочечников при 6-часовой иммобилизации с дозированной кровопотерей (1-я группа) и при тех же стрессорных воздействиях на фоне блокады Р-адренорецепторов (2-я группа).
1 - масса тимуса, мг; II - относительная масса тимуса, мг/100 г массы тела; III - масса надпочечников, мг; IV -паховые лимфатические узлы, число ядросодержащих клеток; V - костный мозг, число ядросодержащих клеток костного мозга бедренной кости; светлые столбики - первая группа (стресс), темные столбики - вторая группа (стресс + блокада Р-адренорецепторов). По оси абсцисс: К - контрольная группа; 7 - 7-е сутки эксперимента; 12 - 12-е сутки эксперимента. По оси ординат: 1-Ш - масса, мг; 1У-У - число ядросодержащих клеток. # - р<0,05 по непарному /-критерию Стьюдента по отношению к интактным животным
ние сроки стресса, в течение 24-48 ч от начала воз-
мулирующую активность прилипающих и неприлипающих клеток костного мозга соответственно на 4-е, 6-е и 2-е, 5-е сут стресса (Хлусов и др., 1993). По данным этих же авторов, адреналин стимулирует выработку интерлейкина-1 и 3 клетками костного мозга. Как видно из рис. 5, блокада Р-адренорецепторов пропранололом у животных 2-й группы предотвращает увеличение клеточности костного мозга на фоне стресса, регистрируемого в данном эксперименте в поздний период. По-видимому, участие катехоламинов в регуляции клеточности костного мозга при стрессе опосредовано стимуляцией p-адренорецепторов, что, возможно, усиливает миграцию Т-лимфоцитов в костный мозг. Напротив, взаимодействие катехоламинов с а-адренорецепторами, по данным литературы (Stevenson et al., 2001), усиливает апоптоз лимфоцитов в лимфоидных органах независимо от действия глюкокортикоидов.
По нашим данным, масса и число ядросодержащих клеток в селезенке, клеточность лимфатических узлов и масса надпочечников в указанные сроки эксперимента у животных 1-й группы статистически не отличаются от этих показателей у контрольных животных. Выраженные изменения массы и клеточности периферических лимфоидных органов в данной экспериментальной модели не зарегистрированы. По-видимому, это объясняется тем, что учет этих показателей проводили в поздние сроки стресса. Большинство исследователей регистрировали уменьшение массы тимуса и селезенки и гипертрофию надпочечников лишь в ран-
действия, что совпадает по времени со стадией тревоги (Зимин, 1980; Горизонтов и др., 1983; 8е-1уе, 1937). Изменение клеточности этих органов в поздние сроки стресса ранее были изучены недостаточно. Как видно из рис. 5, блокада Р-адренорецепторов пропранололом у животных 2-й группы усиливает уменьшение числа ядросодержащих клеток лимфатических узлов на 7-е сут и способствует увеличению массы надпочечников на 12-е сут эксперимента.
Таким образом, результаты исследований подтверждают участие адренергических механизмов в регуляции изменений числа лимфоцитов, массы и клеточности органов лимфомиелоидного комплекса при стрессе.
Выводы
1. Установлено, что изменения числа лимфоцитов периферической крови при общем адаптационном синдроме носят двухфазный характер. Наряду с ранней лимфопенией, регистрируемой в течение первых часов от начала стрессорного воздействия, выявлено развитие лимфоцитоза с максимумом через 168 ч.
2. Показано, что блокада Р-адренорецепторов нивелирует развитие ранней лимфопении, приводит к увеличению числа лимфоцитов только через 24 и 48 ч.
3. Выявлено участие Р-адренергических меха-нимов в увеличении клеточности костного мозга и
снижении массы тимуса в поздние сроки общего адаптационного синдрома. Блокада Р-адреноре-цепторов усиливает опустошение лимфатических узлов и способствует развитию гипертрофии надпочечников в поздние сроки стресса.
Библиографический список
Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М. И.
Стресс и система крови. М.: Медицина, 1983. Гольдберг Е.Д., Дыгай Л.М., Жданов В.В., Хлусов И.А. Динамическая теория регуляции кроветворения // II Российский конгресс по патофизиологии: Тез. докл. (9-12 октября 2000 г.). М., 2000. С. 90.
Зимин Ю.И. Иммунитет и стресс // Итоги науки и техн. ВИНИТИ. Сер. Иммунология. Т. 8. М., 1979. С. 173-198.
Зимин Ю.И. Иммунокомпетентные клетки при стрессе (экспериментальное и клиническое исследование): Дис... д-ра мед. наук. М., 1980. Зимин Ю.И. Стресс: иммунологические аспекты // Итоги науки и техн. ВИНИТИ. Сер. Иммунология. Т. 12. М., 1983. С. 41-62.
Сафонова Г.М., Шилов Ю.И., Перевозчиков А.Б. Протективные эффекты растительных полифе-нольных соединений на иммунную систему при остром стрессе // Докл. АН. 2001. Т. 378, № 5. С. 697-699.
Хлусов И.А., Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д. Адренергическая регуляция продукции интерлейкинов клетками костного мозга в условиях иммобили-зационного стресса // Бюл. эксперим, биол. и мед. 1993. Т. 116, № 12. С. 570-572.
Череигнев В.А., Кеворков Н.Н., Шмагель К.В., Яри-лин А.А. Иммунология комбинированных радиационных поражений. Екатеринбург, 1997.
McEwen B.S., Biron С.А., Brunson K.W., Bulloch К., Chambers W.H., Dhabhar F.S., Goldfarb R.H., Kitson R.P., Miller A.H., Spencer R.L., Weiss J.M. The role of adrenocorticoids as modulators of immune function in health and disease: neural, endocrine and immune interactions // Brain Res. Reviews. 1997. Vol. 23. P. 79-133.
Selye H. Studies on adaptation // Endocrinology. 1937. Vol. 21, №2. P. 169-188.
Shilov Ju.L, Orlova E.G. Role of adrenergic mechanisms in regulation of phagocytic cell functions in acute stress response // Immunol. Lett. 2003. Vol. 86, №3. P. 229-233.
Stevenson J.R., Westermann J., Liebmann P.M., Hort-ner М., Rinner I., Felsner P., Wolfler A., Schauen-stein K. Prolonged a-adrenergic stimulation causes changes in leukocyte distribution and lymphocyte apoptosis in the rat // J. Neuroimmunol. 2001. Vol. 120, № 1-2. P. 50-57.
Changes in lymphocyte number, weight and cellularity of organs of lymphomyeloid complex under acute stress and P-adrenoreceptor blockade
Yu. I. Shilov, E.G. Orlova
It has been established that changes in lymphocyte number in peripheral blood at general adaptation reaction have biphasic character. With early lymphopenia observed within the first 24 h after stress, lymphocytosis devel-opmentis, registered over 168 h. P-adrenoreceptor blockade reduced the development of early lymphopenia and increased lymphocyte number in 24 and 48 h. Participation of P-adrenergic mechanisms in increase of a bone marrow cellularity and in decrease of thymus weight at the latest stage of the general adaptation reaction has been shown.
