CC BY
29
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
образование биологически активных пептидов, важных для межклеточных взаимодействий и инициации иммунных реакций. Полноразмерные белки и полипептиды средней длины проникают в протеолитическую камеру протеасом с помощью активаторов РА700 и РА28 соответственно. Разнообразие функций протеасом обусловлено уникальным сочетанием протеолитических субъединиц и активаторов в их структуре. В этой связи большой интерес представляет изучение множественных форм протеасом печени, играющей роль первичного лимфоидного органа в эмбриональный период, обладающей клетками врожденного иммунитета и в то же время обеспечивающей развитие толерантности к пищевым и другим чужеродным антигенам.
Цель и задачи. Изучение изменений в пуле протеасом печени крыс в раннем онтогенезе и развитии толерантности к трансплантату. Исследование экспрессии иммунных субъединиц LMP7 и LMP2 и активаторов РА700 и РА28 протеасом печени крыс в раннем развитии, а также у половозрелых животных с прижившимся и отторгнутым трансплантатом ткани эндокринных желез соответственно после индукции донор-специфической толерантности (ДСТ) и в ее отсутствие.
Материалы и методы. Протеасомы печени в раннем онтогенезе изучались на крысах Вистар. ДСТ индуцировали у крыс Август введением в портальную вену печени спленоцитов донора — крыс Вистар. Аллотран-сплантацию ткани яичников или щитовидной железы проводили под капсулу почки. Экспрессию иммунных субъединиц и активаторов протеасом в экстрактах печени оценивали методом Вестерн-блоттинга. Экспрессию иммунных субъединиц протеасом в клетках печени исследовали методами иммуногистохимии и проточной цитометрии.
Результаты. Обнаружен волнообразный характер экспрессии иммунных субъединиц LMP7 и LMP2 в раннем развитии печени. Иммунные субъединицы выявляются в печени крысы, начиная с 16-х эмбриональных суток (Э16). На Э18 их число удваивается и существенно снижается через несколько дней после рождения, что связано с присутствием Т- и В-лимфоцитов, обогащенных иммунными протеасомами, в печени в этот период и последующей миграцией их во вторичные лимфоидные органы. К 21-м постнатальным суткам уровень иммунных протеасом в печени снова возрастает за счет повышения их экспрессии в гепатоцитах, что сопровождается увеличением количества молекул МНС класса I. Очевидно, в этот период гепатоциты приобретают способность образовывать антигенные эпитопы для молекул МНС класса I с помощью иммунных протеасом и «показывать» свою дефектность клеткам иммунной системы в случае инфицирования или синтеза мутантных белков. Кроме того, в раннем онтогенезе крыс и у взрослых животных в печени выявляются обогащенные иммунными протеасомами АПК — клетки Купфера и эндотелиаль-ные клетки синусоидов, которые обеспечивают развитие толерантности. В экспериментах по трансплантации ткани эндокринных желез показано, что у животных с индукцией ДСТ и прижившимися трансплантатами значительно увеличивается число мононуклеарных клеток печени, экспрессирующих субъединицу LMP2, но не LMP7, по сравнению с контрольными группами животных. Обнаружено уменьшение уровня активатора РА700 и увеличение уровня активатора РА28 в печени крыс с прижившимся трансплантатом после индукции
ДСТ по сравнению с таковыми у контрольных крыс и у животных с отторгнутым трансплантатом.
Заключение. Полученные результаты указывают на то, что иммунные функции печени в раннем онтогенезе и у взрослых животных связаны с иммунными протеасомами, содержащими субъединицы LMP2 и LMP7. Развитие толерантности к трансплантату, очевидно, обеспечивается АПК печени, экспрессирующими иммунные протеасомы с субъединицей LMP2 и активатором РА28. Этот тип иммунных протеасом может служить новым маркером приживления трансплантатов.
Работа поддержана РФФИ (гранты № 15-04-03494-а и № 16-34-60083-мол_а_дк).
ВЛИЯНИЕ КАТЕХОЛАМИНОВ НА ПРОДУКЦИЮ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 ß НЕЙТРОФИЛАМИ IN VITRO
Швыдченко И.Н.1, Гурьянова С.В.1, 2, Тамбовцева А.А.1, Сергеев С.В.1, Гронская А.С.1
1 Кубанский государственный университет физической культуры, спорта и туризма, Краснодар, Россия
2 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
Нейтрофилы играют важную роль в реакциях острой фазы воспаления и обеспечивают противоинфекционную защиту организма. Кроме того, благодаря своей способности секретировать широкий спектр хемокинов и цитоки-нов при активации, нейтрофилы вовлечены в регуляцию врожденного и адаптивного иммунного ответа. В настоящее время существуют данные о способности нейтрофи-лов секретировать цитокины при различных условиях, не связанных с патологией, в частности под воздействием физического стресса, однако механизмы этой секреции недостаточно исследованы, несмотря на то, что физические нагрузки являются повседневным фактором в жизни каждого человека. Катехоламины адреналин и нора-дреналин, высвобождаясь при физическом стрессе, могут регулировать иммунный и воспалительный ответ, модулировать цитокиновую сеть (Bergmann and Sauther, 2002). Эти эффекты во многом зависят от типа стимулируемого адренорецептора и их локализации. Адренорецепторы были обнаружены на всех иммунных клетках, в том числе и на нейтрофилах (Scanzano and Cosentino, 2015).
Целью настоящей работы было исследование им-муномодулирующего влияния катехоламинов адреналина и норадреналина, а также селективного агониста ß-адренорецепторов изопротеренола на продукцию нейтрофилами интерлейкина 1ß (IL-1ß) in vitro. В исследовании приняли участие 20 здоровых добровольцев обоего пола (средний возраст 19,4±0,26 лет). Все участники были полностью информированы о целях исследования и подписали добровольное информированное согласие на участие в нем. Нейтрофилы выделяли на градиенте плотности (1,077) с последующим осаждением эритроцитов декстраном и осмотическим лизисом. Проводили автоматический подсчет выделенных клеток с одновременной оценкой их жизнеспособности (не менее 90-98%) методом эксклюзии трипанового синего. Нейтрофилы ресуспендировали в среде RPMI 1640 с L-глутамином и 25 мМ HEPES с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина; инкубировали при 37 °С в 5% СО2 20 часов в концентрации 1 х 106 клеток/мл/лунку
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
в стерильных культуральных 12-луночных планшетах с добавлением 100 мкл Дюльбекко фосфатно-солевого раствора (DPBS) — спонтанная секреция, или 100 мкл различных индукторов: адреналина ((-) —Epinephrine) в конечной концентрации 0,01, 0,1 и 1 мкМ; норадре-налина ((-) —Norepinephrine) в конечной концентрации 0,001, 0,1 и 1мкМ; изопротеренола ((plus-minus) — Isoproterenol Hydrochloride) — 0,1 мкМ; селективного антагониста Р-адренорецепторов пропранолола (DL-Propranolol) — 1 мкМ, формил пептида (fMLP) — 10 мкМ. Все вещества получены из SIGMA-ALDRICH (Германия). При использовании нескольких веществ их вносили через 30 мин инкубации в следующей последовательности: fMLP-антагонист-агонист. Через 20 ч инкубации клетки осаждали центрифугированием, супернатант отбирали и замораживали (-20 °С) до проведения исследования. Концентрацию IL-ф в супер-натанте определяли методом ИФА с использованием коммерческих тест-наборов, согласно инструкции производителя (ООО «Цитокин», Россия). Чувствительность метода составляла для IL-ф — 6,25 пг/мл. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 7 (StatSoftlnc., США). Центральные тенденции и дисперсии количественных признаков описывали медианой и интерквартильным интервалом (Qj-Q3). Сравнение групп по количественным признакам проводили с использованием непараметрического W-критерия Вилкоксона для выборок парных измерений. Наблюдаемые различия считались не случайными при P < 0,05. Установлено, что адреналин в дозе 0,1 мкМ в 2 раза стимулирует секрецию IL-1 в нейтрофи-лами здоровых доноров (34,10; 19,75-61,60 пг/мл/106кл. в сравнении с 15,1; 6,3-24,65 пг/мл/106кл. при спонтанной секреции, P = 0,012). Норадреналин и изопротере-нол не оказывают статистически значимого влияния. Выявлены тенденции к усилению продукции IL-ф ней-трофилами при совместном действии адреналина в дозе 1 мкМ и хемотаксического пептида fMLP (Р = 0,0679). Этот эффект лишь частично отменяется селективным антагонистом в-адренорецепторов пропранололом, что, наряду с отсутствием влияния изопротеренола, может свидетельствовать о в-адренонезависимом стимулирующем действии адреналина на секрецию IL-1 в нейтрофилами.
Работа поддержана РФФИ и Министерством образования и науки Краснодарского края, проект № 16-44-230391р_а.
ПОЛИМОРФИЗМ МОЛЕКУЛЫ Н2-А КЛАССА II ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ ОПРЕДЕЛЯЕТ ПРОТЕКТИВНЫЙ ОТВЕТ ХОЗЯИНА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
Шепелькова Г.С., Майоров К.Б., Логунова Н.Н., Апт А.С.
ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Туберкулез (ТБ) — одна из самых распространенных и опасных инфекционных болезней в мире. Показано, что чувствительность к ТБ контролируется многими полиморфными генами. Как профессиональные антиген презентирующие клетки макрофаги экспрессируют на своей мембране молекулы класса II МНС. Ассоци-
ация чувствительности к ТБ с полиморфизмом MHC показана как у мыши, так и у человека. Ранее в нашей лаборатории был идентифицирован один из генов, контролирующий восприимчивость к ТБ — ген H2-Ab1, кодирующий бета-цепь классической молекулы МНС Класса II. Рекомбинантные линии мышей, выведенные в нашей лаборатории и различающиеся только по аллелям этого гена, проявляют различную чувствительность к инфекции. У мышей, несущих аллель от чувствительной родительской линии I/St (H2-Aj), развивается тяжелая патология легких с выраженным воспалением и продукцией большого количества воспалительных цитокинов, в отличие от резистентных к ТБ мышей несущих аллель Н2-АЬ. Однако роль полиморфизма Н2-А молекулы в развитии чувствительности/резистентности к ТБ до сих пор неясна. Неизвестно, зависит ли взаимодействие эффекторных Т лимфоцитов CD4 с инфицированными макрофагами от вариантов аллеля Н2-А.
Цель. Определение роли полиморфизма Н2-А в формировании протективного ответа хозяина при экспериментальной ТБ инфекции.
Материалы и методы. Макрофаги перитонеального экссудата полученные от линий мышей отличающихся по аллелям гена Н2-А: C57BL/6 (В6), несущие аллель Н2-АЬ, B6.I-9.3.19.8, несущие аллель H2-Aj и гибридов первого поколения F1(B6xB6.I-9.3.19.8) (F1), экспрессирующие оба аллеля гена Н2-А. Т-лимфоциты CD4 выделяли из суспензии спленоцитов мышей F1, инфицированных вирулентным штаммом M. tuberculosis, методом селекции в магнитном поле. Жизнеспособность микобактерий в смешенных культурах оценивали по избирательному включению последними 5,6-[3Н]-урацила. Поверхностный фенотип лимфоцитов определяли методом проточной цитофлуорометрии. Предрасположенность клеток к апоптозу смотрели по активности каспазы-3 и каспа-зы-7.
Результаты. Ранее в нашей лаборатории было показано, что активация бактериостатической функции макрофагов T-лимфоцитами CD4 зависит от молекулы МНС класса II. Для выявления роли Н2-А полиморфизма была использована модель активации инфицированных макрофагов с разными аллельными вариантами молекулы Н2-А иммунными Т-лимфоцитами CD4. Макрофаги перитонеального экссудата мышей линий В6, B6.I-9.3.19.8 и F1 культивировали в присутствии вирулентного штамма микобактерий с Т-лимфоцитами CD4 мышей F1. Через 72 часа культивирования клеток оценивали активацию макрофагов под действием Т-лимфоцитов по степени подавления роста микобак-терий в культурах, содержащих Т-лимфоциты, по сравнению с культурами не содержащими Т-лимфоциты. Т-лимфоциты CD4 усиливали способность В6 (H2-Ab) и F1(H2-AbAj) макрофагов ингибировать рост мико-бактерий и не влияли на бактериостатическую функцию макрофагов B6.I-9.3.19.8 (H2-Aj), то есть существует доминирование H2-Ab молекулы над молекулой H2-Aj при активации инфицированных макрофагов Т-клетками CD4.
Известно, что молекулы МНС класса II определяют не только презентацию антигенов при развитии адаптивного иммунного ответа, но и важны в селекции T-клеток CD4+. Определение количества Т-лимфоцитов в лимфо-идной ткани показало, что молекула H2-Aj плохо селектирует Т-клетки CD4+. Наличие единственной селектирующей молекулы класса II H2-Aj (линия 9.3.19.8) при-
