CC BY
27
можность связывания этого протеина с иммуноцитокина-ми и другими биологически активными пептидами в крови. Однако механизмы белок-белковых взаимодействий МГ и их биологическая роль требуют дальнейшего изучения.
Целью работы было изучение влияния специфических антител на способность МГ взаимодействовать с трипсином.
Препараты МГ из донорской плазмы крови выделяли повторной гель-фильтрацией, диализом и анионоб-менной хроматографией. Р-форму МГ получали обработкой препарата метиламином или добавлением трипсина. Кроликов массой 2-2.5 кг гипериммунизировали нативным МГ в дозе 8 мг с 1 мл адыованта Фрейнда с последующей реиммунизацией той же дозой без адыованта через 4 недели. Через 10 дней после второй иммунизации сыворотку крови исследовали в реакции НПГА с эритроцитами, нагруженными МГ. Титр специфических антител составлял от 1/16384 до 1/32768.
Из пулировапных сывороток кроликов выделяли иммуноглобулины класса О (Щ повторным осаждением сульфатом аммония и гель-фильтрацией на колонке с гелем ТБК-6(Ж Взаимодействие Б- и Р-форм МГ с полученными АТ изучали с помощью иммунохимической фотометрии при 450 нм. Реакции проводили при постоянной концентрации ^ и возрастающей концентрации МГ. Максимум преципитации отмечен при молярных соотношениях \%/МГ как 7 /1 (1000 / 32 мкг). Различий в преципитации двух форм МГ отмечено не было. Образующиеся комплексы легко осаждались центрифугированием, что сопровождалось осветлением раствора. Из литературных данных известно, что молекула МГ способна к связыванию двух молекул небольших ферментов, например, трипсина, но только одной молекулы плазмина. Этот феномен, подтвержденный и в нашей лаборатории, объясняют близостью расположения реактивных центров в молекуле МГ. В серии экспериментов изучали способность 1§ блокировать реактивные центры МГ. При постоянной концентрации МГ добавляли возрастающие количества ^ и через 30 мин. вносили в инкубационную смесь количество трипсина, достаточное для связывания препарата МГ. Свободный трипсин инактивировали добавлением ингибитора трипсина из бобов сои. Образование комплексов МГ -трипсин регистрировали по гидролизу И-бензоил-Ь-аргинин паранитроаншшда спектрофотометрически при 405 нм. При молярном соотношении МГ/1§, соответствующему максимуму преципитации, связывание МГ с трипсином уменьшалось не более чем на 10%. При дальнейшем увеличении концентрации I% связывание МГ с ферментом пропорционально умен ьшалось вплоть до 15% от исходного. В то же время, добавление 1§ к уже сформированным комплексам МГ-трипсин не влияло на гидролазную актив-I юсть этих комплексов.
Т. о., при иммунизации животных препаратом МГ синтезируются АТ как против реактивных центров МГ, так и против других участков его молекулы. Несмотря на значительные размеры оба реактивных центра МГ, по-видимому, способны к одновременному связыванию антител. Такое связывание приводит к существенному ослаблению антипротеиназной функции МГ.
Влияние кальмодулина и хорионического гонадотропина на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови человека
Заморина С.А., Шнршев С.В.
Институт экологии и генетики микроорганизмов
УрОРАН
Пермь, Россия
Хорионический гонадотропин (ХГ) как плацентарный гормон обладает выраженным иммуномодулирующим эффектом, что обусловлено необходимостью одновременного обеспечения процессов беременности и защиты полуаллогенного плода от атаки иммуно-компетентных клеток матери.
Механизм трансдукции гормонального действия ХГ на клетки-мишени сопряжен с повышением активности аденилатциклазы и, как следствие, последующим накоплением цАМФ, который модулирует активность внутриклеточных ферментных систем. Реализация цАМФ-зависимых эффектов гормона зависит также от уровня интрацеллюлярного Са2' и активности кальмодулина.
В связи с этим было интересно изучить влияние физиологических концентраций ХГ (10,50,100 МЕ/мл) на функциональную активность фагоцитов периферической крови и зависимость эффектов гормона от активности кальмодулина. В качестве ингибитора кальмодулина использовался циклоспорин А (“ЗапсИттип”, 8апс1о5, Щвейцария) в среднетерапевтической дозе 0,05 мг/мл. Для оценки функциональной фагоцитарной активности применялся тест, основанный на поглощении клетками формалинизироваи-ных эри троцитов барана. Результат выражался в виде процента, числа и индекса фагоцитоза. Параллельно проводилась оценка метаболической активности клеток в тесте с восстановлением нитросинего тетразолия (НСТ-тесте) и определялась продукция миелопероксилазы (МП).
Установлено, что гормон в концентрации, соответствующей его содержанию в крови беременных женщин во П-Ш триместре (ХГ 10 МЕ/мл), практически не влияет на фагоцитарную активность лейкоцитов. Более высокая концентрация гормона, (50 МЕ/мл), оказывает незначительный, но статистически значимый депрессивный эффект на процессы фагоцитоза. Концентрация ХГ 100 МЕ/ мл, соответствующая 8-10 неделе беременности, когда клетки плода экспрессируют антигены главного комплекса гистосовместимости, обладает наиболее выраженным супрессивным эффектом на функциональную активность общего пула фагоцитирующих клеток. Блокада кальмодулина в лейкоцитах приводит к статистически значимому угнетению процессов фагоцитоза.
Низкие дозы гормона (ХГ 10,50 МЕ/мл) на фоне блокады кальмодулина оказывают достоверный депрессивный эффект на процессы фагоцитоза, что характеризует ХГ как синергиста циклоспорина А. В то же время, комбинация высокой дозы гормона ( 100 МЕ/мл) и циклоспорина А не
оказывала депрессивного эффекта на функциональную активность фагоцитов. Таким образом, блокада кальмоду-лина полностью нивелирует угнетающий эффект ХГ (100 МЕ/мл) на лейкоциты периферической крови.
Таким образом, можно считать, что эффекты ХГ, реализуемые на уровне фагоцитов, в большой степеии зависят от концентрации интрацеллюлярного Саг', при этом различные дозы гормона запускают разные механизмы трансдукции гормонального сигнала. Не исключено, что депрессивный эффект высокой дозы ХГ (100 МЕ/мл) реализуется не только через ферментные системы, определяющие уровень кальция, но и, как показано нашими предыдущими исследованиями, тесно связан с активностью циклооксигеназы и уровнем внутриклеточного цАМФ — антагониста кальмодулина.
О влиянии нейтрофилокина на иммунную систему
Зурочка А.В., Колесникова А. А., Всшчегорский И. А., Цейлнкман В.Э., Долгушин И.И., Колесников ОЛ., АхкямовЭ.М.
Челябинская Государственная медицинская академия Челябинск, Россия
Стимулированные латексом нейтрофилы секретиру-ют биологически активные вещества, названные нейт-рофилокинами. Нейтрофилокины обладают широкой гаммой эффектов: они стимулируют заживление ран и консолидацию переломов, влияют на гемопоэз, обладают актопротекторным действием, индуцируют стресс, стимулируют перекисное окисление липидов и оказывают противоопухолевое действие. Нейтрофилокины также стимулируют иммунный ответ и повышают фагоцитарную активность макрофагов. До сих пор иммуно-тропные эффекты нейтрофилскинов были изучены лишь на мышах. Целью настоящей работы явилась оценка влияния нейтрофилокина на иммунную систему крыс.
В работе использованы крысы линии Вистар. Нейтро-филокин (НК) был выделен из 5-й фракции супернатанта стимулированных латексом нейтрофилов человека и является пептидсодержащим веществом. НК вводили крысам трижды подкожно в дозе 7 х 10'7 мг/крысу. Иммунизацию крыс и забор перитонеальных макрофагов осуществляли через 24 часа после завершения введения НК. Гуморальный иммунный ответ оценивали по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке животных, а клеточный — по интенсивности реакции повышенной чувствительности замедленного типа (ГТЧЗТ). Функциональную активность макрофагов оценивали по способности к фагоцитозу частиц латекса и НСТ-тесту. Достоверность различий с контрольной группой оценивали с помощью критериев Стьюдента (X) и Розенбаума (<3).
Трехкратное введение НК достоверно повышало гуморальный иммунный ответ: абсолютное число АОК в селезенке возросло с 18.21 ± 1.71 х 103 в контроле (п=14) до 27.50 ± 2.37 х 105 в группе, получавшей НК (п=14, Р < 0.05,0.
Параллельно увеличилось и относительное количество АОК (в расчете на миллион спленокариоцитов) с 68.39 ± 7.69 у контрольных крыс до 116.48 ± 22.85. Одновременное нарастание абсолютного и относительного числа АОК позволяет предположить, что НК способствует активации клеток, реагирующих на антигены эритроцитов. Введение НК вызывает также стимуляцию клеточного иммунного ответа. Об этом свидетельствует повышение интенсивности реакции ПЧЗТ на 33.14% по сравнению с контролем (Р < 0.05, t). В то же время, НК не оказал влияния на функциональную активность перитонеальных макрофагов. Так, активность фагоцитоза в контрольной в и опытной группах составила 38.49 ± 4.89% и 35.34 ± 4.38% соответственно. Результаты НСТ-тестау крыс, получавших НК, также не отличались от контрольных показателей.
Таким образом, НК стимулирует гуморальный и клеточный иммунный ответ у крыс. Это хорошо соответствует данным об иммуностимулирующем воздействии НК на мышей. В то же время, у мышей при введении НК возрастала фагоцитарная активность макрофагов, а у крыс этот эффект не наблюдался.
Изменение миграционной активности лейкоцитов крови и спектров метаболитов головного мозга крыс при развитии экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ)
Житнухин Ю.Л., Абдурасулова И.Н., Поздняков А.В.
НИИ экспериментальной медицины РАМН,
ЦНИрентгено-радиологическгш институт МЗРФ С.-Петербург
ЭАЭ, моделирующий рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания центральной нервной системы (ЦНС), индуцировали у крыс-самок Wistar подкожной инокуляцией гомогената гомологичного спинного мозга с полным адъювантом Фрейнда. Тяжесть заболевания оценивали по клиническому индексу (КИ) от 0 до 3. Исследовали миграционную активность лейкоцитовк-рови в стеклянных 5-канальных плоских капиллярах Пер-фильева-Габе. Основной белок миелина (ОБМ) был выделен из головного мозга мыши методом колоночной хроматографии. Головной мозг крыс с различными клиническими проявлениями ЭАЭ исследовали на аппарате Magnetom Vision фирмы Siemens для получения магнитно-резонансных спектров метаболитов. Неврологические симптомы ЭАЭ зарегистрированы у 58% животных. Продолжительность латентного периода ЭАЭ составила 12± 1,3 сут., периода заболевания 8,7±2,4 сут. Установлено снижение спонтанной миграционной активности лейкоцитов у заболевших животных в первые три недели наблюдения (индексы у больных издоровых крыс соответственно 9,3±0,9; 13,7± 1,2; р<0,05). Реакции торможения миграции лейкоцитов (PTMJI) при добавлении ОБМ отмечены у заболевших крыс на 7,14 и 21 сутки после иммуниза-
