CC BY
16
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-10-38-42
INFLUENCE OF THE IMMOBILIZATION ON STABILITY OF THE LYOPHILIZED BACTERIAL CULTURES
Neschislyaev V.A., Stolbova M.G., Kylosova I.A., Orlova E.V., Mokin P.A.
Perm state pharmaceutical academy, Perm, Russian Federation
ВЛИЯНИЕ ИММОБИЛИЗАЦИИ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР
Несчисляев В.А., Столбова М.Г., Кылосова И.А., Орлова Е.В., Мокин П.А.
ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России, г. Пермь, Российская Федерация
Аннотация. Иммобилизация клеток, входящих в состав пробиотических препаратов, направлена на достижение ряда биологических и технологических эффектов, повышающих качество и, соответственно, потребительские свойства выпускаемой продукции. Биологический эффект при применении различного рода сорбентов обусловлен повышением устойчивости пробиотика к действию бактерицидных факторов ЖКТ (желудочный сок, желчь). Позитивный технологический аспект иммобилизации связан с достижением более выраженной устойчивости клеток к физическим воздействиям: замораживанию, оттаиванию, высушиванию и другим манипуляциям с бактериальными культурами в ходе производственного процесса. Помимо указанных эффектов, при апробации новых сорбентов вызывает интерес их влияние на сохраняемость специфической активности иммобилизованных культур в процессе хранения препаратов, что имеет большую практическую значимость для определения и регламентации срока годности пробиотика. Апробированный в качестве носителя гомогенат ламинарии оказывает положительное воздействие на стабильность лиофи-лизированной культуры бифидобактерий. Ключевые слова: бифидобактерии, иммобилизация, лиофилизация, специфическая активность, стабильность при хранении. Abstract. The immobilization of the cages which are a part of pro-biotic medicines is directed to achievement of a number of the biological and technological effects increasing quality and, respectively, consumer properties of products. The biological effect at different application of sorbents is caused by increase in resistance of a probiotic to action of bactericidal factors of a GIT (gastric juice, bile). The positive technological aspect of an immobilization is connected with achievement of more expressed resistance of cages to physical impacts: to freezing, thawing, drying and other manipulations with bacterial cultures during production. Besides the specified effects, at approbation of new sorbents their influence on persistence of specific activity of the immobilized cultures in the course of storage of medicines attracts interest that has the big practical importance for definition and a regulation of an expiration date of a probiotic. Approved as the carrier гомогенат laminarias makes positive impact on stability of the lyophilized culture of bifidobacteria. Keywords: bifidobacteria, an immobilization, a lioflization, specific activity, stability at storage.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК [1] Ардатская М.Д. Дисбиоз (дисбактериоз) кишечника: современное состояние проблемы, комплексная диагностика и лечебная коррекция/ М.Д. Ардатская [и др.]// Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2015. N117(5). С. 13-50. [2] Несчисляев В.А. Пробиотики: микробиологическая и технологические аспекты получения, контроля и конструирования препаратов: Авторефе-рат...дис.д-ра.мед.наук. П.:2005. 44 с. REFERENCES [1] Ardatskaya M.D. Disbioz (dysbacteriosis) of intestines: current state of a problem, complex diagnostics and medical correction / M.D. Ardatskaya [etc.]//Experimental and clinical gastroenterology. 2015. N117(5). P. 13-50. [2] Neschislyaev V. A. Probiotics: microbiological and technological aspects of receiving, control and designing of medicines: Abstract ... yew. Drs. medical sciences. P.: 2005. 44 p.
[3] ОФС 1.7.2.0009.15 Определение специфической активности пробиотиков/ Государственная фармакопея РФ, изд. XIII/ Т.1,2 http://www.femb.ru/
[4] Пучнин В.С. Разработка и исследование лекарственных форм бифидумбактерина и бификола: Автореф...дис.канд.фарм.наук. М.:1988. 15 с.
[5] Столбова М.Г., Несчисляев В.А., Мокин П.А., Орлова Е.В., Маслов Ю.Н. Влияние иммобилизации на биологические свойства лактобактерий // Современные проблемы науки и образования. 2018. № 4. Режим доступа: http://www.science-educa-tion.ru/artide/view?id=27975.
[3] OFS 1.7.2.0009.15 Determination of specific activity of probiotics / State pharmacopeia of the Russian Federation, prod. XIII/T.1.2 http://www.femb.ru/
[4] Puchnin V.S. Development and research of dosage forms of a bifidumbakterin and bifikol: Avtoref ... yew. edging.pharm. sciences. M.: 1988. 15 p.
[5] Stolbova M.G., Neschislyaev V. A., Mokin P.A., Orlova E.V., Maslov Yu.N. Influence of an immobilization on biological properties of lactoba-cilli//Modern problems of science and education. 2018. №4. Access mode: http://www.science-edu-cation.ru/article/view?id=27975.
Contribution of authors. Neschislyaev V. A., Stolbova M.G. - the review of literature, writing of the text. Mokin P.A., Kylosova I.A. - statistical data processing. Neschislyaev V. A., Orlova E.V. - the concept and design of a research. Conflict of Interest Statement. The authors declare no conflict of interest.
Neschislyaev V. A. - SPIN-ID: 2469-6644; ORCID-ID: 0000-0002-8163-0674 Stolbova M.G. - SPIN-ID: 3664-3866; ORCID-ID: 0000-0001-6704-1884 Kylosova I.A. - SPIN-ID: 2546-0973; ORCID-ID: 0000-0002-8874-7445 Orlova E.V. - SPIN-ID: 8093-5260 Mokin P.A. - SPIN-ID: 9083-2415
Вклад авторов. Несчисляев В.А., Столбова М.Г. - обзор литературы, написание текста. Мокин П.А., Кыло-сова И.А. - статистическая обработка данных. Несчисляев В.А., Орлова Е.В. - концепция и дизайн исследования.
Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Несчисляев В.А. - SPIN-ID: 2469-6644; ORCID-ID: 0000-0002-8163-0674 Столбова М.Г. - SPIN-ID: 3664-3866; ORCID-ID: 0000-0001-6704-1884 Кылосова И.А. - SPIN-ID: 2546-0973; ORCID-ID: 0000-0002-8874-7445 Орлова Е.В. - SPIN-ID: 8093-5260 Мокин П.А. - SPIN-ID: 9083-2415
Введение. Углубление представлений о значимости микробиоты для жизнедеятельности макроорганизма и её роли в патогенезе заболеваний различной этиологии способствует более широкому использованию и совершенствованию препаратов пробиотического действия для коррекции дисбиотических состояний [1]. Эффективность пробиотикотерапии, особенно при применении бифидобактерий, в значительной степени зависит от сохранения жизнеспособности клеток при транзите через желудок. Традиционный подход к защите бактерий реализуется путем использования кислотоустойчивых вариантов лекарственных форм (таблетки, капсулы и др.) [4].
Идея иммобилизации бактериальных культур для повышения резистентности клеток к бактерицидному действию желудочного сока вызвала появление новой группы препаратов, позиционируемых как отдельное поколение пробиоти-ков [2]. Технологической особенностью таких препаратов является более выраженная
устойчивость к физическим воздействиям, в т.ч. лиофилизации. Совокупность положительных эффектов иммобилизации клеток на поверхности или в массе носителя способствовала апробации различного рода субстратов с широким диапазоном сорбционных свойств [5]. В данной работе рассматривается влияние гомогената ламинарии на сохранение жизнеспособности иммобилизованных бифидобактерий при хранении в постлио-филизационный период, соответствующий сроку годности бифидосодержащих пробиотиков.
Цель работы: изучение стабильности лиофили-зированной культуры бифидобактерий, иммобилизованных с помощью сорбента на основе гомо-гената ламинарии.
Материалы и методы. В работе использовали производственный пробиотический штамм Bifidobacterium bifidum 1, широко применяемый при получении бифидосодержащих лекарственных средств и БАД.
В качестве носителя для иммобилизации бактериальных культур был апробирован вариант сорбента, приготовленный из ламинарии гомогенизированной желированной (ООО «Технологии будущего», Россия). Рабочее водное разведение гомогената (концентрация 50%) после предварительной стерилизации смешивали с бактериальной взвесью в соотношении 1:2 соответственно при перемешивании в течение 30 мин. Полноту иммобилизации (процент связывания) оценивали по соотношению жизнеспособных клеток в надо-садочной жидкости и сорбированном осадке после инкубации в течение 5 сут. при температуре (5±3)оС.
При подготовке к лиофилизации жидкие бактериальные культуры разливали во флаконы ФИ-5 по 2,0 мл с добавлением защитной среды (25%) и без неё для изучения протективных свойств носителя. В качестве ксеропротектора применяли сахарозо-желатино-молочную среду (СЖМ), используемую в производстве бифидум-бактерина. Замораживание бактериальных культур проводили при температуре минус 50оС в течение 16 ч. Высушивание осуществляли в сублиматоре ТГ-50 в течение (50±5) ч до остаточной влажности клеточной биомассы не более 3%. После герметизации флаконы с лиофилизирован-ными препаратами для оценки стабильности были заложены на хранение при температуре (5±3)оС и подвергались периодическому контролю по совокупности биологическим и физических параметров. В качестве контрольных образцов применяли лиофилизаты исходных бактериальных взвесей без сорбентов.
Определение количества жизнеспособных клеток в препаратах проводили методом
последовательных десятикратных разведений с высевом последних на элективные питательные среды и подсчетом выросших колоний: на среде Блаурокка после 96 ч при температуре (38±1)оС
[3].
Активность кислотообразования определяли методом кислотно-основного титрования [3]. Образцы регидратированных бактериальных взвесей после 72 ч инкубации на среде Блаурокка при температуре (38±1)оС титровали 0,1М раствором натрия гидроксида до достижения рН уровня (8,5±0,1). Показатели титруемой кислотности, выражаемой в градусах Тернера (оТ), вычисляли по формуле:
Т = А*К*10, где Т - условная величина, определяемая количеством мл раствора натрия гидрок-сида, пошедшего на титрование 100 мл исследуемой взвеси; А - количество 0,1М раствора натрия гидроксида, пошедшего на титрование 10 мл исследуемой взвеси, мл; К - коэффициент поправки к титру 0,1М раствора натрия гидроксида; 10 -объем анализируемой пробы, мл.
Результаты и обсуждение. Сорбционная способность является весьма важным критерием при сравнительной оценке потенциальной пригодности носителей для иммобилизации клеток в производстве пробиотических препаратов. Гомоге-нат ламинарии в рабочем разведении (50%) продемонстрировал высокий уровень сорбционной активности в отношении бифидобактерий. Полнота иммобилизации бактериальной культуры составляла более 95%, что способствует высокой устойчивости клеток к физическим и химическим воздействиям (табл.1).
Таблица 1
Полнота связывания бифидобактерий, иммобилизованных на гомогенате ламинарии
Штамм Соотношение бактериальная взвесь/ сорбент КОЕ*/мл Количество связанных клеток, %
осадок иммобилизованных клеток надосадочная жидкость
B. bifidum 1 2/1 (1,65±0,25) х108 (0,38±0,14) х107 > 95%
без сорбента(контроль**) (2,65±0,46) х108 - -
Примечание: * колонииобразующие единицы; ** исходная бактериальная взвесь
Table 1
Completeness of binding of the bifidobacteria immobilized on a laminaria gomogenata
Strain Ratio bacterial suspension /sorbent KOE*/ml Quantity of the connected cages, %
deposit of the immobilized cages nadosadochny liquid
B. bifidum 1 2/1 (1,65±0,25)x108 (0,38±0,14)х107 > 95%
without sorbent (control **) (2,65±0,46)x108 - -
Note: * koloniiobrazuyushchy units; ** initial bacterial suspension
—-
Возможная вариабельность концентраций клеток в диапазоне 107-109 КОЕ/мл в производственных бактериальных культурах предполагает дополнительные исследования по выявлению до-зозависимых эффектов при оптимизации самого способа иммобилизации и апробации модификаций сорбента с учётом экономических аспектов данного технологического приёма.
После завершения процесса сублимационного высушивания иммобилизованных бактериальных культур при визуальном контроле было установлено, что полученные образцы по внешнему виду и структуре сухой биомассы не отличаются от коммерческого бифидумбактерина, выпускаемого в виде лиофилизата во флаконах. Результаты периодического контроля лиофилизатов представлены в табл. 2.
Таблица 2
Лиофилизированная биомасса бифидобактерий
Биомасса Выживаемость клеток, К0Е/млх107 Кислотообразование, "Т
Носитель Защитная среда исходная 6 мес. 12 мес. 18 мес. исходная 6 мес. 12 мес. 18 мес.
Ламинария СЖМ 6,50± 1,41 5,67±1 ,45 3,63± 0,85 2,83±0 ,73* 130,0 126,0 124,0 128,0
- 5,20± 0,58# 3,33±0 ,67* 2,30± 0,24* 1,15±0 ,35*# 136,1 118,0 120,0 120,0
Без носителя (контроль) СЖМ 7,86± 0,46 5,25±1 ,31 3,65± 1,46* 2,75±0 ,63* 141,2 138,0 126,0 125,0
- 7,25± 1,31 4,00±0 ,41* 1,28± 0,19*# 0,60±0 ,15*# 139,2 126,0 126,0 115,0
Примечание: * - p < 0,05 по сравнению с исходным значением; # -p < 0,05 по сравнению с контролем со средой СЖМ.
Table 2
The lyophilized biomass of bifidobacteria
Biomass Survival of cages, КОЕ/мл*Ш7 Kislotoobrazovaniye, "Т
Carrier Protective environment initial 6 months. 12 months. 18 months. initial 6 months. 12 months. 18 months.
Laminaria SZHM 6,50± 1,41 5,67± 1,45 3,63± 0,85 2,83± 0,73* 130,0 126,0 124,0 128,0
- 5,20± 0,58# 3,33± 0,67* 2,30± 0,24* 1,15± 0,35*# 136,1 118,0 120,0 120,0
Without carrier (control) SZHM 7,86± 0,46 5,25± 1,31 3,65± 1,46* 2,75± 0,63* 141,2 138,0 126,0 125,0
- 7,25± 1,31 4,00± 0,41* 1,28± 0,19*# 0,60± 0,15*# 139,2 126,0 126,0 115,0
Note: * - p <0.05 in comparison with a reference value; # -ment.
Во всех вариантах лиофилизатов бифидо-бактерий активность кислотообразования в пассажах регидратированных культур составляла высокий и близкий в количественном выражении уровень в диапазоне от 115 до 141,2 оТ на протяжении всего срока наблюдения, что соответствует требованиям (не менее 90оТ) к бифидосодержа-щим препаратам. При этом каких-либо существенных отличий от контроля в экспериментальных образцах обнаружено не было, что
- p <0.05 in comparison with control with the SZhMenviron-
свидетельствует об отсутствии негативного влияния иммобилизации на культуральные свойства бифидобактерий.
По сохранению жизнеспособности клеток лиофилизаты с сорбентом без защитной среды явно превосходили аналогичные контрольные образцы. К 12 мес. хранения наблюдалось 2,5-кратное снижение КОЕ в экспериментальных образцах и 5-кратное в контроле. К 18 мес. наблюдения в контроле количество КОЕ снизилось более чем
на порядок, а иммобилизованных бифидобактерий только в 3 раза. Использование защитных сред нивелирует эту тенденцию - различия между образцами были менее выражены: кратность снижения составляла соответственно 2,3 и 2,9 раза к 18 мес. наблюдения. Защитная среда «маскирует» выявленный стабилизирующий эффект носителя, связанный, вероятно, с пролонгацией жизненного потенциала частично поврежденных при лиофи-лизации клеток. Этот эффект позволяет уменьшить расход нативной бактериальной взвеси на 1 дозу препарата при сохранении необходимого остаточного количества жизнеспособных клеток к концу срока годности пробиотика. Следует отметить, что скорость естественной деградации специфической активности лиофилизатов является основным фактором, определяющим установление регламентированного срока годности пробиотика.
Положительные результаты апробации гомогената ламинарии на модели бифидобакте-рий определяют целесообразность сравнительного применения данного сорбента для иммобилизации бактериальных культур иной таксономической принадлежности, используемых в производстве пробиотиков.
Заключение. Использование гомогената ламинарии в качестве носителя для иммобилизации би-фидобактерий обеспечивает всю совокупность технологических эффектов, ожидаемых от применения сорбентов в производстве пробиотиков. Повышенная устойчивость иммобилизованных клеток к процессу лиофилизации дополняется более выраженным сохранением их жизнеспособности в сухих препаратах. Сорбенты на основе ламинарии представляются перспективными для использования в производстве бактерийных препаратов с пробиотическим действием.
Responsible for correspondence: Kylosova Inna Alexandrovna - the candidate of pharmaceutical Sciences, the associate professor of Chair of industrial technology of drugs with a biotechnology course, Perm state pharmaceutical Academy, Perm,
Russian Federation, e-mail: inna_kylosova@mail. ru
Ответственный за переписку: Кылосова Инна Александровна — кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии, Пермская государственная фармацевтическая академия, г. Пермь, Российская Федерация, е-mail: inna_kylosova@mail. ru
