CC BY
89
УДК 615.37
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-12-34-38
ACID RECEIVING AND ACID RESISTANCE OF PROBIOTICS
Neschislyaev1 V.A., Mokin1 P.A., Orlova1 E.V., Maslov2 Y.N., Savina1 A.S.
1 Perm state pharmaceutical academy, Perm, Russian Federation
2 Perm state medical university of the academician E.A. Wagner, Perm, Russian Federation
КИСЛОТООБРАЗОВАНИЕ И КИСЛОТОУСТОЙЧИВОСТЬ ПРОБИОТИКОВ
Несчисляев1 В.А., Мокин1 П.А., Орлова1 Е.В., Маслов2 Ю.Н., Савина1 А. С.
ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия», г. Пермь, Российская Федерация
2ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера» г. Пермь, Российская Федерация
Аннотация. Кислотообразование относится к показателям специфической активности пробиотиков на основе лакто- и бифидобактерий. Продуцируемые ими карбоновые кислоты играют существенную роль в становлении и функционировании кишечной микро-биоты макроорганизма. Кислотообразование является культуральным свойством, характеризующим биохимическую и в значительной степени определяющим антагонистическую активность клеток производственных штаммов. Способность бактерий образовывать и выделять во внешнюю среду органические кислоты влияет на их чувствительность к соляной кислоте. Установлено, что более выраженная активность кислото-образования повышает устойчивость пробиотической культуры к бактерицидному действию желудочного сока. Уровень устойчивости определяет технологические подходы к обеспечению защиты клеточных про-биотиков, в т. ч. специфику лекарственных форм.
Ключевые слова: пробиотики, кислотообразование, кислотоустойчивость, защита клеток, лекарственные формы.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Янковский Д.С., Дымент Г.С.. Бифидобактерии и лактобациллы как оптимальная основа современных пробиотиков// Современная педиатрия. -2006. - № 3(12). - С. 10
[2] Квасников Е.И., Нестеренко О.А.. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - Москва: изд. «Наука», 1975. - С.384.
[3] Янковский Д.С., Дымент Г.С., Потребчук Е.П. Получение пробиотически ценных штаммов бифидобактерий // Здоровье женщины. - 2009. - № 4 (2). - С. 216-222.
Abstract. Acid receiving treats indicators of specific activity of probiotics on a basis lakto-and bifidobacteria. The carbonic acids produced by them play an essential role in formation and functioning of an intestinal micro-biota of a macroorganism. Acid receiving is the cultural property characterizing biochemical and substantially defining antagonistic activity of cages of production strains. The ability of bacteria to form and emit organic acids to the external environment affects their sensitivity to hydrochloric acid. It is established that more expressed activity of a kislotoobrazovaniye increases resistance of pro-biotic culture to bactericidal effect of gastric juice. Level of stability defines technological approaches to ensuring protection of cellular probiotics, including specifics of dosage forms.
Keywords: probiotics, kislotoobrazovaniye,
kislotoustoychivost, protection ofcages, dosage forms.
REFERENCES
[1] Yankovsky D.S., Dyment G.S.. Bifidobacteria and lactobacilli as optimum basis of modern probiot-ics//Modem pediatrics. - 2006. - No. 3(12). - P. 10.
[2] Kvasnikov E.I., Nesterenko O.A.. Lactic bacteria and ways of their use. - Moscow: prod. "Science", 1975. - P. 384.
[3] Yankovsky D.S., Dyment G.S., Potrebchuk E.P. Receiving probioticheska of valuable strains of bifidobacteria//Health of the woman. - 2009. - No. 4 (2). - P. 216-222._
[4] Столбова М.Г. Влияние иммобилизации на устойчивость пробиотических организмов к биологическим жидкостям/ Столбова М.Г., Несчисляев В.А. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр. - Пятигорск, 2011. - Вып. 66. - С. 594-595.
[4] Stolbova M.G. Influence of an immobilization on stability of pro-biotic organisms to biological liquids / Stolbova M.G., Neschislyaev V.A. //Development, a research and marketing of new pharmaceutical products: sb.nauch.tr. - Pyatigorsk, 2011. - Issue 66. - P. 594-595.
Contribution of authors. Mokin P.A., Savina A.S. - the review of literature, writing of the text; Maslov Y.N., Orlova E. V., Neschislyaev V. A. - statistical data processing, collecting and processing of materials, concept and design of a research.
Conflict of Interest Statement. The authors declare no conflict of interest.
Neschislyaev V.A. -SPINID: 2469-6644; ORCIDID:0000-0002-8163-0674 Mokin P.A.-SPIN ID: 9083-2415; ORCID ID: 0000-0001-9801-2883 Orlova E.V. - SPIN ID:8093-5260 Maslov Y.N. - SPIN ID: 3728-5598
Вклад авторов. Мокин П.А., Савина А.С. — обзор литературы, сбор и обработка материалов, написание текста; Маслов Ю.Н., Орлова Е.В., Несчисляев В.А. - статистическая обработка данных, концепция и дизайн исследования.
Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Несчисляев В.А. - SPIN ID: 2469-6644; ORCID ID: 0000-0002-8163-0674 Мокин П.А. - SPIN ID: 9083-2415; ORCID ID: 0000-0001-9801-2883 Орлова Е.В. - SPIN ID: 8093-5260 Маслов Ю.Н. - SPIN ID: 3728-5598
Введение. Активность кислотообразования является важным биологическим параметром, относимым к специфической активности для ряда отечественных пробиотиков одинарного и поликомпонентного состава, включающего лакто- и/или би-фидобактерии. Молочная, уксусная и ряд других продуцируемых этими клетками органических кислот играют важную роль в физиологии макроорганизма, а также в формировании и функционировании микробиоты желудочно-кишечного тракта [1,2]. Уровень кислотообразования бактериальной культуры, относимой к разряду пробио-тической, характеризует её биохимическую активность и влияет на проявление антагонистических свойств в составе препаратов для коррекции дисбиотических состояний [1,2]. Помимо указанной взаимосвязи культуральных свойств, вызывает интерес выявление других биологических и технологических аспектов, сопряженных с активностью продуцирования карбоновых кислот известными производственными штаммами лакто-и бифидобактерий.
Цель работы: оценить сопоставимость интенсивности кислотообразования пробиотических препаратов с их устойчивостью к желудочному соку. Материалы и методы. В работе использовали моно- и поликомпонентные пробиотические препараты отечественного и зарубежного
производства, представленные на Российском фармацевтическом рынке: лактобактерин, бифи-думбактерин и бифилакт-БИЛС (лиофилизаты во флаконах, НПО «Микроген», Россиия), бифи-форм (капсулы, «Ферросан АС», Дания), линекс (капсулы, «Lek d.d.», Словения).
Активность кислотообразования определяли с помощью метода кислотно-основного титрования при культивировании пробиотиков в адекватной питательной среде. Лиофилизирован-ную биомассу из флаконов и капсул ресуспенди-ровали 0,9% раствором натрия хлорида и по 2,5 мл полученной суспензии вносили в 2 пробирки с 25 мл среды Блаурокка (для бифидосодержащих препаратов), МРС-1 или обезжиренного молока (для лактосодержащих препаратов). После 24-4872 ч инкубации посевов при температуре (37±2)оС проводили определение кислотности в каждой пробирке: пробу в объеме 10 мл титровали 0,1М раствором натрия гидроксида до pH (8,5±0,1). Показатель активности кислообразования, выражаемой в градусах Тернера (оТ), вычисляли по формуле:
Т = АхКх10, где
Т - условная величина, определяемая количеством мл раствора натрия гидроксида, пошедшего на титрование 100 мл исследуемой взвеси;
А - количество 0,1М раствора натрия гидроксида, пошедшего на титрование 10 мл исследуемой взвеси, мл;
К - коэффициент поправки к титру 0,1М раствора
натрия гидроксида;
10 - объем анализируемой пробы, мл.
Устойчивость бактерий к желудочному соку (кислотоустойчивость) определяли с использованием модельной среды - кислого раствора пепсина следующего состава: пепсин 3 г, кислота соляная концентрированная - 6 мл, вода очищенная - до 1 л. Образцы лиофилизированных препаратов ресуспендировали 0,9% раствором натрия хлорида и по 1 мл полученной суспензии добавляли к 9 мл модельной среды. После 0,5 ч инкубации при температуре (37±1)оС определяли количество жизнеспособных клеток, используя метод десятикратных разведений в соответствующих питательных средах с последующим учётом
Уровень и динамика кисл<
колоний после 48-72 ч инкубации при температуре (37±2)оС.
Результаты и обсуждение. Активность кислото-образования можно рассматривать в качестве интегрального параметра, влияющего на проявление ряда биологических и технологических свойств бактериальных культур, начиная с особенностей культивирования и заканчивая терапевтической эффективностью пробиотиков. Вполне обоснованно этот параметр используют в качестве показателя специфической активности отечественных лакто- и бифидосодержащих препаратов.
Результаты сравнительного исследования активности кислотообразования ряда отечественных и зарубежных пробиотиков различного состава, зарегистрированных в нашей стране в качестве лекарственных средств, представлены на табл.1.
Таблица 1
юбразования пробиотиков
Препарат Кислотообразование, оТ
Среда Блаурокка Среда МРС-1 Обезжиренное молоко
24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч
Бифилакт-БИЛС 108,33 ±2,40 122,33 ±2,40 139,33 ±3,38 230,33 ±0,67 272,00 ±2,08 272,33 ±3,33 213,33 ±0,67 251,67 ±0,67 294,67 ±5,17
Бифиформ 73,71 ±1,15 80,32 ±0,67 86,73 ±0,96 107,23 ±6,32 110,33 ±2,54 114,35 ±3,14 68,31 ±1,85 79,25 ±1,64 87,93 ±0,23
Линекс 56,25 ±2,12 68,17 ±1,73 77,53 ±1,08 98,62 ±2,24 104,28 ±3,17 110,51 ±1,14 76,64 ±1,12 106,28 ±3,17 114,11 ±1,18
Лактобактерин - - - 206,10 ±12,10 265,60 ±16,20 278,80 ±8,30 43,30 ±7,00 138,00 ±9,10 158,30 ±15,6
Бифидумбактерин 87,34 ±4,26 120,86 ±1,10 132,38 ±2,11 - - - - - -
Table 1
Level and dynamics of acid receiving of probiotics
Medicine Acid receiving, Т
Blaurokka growth medium MRS-1 growth medium Skim milk
24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h
Bifilakt-BILS 108,33 ±2,40 122,33± 2,40 139,33 ±3,38 230,33± 0,67 272,00± 2,08 272,33± 3,33 213,33± 0,67 251,67± 0,67 294,67 ±5,17
Bifiform 73,71 ±1,15 80,32 ±0,67 86,73 ±0,96 107,23± 6,32 110,33± 2,54 114,35± 3,14 68,31 ±1,85 79,25 ±1,64 87,93 ±0,23
Линекс 56,25 ±2,12 68,17 ±1,73 77,53 ±1,08 98,62 ±2,24 104,28± 3,17 110,51± 1,14 76,64 ±1,12 106,28± 3,17 114,11 ±1,18
Laktobakterin - - - 206,10± 12,10 265,60± 16,20 278,80± 8,30 43,30 ±7,00 138,00± 9,10 158,30 ±15,6
Bifidumbakterin 87,34 ±4,26 120,86± 1,10 132,38 ±2,11 - - - - - -
У монопрепаратов более высокая активность кислотообразования отмечена у лактобак-терина, он в 2 раза превосходит по этому показателю бифидумбактерин, а также значительно результаты зарубежных симбиотиков. При сравнении поликомпонентных препаратов выделяется результат бифилакта-БИЛС. Уровни кислотообразования лактобактерина и бифилакта-БИЛС не имеют достоверных отличий, так как в составе симбиотика присутствует штамм Lactobacterшm р1аПагит 8Р-А3, составляющий основу
Устойчивость пробиотиков к
монопробиотика. Симбиотики линекс и бифи-форм по активности кислотообразования сопоставимы с бифидумбактерином.
Следующий этап сравнительного изучения препаратов был связан с определением их чувствительности к желудочному соку, который является самым значимым бактерицидным фактором для пероральных пробиотиков. Результаты воздействия модельного желудочного сока на препараты при совместной экспозиции представлены в табл.2.
Таблица 2
одельному желудочному соку
Препарат Кислотообразование, Т
Исходное После 0,5 ч экспозиции в желудочном соке
Среда Блау-рокка Среда МРС-2 Обрат молока Среда Блау-рокка Среда МРС-2 Обрат молока
Бифилакт-БИЛС 107 108 107 102-3 105-6 102-3
Бифиформ 107 - - 102-3 - -
Линекс 107 107 - 101-2 102-3 -
Лактобактерин - 109 - - 105-6 -
Бифидумбактерин 107 - - 101-2 - -
Table 2
Model gastric juice resistance of probiotics
Medicine Acid receiving, Т
Initial After 0.5 h an exposition in gastric juice
Blaurokka growth medium MRS-2 growth medium Milk skim milk Blaurokka growth medium MRS-2 growth medium Milk skim milk
Bifilakt-BILS 107 108 107 102-3 105-6 102-3
Bifiform 107 - - 102-3 - -
Линекс 107 107 - 101-2 102-3 -
Laktobakterin - 109 - - 105-6 -
Bifidumbakterin 107 - - 101-2 - -
Ведущую абиотическую роль в составе желудочного сока выполняет соляная кислота. Полученные результаты свидетельствуют о высокой чувствительности пробиотических культур к кислому раствору пепсина. Экспозиция препаратов в модельном желудочном соке снижает выживаемость клеток во много раз: лактобактерий на 3-4 порядка, а бифидобактерий - на 5-6. Более выраженная зависимость устойчивости пробиотиче-ских культур к желудочному соку от уровня их кислотообразования отмечена у монопрепаратов.
Модельные условия экспозиции пробио-тиков в кислом растворе пепсина ориентированы на достижение максимального бактерицидного
эффекта. В организме человека проявление данного эффекта зависит от ряда факторов, включая возрастные особенности пищеварения. Наличие желудочного транзита влияет на применяемые лекарственные формы пероральных пробиотиков, обеспечивающие защиту жизнеспособных клеток. Сохранению выживаемости клеток способствуют ацидорезистентные покрытия таблеток и капсул, а также адсорбция бактериальных культур на носителях, обеспечивающих повышение их устойчивости к различным воздействиям. Приём незащищенных пробиотических культур возможен применительно к детям раннего
возраста, желудочный сок которых имеет более высокий уровень pH [3,4].
Заключение. Активность кислотообразования и кислотоустойчивость можно в определённой мере считать сопряженными свойствами пробиотиче-ских бактериальных культур. Высокая активность
кислотообразования лактобактерий не позволяет значительно нивелировать бактерицидный эффект желудочного сока. Клеточные пробиотиче-ские препараты, как правило, должны быть защищены при желудочном транзите.
Ответственный за переписку: Несчисляев Валерий Александрович — доктор фармацевтических наук, профессор кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии, ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия», г. Пермь, Российская Федерация, е-mail:
neschislayew@gmail. com
Corresponding Author: Neschislyaev Valery Aleksandrovich - doctor of pharmaceutical sciences, professor of department of industrial technology of drugs with a course of biotechnology, Perm state pharmaceutical academy, Perm, Russian Federation, e-mail: neschislayew@gmail.com
